专利名称：：纳米增效的细菌毒素糖基功能化分子印迹柱的制备方法及应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及-,中纳米增效的细菌毒素糖基功能化分子印迹柱的制备方法，本发明还涉及采用所述的糖基功能化分子印迹柱检测样木巾痕量细茼毒素的方法，属于痕量细菌毒素检测
技术领域：
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背景技术：
：细菌毒素主要有三种外*索、内毒素和非蛋白毒素。外毒素是一种典型的水溶性蛋白，是细菌在指数牛长期分泌的己知可感染人类毒性最强的细菌毒素，在很低浓度时就具有很卨的毒性。随着检测方法和分析技术的发展，人们发现细菌毒素几乎广泛存在T所有的食品和饲料中。因此，开发-'种准确度高、特异性强、快速检测细菌毒素的方法，对食物中毒、水污染等突发事故做出快速诊断，并选择合适的应对措施，对于食品与环境控制以及国防安全都是十分重要的。细菌毒素的存在会威胁人类健康，造成社会经济损失，因此，细菌毒素的预防、去毒、解毒，尤其是快速高灵敏度的检测方法的建立显得十分重要。细菌錄素的检测分析方法主要有生物学方法，如动物测毒法和细胞测辨法；免疫学方法，如有反向被动血凝实验(RPHA)、被动免疫溶血试验(PIH)、毒素与抗毒素琼脂扩散试验、放射免疫测定(RIA)和酶联免疫吸阳试验(ELISA);分子生物学方法，如PCR法。这些检测方法虽然灵敏度较高，稳定性较好，但大多都有周期长，过程复杂，费时费力结果准确性等缺点。由于〗、多数细菌毒素的类似物较多、新发现的细菌毒素不断增加、细菌毒素污染的普遍性和危，性被逐步认识等原因，对细菌毒素的快速高灵敏度分析方法也提出了更迫切和更高的耍求。目前，限制细菌毒素检测研究的难点主要是结构相似物较多，交叉反应普遍；询素检测时较易受提取液中其它难f去除的T扰物质的影响等。针对3前细菌毒素危害性大、检测闲难、不易预防等特点，尤其对商检和卫牛防疫部门来说，更需要有一个简便、快速、灵敏的方法对细菌毒素进行检测，对其潜在危害作出判断，以促进经济发展，保障人类健康。
发明内容针对现有技术屮存在的不足，本发明提供了一种检测速度快、灵敏度高的纳米增效的细菌毒素糖基功能化分子印迹柱的制备方法。本发明还提供了采用所述的糖基功能化分了印迹柱检测样本中痕量细菌毒素的方法。本发明是通过以下技术方案实现的所述的纳米增效的细菌毒素糖基功能化分子印迹柱的制备方法，包括以下步骤(1.)选择能与细菌毒素合成糖某功能化分子印迹聚合物的糖类化合物功能单体；(2)将细菌毒素模板分子、糖类化合物功能单体、交联剂、致孔剂、引发剂和仃机溶剂按一定摩尔比混合均匀制成糖基功能化分了印迹聚合物溶液；(3)选取纳米材料，按照现有方法制备出纳米溶液；(4)利用表面修饰技术，将纳米材料和糖基功能化分子印迹聚合物修饰到玻璃管柱内表面上。所述细菌毒素模板分子、糖类化合物功能申.体、交联剂、致孔剂、引发剂和有机溶剂的摩尔比为o.i2:2,5:o,i5:40so:o.oio.io:i,oi5。所述糖类化合物功能单体为A-D-吡喃糖基甘露糖、N-乙酰糖胺、N-乙酰乳糖胺、唾液酸神经节-皆脂或神经酰胺—己糖苷；所述交联剂为—羟甲基丙烷—甲基丙烯酸酯、N、N-亚甲基二丙烯酰胺、3，5-二(丙烯酰胺)苯甲酸、乙二醇二甲基丙烯酸酯、二乙烯基苯或季戊四醇三丙烯酸酯；所述引发剂为偶氮一异丁腈；所述致孔剂为二氯甲垸、氯仿、乙腈、甲醇、异丙醇、四氯化碳、N，N-二甲基酰胺或二甲基亚砜；所述有机溶剂为二氯甲烷或四氯化碳。所述纳米溶液为碳纳米管溶液、纳米金溶液或纳米铂溶液。所述将纳米材料和糖基功能化分子印迹聚合物修饰到玻璃管柱内表面包括以下步骤(1)选用长度为5-10cm，直径为2-10mm的玻璃管柱，依次用1mol/LHN03和1mol/LNaOH清洗，然后用双蒸水彻底清洗数次，吹T;(2)将制备的纳米溶液超声处理20-60min，得到分散的纳米溶液；(3)将分散的纳米溶液注入玻璃管柱内，填满，将玻璃管柱两端封闭，浸泡5-10min，排出管内的纳米溶液，将玻璃管柱在室温下晾干；(4)向步骤(3)中晾千的玻璃管柱巾再注入糖基功能化分子印迹聚合物溶液，填满，将玻璃管柱两端封闭，浸泡540min，然后将玻璃管柱中的分子印迹聚合物溶液排出，)1:]洗脱剂洗脱20-30min,室温下千燥5-l.Omin;(5)重复歩骤(3)和歩骤(4)过程4-7次，制得所述糖基功能化分子印迹柱。为除去玻璃管柱内表面过量的糖基功能化分了-印迹聚合物，本发明所述的制备方法，还包括以下歩骤将糖基功能化分子印迹柱浸入pH6.8-7.2缓冲液中，保存在(C冰箱，1224h后使用。所述洗脱剂为乙腈、水、甲醇-乙酸混合液或乙S青-乙酸混合液。所述缓冲液为柠檬酸-磷酸溶液。本发明所述的检测痕量细菌毒素的方法，是将按上述的任意--种方法制得的糖基功能化分子印迹柱连接到化学发光分析仪，将化学发光体系溶液与样品溶液分别泵入化学发光分析仪，对样品中的细菌毒素进行检测。所述化学发光体系溶液为鲁米诺溶液、光泽精溶液、N-溴代丁二酰亚胺溶液、Ce(IV)-S032—溶液、鲁米诺-KM:n04溶液、鲁米诺-11202溶液、异烟肼-NaC10溶液或NaI04-&02溶液。本发明的有益效果1、将纳米材料的纳米增效作用引入到分子印迹柱的制备当中，使得所制备的细菌毒素分子印迹柱具有更高的灵敏性和检测范围。2、将表面修饰技术应用到分子印迹柱的制备当中，使得纳米增效的细菌毒素分了印迹柱的制备具有nj控性，提高了柱了的检测灵敏度和准确性。3、本发明所得到的纳米增效的痕量细菌毒素糖基功能化分子印迹柱连接到化学发光分析仪用于检测细齒毒素，可以实现样本中细齒毒素的卨特异性、卨灵敏度、快速检测。4、木发明的糖基功能化分子印迹柱的特异性强，样品中其它非特异性分子对检测结果无影响；灵敏度高，可以达到amol级；检测速度快，完成--个基本检测过程仅需l.min左右的时间，可在短时间内实现大量样本的高通量筛选；成本低，检测l个样品仅需几分钱。5、糖基功能化分了印迹柱检测细菌錄素的方法，操作快速简单，反应及结果均由仪器自动完成和记录，避免了主观因素的影响，并保证有很好的重复性，便于现场检测。6、将化学发光体系溶液与分子印迹技术相结合用T细菌毒素检测，既有生物传感的专一识别性，又有化学传感的机械稳定性、热稳定性。图1为纳米材料和糖基功能化分子印迹聚合物修饰到玻璃管柱内表面的过程示意图。具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明作进-\歩说明。实施例1—种白喉毒素糖基功能化分子印迹柱的制备方法，包括以下步骤(1.)选择能与白喉毒素合成糖某功能化分子印迹聚合物的功能单体；(2)碳纳米管溶液制备在超卢搅拌的条件下，将2mg多壁碳纳米管(Multi-walledcarbonnano加hes，MWCNTs)加入到lml二甲基亚砜溶液中，从『fi]获得黑色悬浊液即MWCNTs溶液；(3)取制备好的MWCNTs溶液2()pl，超声3()min,得到均匀分散的MWCNTs溶液；(4)模板分子白喉毒素，功能申.体A-D-吡喃糖基甘露糖，交联剂乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA)，致孔剂氯仿，引发剂偶氮二异丁腈，有机溶剂二氯甲烷按摩尔比为o.i:2.5:().5:7():().()5:2.o混合均匀，得到白喉毒素糖棊功能化分子印迹聚合物溶液；(5)选用t^度为5cm，直径为3mm的玻璃管柱，分别用1mol/LHN03和1mol/LNaOH淸洗，然后用双蒸水彻底淸洗数次，吹干，保证玻璃管柱内表面光亮无杂质；(6)如图l所示将MWCNTs溶液注入玻璃管柱中，填满，将玻璃管柱两端封闭，5min后将MWCNTs溶液排出，在室温下干燥10min,再将白喉毒素分子印迹聚合物溶液注入玻璃管柱中，填满，将玻璃管柱两端封闭，5min后将白喉毒素分子印迹聚合物溶液排出，用甲醇和乙酸混合液洗脱玻璃管柱内表面2()min，.宵至把这一S屮的模板分子白喉毒素完全洗掉，在室温下干燥10mim再将MWCNTs溶液注入玻璃管柱中，M满，将玻璃管柱两端封闭，5min后将MWCNTs溶液排出，室温下:「燥l()min，再将白喉fT素分了-印迹聚合物溶液汴入玻璃管柱中，填满，将玻璃管柱两端封闭，5miti后将白喉毒素分子印迹聚合物溶液排出，用甲醇和乙酸混合液洗脱玻璃管柱内表面2()min,直至把这一层中的模板分子白喉毒素完全洗掉，在室温下干燥10min。如此循环，重复上述过程5次。(7)将l:述玻璃管柱浸入到pH6.8的柠檬酸-磷酸缓冲液巾，保存在4°C的冰tM-118h，以便除去玻璃管柱内表面过量的白喉毒素糖基功能化分子印迹聚合物，当玻璃管柱内表面用去离子水彻底清洗以后，制备成功纳米增效白喉毒素分子印迹柱。将制备成功的O喉毒素分子印迹柱连接到化学发光分析仪，将浓度2.0X10-';mo1/L的鲁米诺溶液与样品溶液分别泵入化学发光分析仪，对样品中的白喉毒素进行检测，结果见表丄。利用上述同样方法，但玻璃管柱内表面未修饰MWCNTs，制备白喉毒素糖基功能化分子印迹柱，连接到化学发光分析仪，对样品中的白喉毒素进行检测，结果见表l。从表1.巾结果可以看出MWCNTs修饰的白喉毒素糖基功能化分子印迹柱比普通白喉毒素糖基功能化分子印迹柱(未加M:WCNTs修饰)具有更快的响应时间、更宽的线性范围、更高的灵敏度和更低的检测限。实施例2—种破伤风毒素糖基功能化分了印迹柱的制备方法，包括以下步骤(i)选抒能与破伤风毒素合成分子印迹聚合物的功能单休唾液酸神经节苷脂；(2)纳米金溶液的制备取5()mL().()l%HAuCl4加热至沸腾，迅速加入1mL1%柠檬酸钠溶液还原，所制备亮玫红色即纳米金溶液，放入4"C冰箱保存备用；(3)取制备好的纳米金溶液2()pl，超声2()min，得到均匀分散的纳米金溶液；(4)模板分子破伤风毒素，功能单体唾液酸神经节苷脂，交联剂三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯，致孔剂二氯甲烷，引发剂偶氮二异丁腈，有机溶剂二氯甲烷按摩尔比0.5:2.5:3:45:o.i:5，混合均匀，得到破伤风毒素分子印迹聚合物溶液；(5)选用t^度为8cm，直径为2mm的玻璃管柱，分别用1mol/LHN03和1mol/LNaOH淸洗，然后用双蒸水彻底淸洗数次，吹干，保证玻璃管柱内表面光亮无杂质；(6)如图1所示将纳米金溶液注入玻璃管柱中，填满，将玻璃管柱两端封闭，5min后将纳米金溶液排出，在室温下干燥10min，再将破伤风毒素MI:Ps溶液注入玻璃管柱巾，填满，将玻璃管柱两端封闭，5min后将破伤风毒素MIPs溶液排出，用甲醇和乙酸混合液洗脱玻璃管柱内表面25min，直至把这-一层中的模板分子破伤风毒素完全洗掉，在室温下千燥l()min，再将纳米金溶液注入玻璃管柱屮，填满，将玻璃管柱两端封闭，5min后将纳米金溶液排出，室温下干燥10mim再将破伤风毒素MIPs溶液注入玻璃管柱中，填满，将玻璃管柱两端封闭，5min后将破伤风辨素MIPs溶液排出，用甲醇和乙酸混合液洗脱玻璃管柱内表面25min，直至把这-一层中的模板分子破伤风毒素完全洗掉，在室温下千燥l()min。如此循环，重复上述过程7次。(7)将上述玻璃管柱浸入到pH7.0的柠檬酸-磷酸缓冲液中，保存在4"C的冰箱中12h，以便除去玻璃管柱内表面过量的破伤风毒素分子印迹聚合物，当玻璃管柱内表面用去离子水彻底清洗以后，制备成功纳米增效破伤风毒素糖棊功能化分子印迹柱。将制备成功的纳米增效破伤风毒素糖基功能化分子印迹柱连接到化学发光分析仪，采用光泽精化学发光体系，将光泽精溶液与样品溶液分别泵入化学发光分析仪，对样品中的白喉毒素进行检测，结果见表丄。利用上述同样方法，但玻璃管柱内表面未修饰纳米金，制备破伤风毒素糖基功能化分子印迹柱，连接到化学发光分析仪，对样品中的破伤风毒素进行检测，结果见表1。从表1中结果可以看出纳米金修饰的破伤风毒素糖基功能化分子印迹柱比普通破伤风毒素糖棊功能化分子印迹柱(未加纳米金修饰)具有更快的响应时间、更宽的线性范围、更高的灵敏度和更低的检测限。实施例3--种肉毒杆菌毒素糖基功能化分子印迹柱的制备方法，包括以下歩骤(l)选择能与肉毒杆菌毒素合成分子印迹聚合物的功能单体N-乙酰糖胺；(2)纳米铂溶液的制备取4ml5%的H2:PtCl6.6H20溶液被加入到340ml的双蒸水巾，然后在80TTF边搅拌边加热，加入60ml1%的柠檬酸钠溶液以后，得到的溶液即纳米铂溶液在80士0.5E，保温人约4小时，该过程通过吸附光谱记录，当:PtC1/—的吸附带消失的时候表明反应结束，即得到纳米铂溶液；(3)取制备好的纳米铂溶液20u1,超卢40mfn，得到均匀分散的纳米铂溶液；ei)模板分了肉毒朴菌毒素，功能单体N-乙酰糖胺，交联剂N、N-亚甲基二丙烯酰胺，致孔剂甲醇，引发剂偶氮二异丁腈，有机溶剂二氯甲烷按摩尔比i:2,5:5:65:().()8:15，混合均匀，得到肉毒杆齒毒素分子印迹聚合物溶液；(5)选用长度为10cm，直径为5mm的玻璃管柱，分别用Imol/LHNO^P1mol/LNaOH清洗，然后用双蒸水彻底清洗数次，吹千，保证玻璃管柱内表面光亮无杂质；(6)如图l所示将纳米铂溶液注入玻璃管柱中，填满，将玻璃管柱两端封闭，l.Omin后将纳米铂溶液排出，在室温FF燥l-()min，再将肉毒杆菌毒素分子印迹聚合物溶液注入玻璃管柱中填满，将玻璃管柱两端封闭，lOmin后将肉毒杆菌毒素分子印迹聚合物溶液排出，用甲醇和乙酸混合液洗脱玻璃管柱内表面20min，直至把这一层中的模板分了肉毒杆菌毒素完全洗掉，在室温下干燥iOmim再将纳米铂溶液汴入玻璃管柱中，填满，将玻璃管柱两端封闭，l()min后将纳米铂溶液排出，室温下千燥l()min，再将肉毒杆齒iij素分子印迹聚合物溶液注入玻璃管柱中填满，将玻璃管柱两端封闭，10min后将肉毒杆菌毒素分子印迹聚合物溶液排出，用甲醇和乙酸混合液洗脱玻璃管柱内表面20min，直至把这-一层中的模板分子肉毒杆菌毒素完全洗掉，在室温下干燥10min。如此循环，重复上述过程7次。(7)将上述玻璃管柱浸入到pH7.2的柠檬酸-磷酸缓冲液中，保存在4°C的冰箱中2他，以便除去玻璃管柱内表面过量的肉力朴菌毒素分了印迹聚合物，当玻璃管柱内表面用去离子水彻底淸洗以后，制备成功肉毒杆菌毒素糖基功能化分子印迹柱。将制备成功的肉毒杆菌毒素糖基功能化分子印迹柱连接到化学发光分析仪，采用亚胺类化学发光体系，将N-溴代丁二酰亚胺(NBS)溶液(5.0X10-2mol/L)与样品溶液分别泵入化学发光分析仪，对样品中的肉毒杆茼毒素进行检测，结果见表l。利用上述同样方法，但玻璃管柱内表面未修饰纳米铂，制备肉毒杆菌毒素糖祸功能化分子印迹柱，连接到化学发光分析仪，对样品中的肉毒杆菌毒素进行检测，结果见表l。从表i中结果可以看出纳米铂修饰的肉毒杆菌毒素糖基功能化糖基功能化分子印迹柱比普通肉毒杆菌毒素糖基功能化糖基功能化分子印迹柱(未加纳米铂修饰)具有更快的响应吋间、更宽的线性范围、更高的灵敏度和更低的检测限。实施例4—种志贺氏毒素糖基功能化分子印迹柱的制备方法，包括以下步骤(1.)选择能与忐贺氏毒素合成分子印迹聚合物的功能单体祌经酰胺三己糖苷；(2)纳米铂溶液的制备取4ml5%的H2PtCl66H20溶液被加入到340ml的双蒸水中，然后在8(rC下边搅拌边加热，加入6()ml1%的柠檬酸钠溶液以后，得到的溶液即纳米铂溶液在80士0.5t:，保温大约4小时，该过程通过吸附光谱记5b当PCle2—的吸附带消失的时候表明反应结束，即得到纳米铂溶液；(3)取制备好的纳米铂溶液20u1,超声40min，得到均匀分散的纳米铂溶液；(4)模板分子志贺氏毒素，功能申.体神经酰胺三己糖苷，夂联剂3，5-二(丙烯酰胺)苯甲酸，致孔剂异丙醇，引发剂偶氮二异丁腈，有机溶剂二氯甲垸按摩尔比().8:2.5:i:8()::]2，混合均匀，得到忐贺氏毒素分子印迹聚合物溶液；(5)选用长度为10cm，直径为10mm的玻璃管柱，分别用1mol/LHN03和1mo1/LNaOH清洗，然后用双蒸水彻底清洗数次，吹:「，保证玻璃管柱内表面光亮无杂质；(6)如图i所示将纳米铂溶液fn入玻璃管柱中填满，将玻璃管柱两端封闭，8mn后将纳米铂溶液排出，在室温下千燥8min，再将志贺氏毒素分子印迹聚合物溶液注入玻璃管柱中填满，将玻璃管柱两端封闭，lOmin后将志贺氏毒素分子印迹聚合物溶液排出，用甲醇和乙酸混合液洗脱玻璃管柱内表面25min，直至把这一层中的模板分子志贺氏毒素完全洗掉，在室温下干燥lOmin，再将纳米铂溶液注入玻璃管柱中填满，将玻璃管柱两端封闭，l()min后将纳米铂溶液排出，室温下千燥8min，再将忐贺氏毒素分子印迹聚合物溶液注入玻璃管柱中填满，将玻璃管柱两端封闭，10mfn后将志贺氏毒素分子印迹聚合物溶液排出，用甲醇和乙酸混合液洗脱玻璃管柱内表面25min，直至把这一层中的模板分了志贺氏毒素完全洗掉，在室温下干燥iOmin。如此循环，重复上述过程5次。(7)将上述玻璃管柱浸入到pH7.2的柠檬酸-磷酸缓冲液中，保存在4°C的冰箱中22h，以便除去玻璃管柱内表面过量的志贺氏毒素分子印迹聚合物，当玻璃管柱内表面用去离子水彻底清洗以后，制备成功纳米增效志贺氏毒素糖基功能化分子印迹柱。将制备成功的志贺氏毒素糖基功能化分子印迹柱连接到化学发光分析仪，釆用Ce(IV)作氧化剂的化学发光体系，将Ce(IV)-S032—溶液与样品溶液分别泵入化学发光分析仅，溶液中Ce(IV)浓度为1,0X10—3mol/L，S032—浓度为3,0X10—4mol/L,对样品中的志贺氏T^T右进行检测，结果见表l。利用上述同样方法，但玻璃管柱内表面未修饰纳米铂，制各志贺氏毒素糖基功能化分子印迹柱，连接到化学发光分析仪，对样品中的志贺氏毒素进行检测，结果见表1。从表1中结果可以看出纳米铂修饰的志贺氏毒素糖基功能化分子印迹柱比普通忐贺氏lY索糖^」力能化分子印迹柱(未加纳米铂修饰)具有更快的响应时间、更宽的线性范围、史W的灵敏度和更低的检测限。头她例5--种中毒性休克毒素i糖基功能化分子印迹柱的制备方法，包括以下歩骤(l)选择能与中毒性休克毒素1合成分子印迹聚合物的功能单体N-乙酰乳糖胺；(2)纳米金溶液的制备取50mL0.01%HAuCl4加热至沸腾，迅速加入1mL1%柠檬酸钠溶液还原，所制备亮玫红色即纳米金溶液，放入4。C冰筘保存备用；(3)取制备好的纳米金溶液20u1，超声50mfm得到均匀分散的纳米金溶液；(4)按摩尔比().5:2.5:3:4.0:().()8:2.2称取模板分子屮泰性休克毒素l.，功能单体N-乙酰乳糖胺，交联剂季戊四醇-:丙烯酸酯，致孔剂二甲基亚砜，引发剂偶氮二异丁腈，有机溶剂二氯甲烷，混合均匀，得到中辨性休克毒素l分了印迹聚合物溶液；(5)选用长度为丄0cm，直径为8mm的玻璃管柱，分别用丄mol/:LHN03和丄mol/LNaOH清洗，然后用双蒸水彻底清洗数次，吹千，保证玻璃管柱内表面光亮无杂质；(6)如图1所示将纳米金溶液注入玻璃管柱中填满，将玻璃管柱两端封闭，lOmin后将纳米金溶液排出，在室温下千燥l()min，再将中毒性休克毒素1分子印迹聚合物溶液注入玻璃管柱中填满，将玻璃管柱两端封闭，10min后将中毒性休克毒素l分子印迹聚合物溶液排出，用甲醇和乙酸混合液洗脱玻璃管柱内表面25min，有至把这一S屮的模板分子中毒性休克毒素l完全洗掉，在室温下干燥10mhi，再将纳米金溶液注入玻璃管柱中填满，将玻璃管柱两端封闭，l()min后将纳米金溶液排出，室温K'「燥l()min，再将中毒性休克毒素i分子印迹聚合物溶液汴入玻璃管柱中填满，将玻璃管柱两端封闭，i0min后将中毒性休克毒素l分子印迹聚合物溶液排出，用甲醇和乙酸混合液洗脱玻璃管柱内表面25min，直至把这.'S中的模板分子中毒性休克毒素1完全洗掉，在室温下干燥10min。如此循环，重复k述过程6次。(7)将上述玻璃管柱浸入到pH6.8的柠檬酸-磷酸缓冲液中，保存在4°C的冰箱中24h,以便除去玻璃管柱内表面过量的屮毒性休克毒素1分子印迹聚合物，当玻璃管柱内表面用去离子水彻底清洗以后，制备成功纳米增效中毒性休克毒素l糖基功能化分子印迹柱。将制各成功的中毒性休克毒素i糖基功能化分子印迹柱连接到化学发光分析仪，采用卨锰酸钾(KMnO,;)作氧化剂的化学发光体系，将鲁米诺-KMn04溶液(与样品溶液分别泵入化学发光分析仪，鲁米诺-KMn04溶液中鲁米诺的浓度为1.0X10-3m0l/:L，KMn04的浓度为1.0X10-3mol/L，对样品巾的巾毒性休克毒素1分子进行检测，结果见表1。利j-tj....匕述同样方法，但玻璃管柱内表面未修饰纳米金，制备屮毒性休克毒素l.糖基功能化分子印迹柱，连接到化学发光分析仪，对样品中的中毒性休克毒素l进行检测，结果见表l。从表i中结果可以看出纳米金修饰的中毒性休克毒素i糖基功能化分子印迹柱比普通中毒性休克毒素1糖基功能化分子印迹柱(未加纳米金修饰)具有更快的响应时间、更宽的线性范围、更高的灵敏度和更低的检测限。实施例6—种链球菌致热外毒素糖基功能化分子印迹柱的制备方法，包括以下步骤(1)选择能与链球菌致热外毒素分子合成分子印迹聚合物的功能单体N-乙酰糖胺；(2)碳纳米管溶液的制备在超声搅拌的条件下，将2mgM:WCNTs加入到iml二甲基亚砜溶液中，从而获得黑色悬浊液即MWCNTs溶液；(3)取制备好的MWCNTs溶液20ul，超声60min,得到均匀分散的MWCNTs溶液；(4)按摩尔比为2:2,5:4:60:0.03:15称取模板分子链球菌致热外毒素，功能单体N—乙酰糖胺，交联剂二乙烯某苯(DVB),致孔剂二氯甲烷，引发剂偶氮二异丁腈，W机溶剂二氯甲烷，混合均匀，得到链球菌致热外毒素分子印迹聚合物溶液；(5)选用t^度为5cm，直径为3mm的玻璃管柱，分别用1mol/LHN03和1mol/LNaOH淸洗，然后用双蒸水彻底淸洗数次，吹干，保证玻璃管柱内表面光亮无杂质；(6)如图1所示将MWCNTs溶液注入玻璃管柱中填满，将玻璃管柱两端封闭，5min后将MWCNTs溶液排出，在室温下干燥10min,W将链球菌致热外毒素分子印迹聚合物溶液注入玻璃管柱中填满，将玻璃管柱两端封闭，5min后将链球茼致热外毒素分子印迹聚合物溶液排出，用甲醇和乙酸混合液洗脱玻璃管柱内表面20min，直至把这--层屮的模板分子链球菌致热外毒素完全洗掉，在室温下千燥l()min,再将MWCNTs溶液注入玻璃管柱中填满，将玻璃管柱两端封闭，5miti后将MWCNTs溶液排出，室温下干燥l()min，再将链球菌致热外毒素分了印迹聚合物溶液注入玻璃管柱中填满，将玻璃管柱两端封闭，5miti后将链球菌致热外毒素分子印迹聚合物溶液排出，用甲醇和乙酸混合液洗脱玻璃管柱内表面2()min，直至把这一层中的模板分子链球菌致热外毒素完全洗掉，在室温下干燥10min。如此循环，重复上述过程5次。(7)将l:述玻璃管柱浸入到pH6.8的柠檬酸-磷酸缓冲液巾，保存在4°C的冰筘巾24h，以便除去玻璃管柱内表面过量的链球菌致热外毒素分子印迹聚合物，当玻璃管柱内表面用去离子水彻底清洗以后，制备成功纳米增效链球菌致热外毒素糖基功能化分子印迹柱。将制备成功的纳米增效链球菌致热外錄素糖基功能化分了印迹柱连接到化学发光分析仪，采用过氧化氢(H202)作氧化剂的化学发光休系，将鲁米诺-H202溶液(鲁米诺2.5Xl(r2mol/L，H202:5.0X1()-5mol/L)与样品溶液分别泵入化学发光分析仪，对样品中的链球菌致热外毒素进行检测，结果见表1。利用l:述同样方法，但玻璃管柱内表面未修饰MWCNTs，制备链球菌致热外毒素糖基功能化分子印迹柱，连接到化学发光分析仪，对样品中的链球菌致热外毒素进行检测，结果见表l。从表1中结果可以看出MWCNTs修饰的链球菌致热外毒素糖基功能化分子印迹柱比普通链球菌致热外毒素糖基功能化分了印迹柱(未加MWCNTs修饰)具有更快的响应时间、更宽的线性范闺、更高的灵敏度和更低的检测限。实施例7-f巾霍乱毒素糖基功能化分子印迹柱的制备方法，包括以下步骤(1.)选择能与霍乱毒素合成分子印迹聚合物的功能申.体唾液酸神经节苷脂；(2)纳米金溶液的制备取50mL0.01%HAuCl4加热至沸腾，迅速加入ImL1%柠檬酸钠溶液还原，所制备亮玫红色即纳米金溶液，放入4t;冰箱保存备用；(3)取制备好的纳米金溶液20ii1,超声50min，得到均匀分散的纳米金溶液；(4)按摩尔比o.2:2.5:2:so:o.oe:丄o称取模板分子霍乱毒素，功能单休唾液酸神经节苷脂，交联剂季戊M醇二丙烯酸酯，致孔剂N，N-二甲基酰胺，引发剂偶氮二异丁腈，有机溶剂二氯甲烷，混合均匀，得到霍乱毒素分子印迹聚合物溶液；(5)选用长度为5cm，直径为3mm的玻璃管柱，分别用1mol/LHN03和1mol/LNaOH清洗，然后用双蒸水彻底清洗数次，吹干，保证玻璃管柱内表面光亮无杂质；(6)如图i所示将纳米金溶液注入玻璃管柱屮填满，将玻璃管柱两端封闭，10min后将纳米金溶液排出，在室温下干燥10mim再将霍乩毐素分子印迹聚合物溶液注入玻璃管柱中填满，将玻璃管柱两端封闭，l()min后将霍乱TlT右分了印迹聚合物溶液排出，用甲醇和乙酸混合液洗脱玻璃管柱内表面25mim直至把这--层中的模板分子霍乱毒素完全洗掉，在室温下千燥l()min，再将纳米金溶液注入玻璃管柱中填满，将玻璃管柱两端封闭，10min后将纳米金溶液排出，室温下干燥10min,W将霍乱毒素分子印迹聚合物溶液注入玻璃管柱中填满，将玻璃管柱两端封闭，l()min后将霍乱毒素分子印迹聚合物溶液排出，用甲醇和乙酸混合液洗脱玻璃管柱内表面25min，直至把这-一层中的模板分子霍乱毒素完全洗掉，在室温--FF燥l()min。如此循环，革:复上述过程7次。(7)将上述玻璃管柱浸入到pH6.8的柠檬酸-磷酸缓冲液中，保存在(C的冰箱中12h，以便除去玻璃管柱内表面过量的霍乱辨素分了印迹聚合物，3玻璃管柱内表面用去离子水彻底淸洗以后，制各成功纳米增效霍乱毒素糖基功能化分子印迹柱。将制备成功的纳米^效fr乱毒素糖基功能化分子印迹柱连接到化学发光分析仪，采用碘酸钠(Na从表1中结果可以看出纳米金修饰的霍乱毒素糖基功能化分子印迹柱比普通霍乱毒素糖基功能化分了印迹柱(未加纳米金修饰)具有更快的响应时间、更宽的线性范闺、更高的灵敏度和更低的检测限。实施例8-f巾绿脓杆菌外毒素a糖基功能化分子印迹柱的制备方法，包括以下步骤(1.)选择能与绿脓杆菌外毒素a合成分子印迹聚合物的功能申.体神经酰胺三己糖苷；(2)碳纳米管溶液的制备在超声搅拌的条件下，将2mgMWCNTs加入到lml二甲基亚砜溶液中，从而获得黑色悬浊液即MWCNTs溶液；(4)按摩尔比().s:2.5:3:4():().i:1.5称取模板分子绿脓杆菌外毒素a，功能单体神经酰胺三己糖—ff，交联剂乙二醇二甲基丙烯酸酯，致孔剂四氯化碳，引发剂偶氮二异丁腈，有机溶剂二氯甲烷，混合均匀，得到绿脓杆菌外毒素a分子印迹聚合物溶液；(5)选用长度为5cm，直径为3mm的玻璃管柱，分别用lmol/LHN03和1mol/LNaOH清洗，然后用双蒸水彻底清洗数次，吹十，保证玻璃管柱内表面光亮无杂质；(6)如图i所示将M:WCNTs溶液汴入玻璃管柱中填满，将玻璃管柱两端封闭，5min后将MWCNTs溶液排出，在室温下千燥1()min，再将绿脓杆菌外毒素a分子印迹聚合物溶液注入玻璃管柱中填满，将玻璃管柱两端封闭，5min后将绿脓杆菌外毒素a分子印迹聚合物溶液排出，用甲醇和乙酸混合液洗脱玻璃管柱内表面20min，直至把这一层中的模板分子绿脓杆菌外毒素a完全洗掉，在室温下干燥lOmin，再将M:WCNTs溶液注入玻璃管柱屮填满，将玻璃管柱两端封闭，5min后将MWCNTs溶液排出，室温下千燥10mim再将绿脓杆菌外毒素a分子印迹聚合物溶液注入玻璃管柱中填满，将玻璃管柱两端封闭，5min后将绿脓杆菌外毒素a分了印迹聚合物溶液排出，用甲醇和乙酸混合液洗脱玻璃管柱内表面20mim直至把这--------层中的模板分子绿脓杆菌外毒素a完全洗掉，在室温下千燥l()min。如此循环，重复上述过程5次。(7)将上述玻璃管柱浸入到pH6.8的柠檬酸-磷酸缓冲液中，保存在4"C的冰箱中18h，以便除去玻璃管柱内表面过量的绿脓杆茼外毒素a分子印迹聚合物，当玻璃管柱内表面用去离子水彻底清洗以后，制备成功纳米增效绿脓杆菌外毒素a糖基功能化分子印迹柱。将制备成功的纳米增效绿脓杆菌外毒素a糖基功能化分子印迹柱连接到化学发光分析仪，采用次氯酸钠(NaC10)化学发光体系，将异烟肼-NaC10溶液与样品溶液分别泵入化学发光分析仪，对样品中的白喉毒素进行检测，结果见表丄。利用上述同样方法，但玻璃管柱内表面未修饰MWCNTs，制备绿脓杆菌外毒素a糖基功能化分子印迹柱，连接到化学发光分析仪，对样品中的绿脓杆菌外毒素a进行检测，结果见表l。从表1中结果可以看出MWCNTs修饰的绿脓杆菌外毒素a糖基功能化分子印迹柱比普通绿脓杆菌外毒素a糖棊功能化分子印迹柱(未加MWCNTs修饰)具有更快的响应时间、更宽的线性范围、更高的灵敏度和更低的检测限。表1本发明纳米增效糖基功能化细菌毒素分了印迹柱与普通细菌毒素分了印迹柱检测效果对比<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>权利要求一种纳米增效的细菌毒素糖基功能化分子印迹柱的制备方法，其特征在于包括以下步骤(1)选择能与细菌毒素合成糖基功能化分子印迹聚合物的糖类化合物功能单体；(2)将细菌毒素模板分子、糖类化合物功能单体、交联剂、致孔剂、引发剂和有机溶剂按一定摩尔比混合均匀制成糖基功能化分子印迹聚合物溶液；(3)选取纳米材料，按照现有方法制备纳米溶液；(4)利用表面修饰技术，将纳米材料和糖基功能化分子印迹聚合物修饰到玻璃管柱内表面上。2.根据权利要求i所述的制备方法，其特征在于所述细菌毒素模板分子、糖类化合物功能单体、交联剂、致孔剂、弓l发剂和有机溶剂的摩尔比为().i2:2.5:(u5:4080:o.oio.io:i.oi5。3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于所述糖类化合物功能申.体为A-D-吡喃糖基甘露糖、N-乙酰糖胺、N-乙酰乳糖胺、唾液酸神经节苷脂或神经酰胺三己糖苷；所述交联剂为三羟甲棊丙烷三甲某丙烯酸酯、N、N-亚甲某二丙烯酰胺、3，5-二(丙烯酰胺)苯甲酸、乙二醇二甲基丙烯酸酯、二乙烯基苯或季戊四醇-:丙烯酸酯；所述引发剂为偶氮二异丁腈；所述致孔剂为二氯甲烷、氯仿、乙腈、甲醇、异丙醇、四氯化碳、N，N-二甲基酰胺或二甲基亚砜；所述有机溶剂为二氯甲烷或四氯化碳。4.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于所述纳米溶液为碳纳米管溶液、纳米金溶液或纳米铂溶液。5.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于所述将纳米材料和糖基功能化分子印迹聚合物修饰到玻璃管柱内表面包括以下步骤(1)选用长度为5-1—()cm，.宵径为2-1—()mm的玻璃管柱，依次jlj1—mol/LHN03和lmol/LNaOH清洗，然后用双蒸水彻底清洗数次，吹干；(2)将制备的纳米溶液超声处理20-6()min，得到分散的纳米溶液；(3)将分散的纳米溶液注入玻璃管柱内，填满，将玻璃管柱两端封闭，浸泡5-l()min，排出管内的纳米溶液，将玻璃管柱在室温——F晾千；(4)向步骤(3)中晾干的玻璃管柱中再注入糖基功能化分子印迹聚合物溶液，填满，将玻璃管柱两端封闭，浸泡5-l()min，然后将玻璃管柱巾的分子印迹聚合物溶液排出，用洗脱剂洗脱20-30min，室温下干燥5-10min;(5)S复步骤(3)和歩骤(4)过程4-7次，制得所述糖某功能化分子印迹柱。6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于还包括以下歩骤将糖基功能化分了印迹柱浸入pH6.8-7.2缓冲液中，保存在4t:冰箱，122他后使用。7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于所述洗脱剂为乙腈、水、甲醇-乙酸混合液或乙腈-乙酸混合液。8.根据权利耍求6所述的制备方法，其特征在T:所述缓冲液为柠檬酸-磷酸溶液。9.一种检测痕S细菌毒素的方法，其特征在于将按权利要求1至8所述的任意一种方法制得的糖基功能化分子印迹柱连接到化学发光分析仪，将化学发光体系溶液与样品溶液分别泵入化学发光分析仪，对样品屮的细菌7^吉进行检测。10.根据权利要求9所述的检测痕量细菌毒素的方法，其特征在于所述化学发光体系溶液为鲁米诺溶液、光泽精溶液、N-溴代丁二酰亚胺溶液、Ce(IV)-S032—溶液、鲁米诺-KMn04溶液、鲁米诺-H202溶液、异烟肼-NaCIO溶液或Nal04-H202溶液。全文摘要本发明涉及一种纳米增效的细菌毒素糖基功能化分子印迹柱的制备方法，包括以下步骤选择能与细菌毒素合成糖基功能化分子印迹聚合物的糖类化合物功能单体；制备糖基功能化分子印迹聚合物溶液；制备纳米溶液；将纳米材料和糖基功能化分子印迹聚合物修饰到玻璃管柱内表面上。本发明所述的检测痕量细菌毒素的方法，是将按上述方法制备的糖基功能化分子印迹柱连接到化学发光分析仪，将化学发光体系溶液与样品溶液分别泵入化学发光分析仪，对样品中的细菌毒素进行检测。本发明的制备方法具有可控性，提高了柱子的灵敏度和准确性；所制备的分子印迹柱特异性强，灵敏度高，检测速度快，可在短时间内实现大量样本的高通量筛选，减少了检测成本。文档编号G01N21/76GK101692046SQ200910018458公开日2010年4月7日申请日期2009年9月29日优先权日2009年9月29日发明者于京华,孙纳新,宋晓妍,张秀明,朱晗,林青,汪世华,葛慎光,袁靓,裴梅山,贺晓蕊,邢宪荣,黄加栋申请人:济南大学