专利名称：细菌内毒素的另一种新用途的制作方法
技术领域：
本发明公开了细菌内毒素的另一种新用途，即在制备治疗和预防神经退化性疾病药物中的应用，属于医药领域。
背景技术：
神经退化性疾病包括老年痴呆症、帕金森氏症、亨廷顿舞蹈症、肌萎缩侧索硬化症 (渐冻人症)等中老年性疾病，近年来，随着神经退化性疾病发病率的逐年上升，且越来越年轻化，受到了全世界专家和学者的关注，并成为世界医学界的一大难题。流行病学调查发现，目前在65岁以上老年人群中，老年性神经变性疾病已成为继心脑血管病、肿瘤、糖尿病之后最常见的罹患病种之一，并且相比其他三大类疾病日益有效防治措施的出现，老年性神经变性疾病以其防治措施的相对薄弱，正以“后来居上”之势成为21世纪导致人类死亡的最主要病种之一。神经退化性疾病多与遗传背景有关，也有散发者，是神经元变性 Neurodegeneration为主要病理改变的一大类疾病，临床可表现为神经功能逐渐地进行性地丧失。因其最常见受累人群为老年人，故又称“老年性神经变性疾病”。老年性神经变性疾病的病变解剖部位复杂，可涉及大脑、小脑、脑干和脊髓等；病理特点主要表现为某个或某些部位的进行性神经元的变性和坏死，伴有胞质内结构紊乱，或大多在神经细胞内存在蛋白质异常聚集出现包涵体等，但无炎症或异常物质的沉积。神经系统机能一个或几个选择性受累，其它系统不被侵犯，震颤性麻痹，纹状体黑质细胞变性和缺失，表现为帕金森氏症。如果累及大脑皮质神经元的病变，表现为痴呆。 如果累及基底核锥体外运动神经元，引起小脑共济失调症。如果累及脊髓前角运动神经元减少，伴胶质细胞增生，表现为“渐冻人症”。老年痴呆的脑反应性抗体比对照组高20%，说明自身抗体可能对神经元的消失起作用；黑质神经元自身抗体的存在可能参与了帕金森症的发病；存在于渐冻人症患者血清中的L型电压依赖性钙通道抗体可与该通道蛋白结合，改变其电生理特性，造成神经元损伤。说明神经退化性疾病是一类自身免疫性疾病，类似于红斑狼疮、类风湿、甲亢等自身免疫性疾病一样。“渐冻人症”患者可能误食了产河豚毒素的细菌，逐步积聚毒素在运动神经元细胞膜钠通道上，造成运动神经传导障碍，肌肉逐渐无力以至瘫痪，以及说话、吞咽和呼吸功能减退，直至呼吸衰竭而死亡。由于河豚毒素不能通过血脑屏障，所以大脑神智清楚敏锐，患者清晰地见证自己的死亡过程。“渐冻人”症患者虽然饮水呛咳，经常感觉嗓子里面有痰却咳不出，是因为河豚毒素解除了呼吸道痉挛。由于误食产河豚毒素细菌和诱导细菌产生毒素需要一定的时期和条件，所以一般中年后起病，多数患者为50 70岁，平均发病年龄为55岁，40岁以下发病也有报告， 20 30岁发病约占5%。概因男性有较多机会地接触河豚毒素细菌疫区，以及男性的卫生习惯问题，导致以男性多见，男女之比约为1.5 1 2 1。河豚毒素对人体的毒性是一致的，无选择区别，家族性发病皆因他们有相似的生活环境和生活习惯。因河豚毒素结合在神经元细胞膜的钠通道上，激活人体的免疫反应去对抗运动神经元，造成运动神经元的死亡。“渐冻人”患者病理显微观察可见脊髓前角运动神经元细胞减少，伴胶质细胞增生，残存的前角细胞萎缩，大脑皮质的分层结构完整，锥体细胞减少伴胶质细胞增生。脊髓锥体束有脱髓鞘现象而运动皮质神经元细胞完好，表明最初的改变产生于神经轴突的远端逐渐向上逆行累及大脑中央前回的锥体细胞此种改变又称为逆行性死亡。河豚毒素导致神经元死亡的免疫反应，结果就会产生出许多抗神经元的自身抗体，这些自身抗体与正常的神经元细胞结合，从而影响其神经传导功能，并且这种结合会导致神经元的凋亡，如此往复，累及其它神经元细胞。“渐冻人”患者脑脊液和血清中抗神经元抗体的增加，就是与自身免疫有关。人体细胞在致病产物的作用下并非总是被动的，它们积极主动的调动宿主抗御死亡的机制来对抗致病产物的攻击，降低并缓解致病产物对宿主的损害程度。神经元包涵体就是神经退化性疾病发病所致的继发性产物，这种蛋白聚集体抗御神经元死亡，但导致神经元功能异常。内毒素是革兰氏阴性细菌细胞壁的组成成份，其化学本质为脂多糖(LPS)，为细菌死亡或活跃繁殖时所释放。内毒素由结构和功能不同的四部分组成0-特异侧链、外核心、 内核心和类脂A。类脂A是LPS的生物学活性组份，人工合成的类脂A具有LPS的所有生物学活性，因此，细胞对类脂A的识别必是LPS诱导细胞反应的起始步骤。不同革兰氏阴性细菌来源的类脂A的化学结构高度保守，对其组成已了解得比较清楚。内毒素是人体巨噬细胞最敏感的激活剂，脂多糖(LPS)通过与膜受体⑶14作用将信号从胞外传到胞核而刺激多种细胞合成和释放生物活性物质而表现复杂的生物学活性， 但其详细机制尚未完全清楚。细菌脂多糖(LPS)既是致病因子，各种细菌的内毒素的毒性大致相同，可引起发热、微循环障碍、内毒素休克及弥漫性血管内凝血等。又可对机体发挥有益的生物学活性， 引起强烈的免疫病理学效应，在免疫应答的正负调节及其体外应答和临床应用上有重要意义。目前比较清楚的由LPS刺激产生的细胞因子有TFNs、ILs、CSFs, TNFs和TGFs (转化生长因子类)，它们介导了脂多糖(或类脂A)的生物学效应。不少学者正在寻找低毒或无毒内毒素衍生物用于感染和肿瘤治疗。
发明内容
本发明的目的是提供一种细菌内毒素的新用途，作为一种生物反应调节剂，用于制备治疗和预防神经退化性疾病药物中的应用。本发明所述细菌内毒素主要为革兰氏阴性菌的细胞壁脂多糖成分，含有内毒素的菌体也在本发明之列。内毒素高效调节人体的生理机能，维持机体的内环境稳定，促进人体的自愈能力。内毒素是人体巨噬细胞最敏感的激活剂，是人体免疫系统高效刺激剂和生物调理素(opsonin)，激活巨噬细胞等单核吞噬细胞的吞噬功能(清道夫功能)，吞噬消灭神经元致病因子和已被毒害的神经元细胞，消除神经元自身抗体和包涵体等病理结构，逐步恢复神经元的功能，从而达到治疗和预防神经退化性疾病的目的。本发明所述药物为治疗和预防神经退化性疾病的药物，本发明所述神经退化性疾病包括“渐冻人症”、老年痴呆症、帕金森氏症、亨廷顿舞蹈症等疾病。此类疾病的诱发因素各不相同，但病理上都是在致病因子的作用下，出现了神经元凋亡的现象，均有中枢神经不同部位及不同程度的神经元丢失和功能异常，都与自身免疫疾病有关。自身抗体与正常的神经元细胞结合，从而影响其神经传导功能，并且这种结合会导致神经元的凋亡，如此往复，累及其它神经元细胞。人体细胞在致病产物的作用下并非总是被动的，它们积极主动的调动宿主抗御死亡的机制来对抗致病产物的攻击，降低并缓解致病产物对宿主的损害程度。神经元包涵体就是神经退化性疾病发病所致的继发性产物，这种蛋白聚集体抗御神经元死亡，但导致神经元功能异常。所以免疫刺激修复疗法治疗神经退化性疾病，可以达到一定的治疗效果。本发明所述细菌内毒素制备的药物可以制成水针、粉针等注射液形式，需要的时候，在上述药物中加入多种药学上可接受的辅料。本发明制备的药物应用于神经退化性疾病的治疗，均表现出一定的治疗和预防效果。但是，已缺失的神经元部分其功能暂时无法恢复。一般情况下，只要五六天就能见效果， 康复程度视病情和个人体质而定。临床治疗显示，百分百的神经退化性疾病病情都有一定程度地缓解，且控制大多数病情不再加重。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明进一步说明本发明的创意源于铜绿假单胞菌注射液的临床应用。铜绿假单胞菌注射液临床用于治疗肿瘤和免疫系统性疾病，本发明人发现其功能成分为内毒素，从1998年开始，将铜绿假单胞菌注射液进一步扩大临床应用，用于治疗中风、结石、痛风等疾病，后来应用于神经退化性疾病的治疗，同样显示出治疗效果。实施例1.细菌内毒素药物的制备。细菌内毒素对人体组织的选择性不强，不同革兰氏阴性细菌的内毒素引起的病理变化和临床症状大致相同致死性、热原性、弥漫性血管内凝血等。为了缓冲了细菌内毒素的毒性，又增强内毒素等的免疫活性，含脂多糖的菌体注射液为细菌内毒素药物的最佳选择。细菌内毒素药物的制备方法如下
1.菌种革兰氏阴性细菌，包括假单胞菌、霍乱弧菌、大肠杆菌、伤寒杆菌、变形杆菌等，主要以假单胞菌为主；
2.扩大培养将检定好了的菌种接种于试管或三角瓶普通营养肉汤中，置于37°C培养 18小时左右，经纯粹检验合格后即可使用。根据需要量，可采用发酵罐或玻璃瓶进一步扩大培养，取样作纯粹检验，合格者使用；若有杂菌污染，则菌液要废弃；
3.收集菌泥对上述扩大培养的合格培养物，离心收集菌体。并用生理盐水洗涤菌体三次，离心收集菌泥，冷冻保存备用；
4.1.将菌泥经酶消化提取制得细菌脂多糖。制成每毫升含细菌脂多糖0. 5毫克的浓
度；
4. 2.将菌泥稀释成约每毫升50亿菌体的浓度，按0. 5-1. 0%的比例加入甲醛(按 100%)，封口并混合均勻后置37°C保温杀菌24—48小时。然后做无菌检验，离心清洗甲醛， 用生理盐水配成约每毫升20亿菌体的液体；5.将上述4.1.，4.2.制备好了液体，无菌操作分别分装于安瓶中，贴标做好记录，置于 2—8 °C低温存放；
6.安全检验选择健康且未经感染过的小白鼠，按使用剂量三倍的剂量注射3—5只， 观察10天，均应健活；
7.效力检验选择健康且未经感染过的小白鼠，按正常使用剂量注射三次后，测定小白鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞的吞噬指数。与对照组作比较测定；
8.物理性状检查经上述检验合格后，还需逐瓶进行物理性状检查等等。以上工艺操作和药品质量检测必须符合GMP的规程和要求。实施例2.细菌内毒素制备的药物临床治疗神经退化性疾病。本发明以含内毒素的铜绿假单胞菌(I^eudomonas Aeruginosa)菌体注射液作临床应用，药物的组方20亿死菌体/ml，NaCl 0. 9%,苯甲醇0. 6%，pH7. 2磷酸盐缓冲液。药物为深圳某生物制品厂生产，使用的产品批号为980308，20030502, 20031005, 20040701。 本发明申请人于2006年至2007年在河北张药集团试制了几批样品，批号为20071205也用于临床试验。以自愿为原则，历时十载，相关病例数十例，初步统计显示治疗显效率达 100%，缓解康复程度达3—7成，且控制病情进一步恶化。本发明人使用内毒素药物负责刺激免疫系统，激活巨噬细胞等单核吞噬细胞的吞噬功能，刺激多种细胞合成和释放TNF- α、IL- 1和IL_6等生物活性物质，吞噬消灭神经元致病因子和已被毒害的神经元细胞，消除神经元自身抗体和包涵体等病理结构，逐步恢复神经元的功能。为了促使加快上述免疫反应彻底地进行，本发明人创新，要求患者注射内毒素药物后饮食腥膻发物，结果起到了事半功倍的效果，缩短了治疗时间，提高了治疗效果。 此项创新应用，百用百灵。“发物”激发已经静止的疾病成为活性疾病的一类食物，其功能成分是凝集素。单独使用凝集素，往往会加重新病，引发旧疾，临床上常常要求“忌口”，就是这个道理。凝集素是一种丝裂原(mitogen)，可以和细胞表面的特异糖链专一结合，引起细菌病毒的活化和增殖，也能引起高百分比的T、B淋巴细胞发生有丝分裂，激活大量的T、B细胞克隆，但这种细胞克隆并不涉及凝集素本身抗原的特异性。“发物”凝集素与内毒素协同增效内毒素是主攻手——激活免疫系统，凝集素担当助攻手——负责增强免疫反应。内毒素药物的临床应用试验
例1. “渐冻人症”患者程，女，30岁，1998年5月开始犯病，手指无力，多处肌肉萎缩，出现了语言障碍，曾在湖南湘雅医院和北京协和医院求诊，无果。多次检测结果显示脑脊液白细胞升高，细菌病毒培养阴性；血压40—60毫米汞柱。2001年1月，本发明人采用铜绿假单胞菌菌体内毒素注射液进行治疗，第四天，患者就感觉几个手指有些松动灵活一些了， 治疗一个月后患者各项体质康复程度达六成多。当时本发明人还未搞清“渐冻人症”病因是什么，尽管已经好转了，但是没有清除肠道产毒细菌，这样的治疗效果也只维持了一段时间，到2001年7月患者又发病了，至今还坐在轮椅上，靠吃流食维持生命。其脊髓运动神经元丢失太多，再也无回天之力了 ；
例2. “渐冻人症”患者周，女，观岁，在家养殖珍珠，2000年开始发病，慢慢感觉手指不灵活了，语言不清了，到处求医问诊。2002年5月，此时本发明人以为是原虫感染，让患者口服甲硝唑片等，同时使用铜绿假单胞菌菌体内毒素注射液进行治疗，一星期后，患者恢复了
6语言功能，半月后能够自己上厕所等，一个月后，患者可以串门了。患者各项体质康复了近 7成，至今保持原样，没有加重病情，概因使用了抗生素，破坏了肠道产河豚毒素的细菌。但是已经因免疫损伤丢失的神经元其功能暂时无法恢复；
例3.本发明人使用铜绿假单胞菌菌体内毒素药物治疗多种疾病，许多患者既是糖尿病或者红斑狼疮患者，又是帕金森或老年痴呆患者。在治疗其他疾病时，同时也治了帕金森及老年痴呆症。治疗结果显示帕金森症发病的震颤频率和幅度明显降低，且增加了肢体力量；老年痴呆有所改善，目前没有一个评判标准和指标，只是凭患者家属的感觉评判。
权利要求
1.细菌内毒素的另一种新用途，其特征是所述细菌内毒素，作为一种生物反应调节剂，用于制备治疗和预防神经退化性疾病药物中的应用。
2.根据权利要求1所述细菌内毒素的新用途，其特征是所述细菌内毒素主要为革兰氏阴性菌细胞壁脂多糖成分，也包括含内毒素的菌体。
3.根据权利要求1所述细菌内毒素的新用途，其特征是所述药物为治疗和预防神经退化性疾病的药物。
全文摘要
本发明公开了细菌内毒素的另一种新用途，即细菌内毒素在制备治疗和预防神经退化性疾病药物中的应用。神经退化性疾病是因遗传背景和外来因素引发的自身免疫性疾病，引起神经元细胞损伤死亡，产生包涵体等病理结构，导致其神经功能障碍和缺失。内毒素是人体“清道夫”巨噬细胞最敏感的激活剂，内毒素激活单核吞噬细胞系统，诱导产生大量炎性因子，吞噬消灭神经元致病因子及神经元自身抗体和包涵体等病理结构，恢复神经元的功能。临床用于“渐冻人症”、老年痴呆症、帕金森氏症、亨廷顿舞蹈症等疾病的治疗和预防。
文档编号A61P25/14GK102441002SQ20111031142
公开日2012年5月9日 申请日期2011年10月14日 优先权日2011年10月14日
发明者韩少坤 申请人:韩少坤