改性的中空纤维材料用于从优选血液和血浆的液体中除去由大肠杆菌产生的外毒素的用 ...的制作方法
【专利摘要】本发明涉及用于从包含蛋白质的液体（特别是血液或血浆）中体外除去由致病性大肠杆菌产生的外毒素的化学改性的中空纤维材料，及其用于治疗患有疾病的患者的用途，所述疾病例如是由肠出血性大肠杆菌细菌（EHEC感染）或其它致病性大肠杆菌，例如肠毒性大肠杆菌（ETEC）或肠聚集性大肠杆菌（EAEC）引起的。
【专利说明】改性的中空纤维材料用于从优选血液和血浆的液体中除去由大肠杆菌产生的外毒素的用途及它们用于治疗伴随疾病的用途
【技术领域】
[0001]本发明涉及用于从包含蛋白质的液体(特别是血液或血浆)中体外除去由致病性大肠杆菌产生的外毒素的化学改性的中空纤维材料，以及用于治疗罹患例如由肠出血性大肠杆菌细菌(EHEC感染)或其它致病性大肠杆菌如肠毒性大肠杆菌(ETEC)或肠聚集性大肠杆菌(EAEC)引起的疾病的患者的用途。
【背景技术】
[0002]大肠杆菌(STEC细菌)产生的志贺毒素(又名志贺样或Vero毒素)在1977年已有描述(Konowalchuk 等人，Infect Immun, 1977,18:775-779),但是直到 1983 才将其与溶血性尿毒症综合征(HUS)联系起来(Karmali等人，Lancet, 1983，2:619-20)。从那时起，特别是对于儿童而言，已经证明了 STEC感染是急性肾衰竭的主要原因。直到现在还公认的是，HUS一旦形成，其治疗仍是非常困难的(Thorpe CM,Food Safety CID.2004，38:1298-1303)。因此，研究工作主要集中在保护免受这些致病细菌的感染。
[0003]因为STEC是非聚集性菌，志贺毒素从肠到血流中的转移似乎是形成这种疾病的前提条件。另外，脂多糖被认为是HUS发病机理中的另一个因素(Siegler等人，Am JNephrol, 2001,21:420-425 ；Safdar 等人，JAMA, 2002，288:996-1001 ；Dundas 等人，ClinInfect Dis，2001,33:923-931)。据估计感染STEC的患者中有5-10%发生了危及生命的疾病 HUS。
[0004]2011年初，在德国以及一些周边国家，在没有任何预警的情况下发生了一波EHEC感染。尽管有专家、健康组织(包括Robert-Koch机构)、专业临床人员和医生的共同努力，在治疗这波感染时仍是明显地无能为力，特别是对于HUS综合症而言。正是这种以前基本上未知的和聚集性的EHEC细菌0104:H2使感染EHEC的3154名患者中的845名发生了溶血性尿毒症综合征(HUS) (Robert-Koch-机构数据)，由此发展至从临床和健康政治的观点考虑都难以应对的处境。即使在专家之间进行的国际性经验交换，其结论仍是到目前为止仍没有科学的治疗措施来可靠地对抗这种严重的疾病。由于在五月份的感染潮期间的无能为力，开支异常高涨，使医院的预算以及总体保健成本紧张，特别是在相关的聚集区域中。目前，这种状况仍可能在任何时候和任何地方再次出现。这种情况对于现代医学科学来说是不能接受的，这使得有必要将所有的科研努力置于流行病学的领域，预防和最重要的是治疗致病性大肠杆菌感染，尤其是EHEC感染。
[0005]Stxl-细菌(Stxl=志贺毒素I)代表了共同之处在于生产志贺毒素的异源生物群。因此，在HUS患者中，检测和描述了多种STEC血清型。显著聚集性的是变体0104:H4，正是这一变体导致了在中欧的多地发生了上述感染。现在，可以使用分子遗传学方法(PCR)可靠地和相对快速地进行多种STEC变体的诊断。在两种志贺毒素家族(Stxl和Stx2)之间进行了血清学区分，其中可以发现具有不同严重程度的毒素变体。EHEC菌株0154、026、0123、011和0145是常见的人类致病性变体，而0157:H7是第一个与胃肠疾病有关的菌株。志贺毒素由一个酶促A子单元和5个与膜结合的B子单元组成(AB5-蛋白质)。B子单元负责与它们的配体进行特异性结合，而A子单元移位到靶细胞中并在其酶活化时通过蛋白质合成抑制杀死细胞。对于志贺毒素来说，细胞表面上的受体是脂酰鞘氨醇三已糖苷(globotriaosylceramide, Gb3),其存在于大多数真核细胞上,特别是肠上皮细胞、上皮细胞和肾皮层细胞。志贺毒素的B子单元与Gb3受体的末端三糖结合。从细菌释放出来的志贺毒素只有在破坏并渗透肠上皮之后进入血流，并通过粘附于白细胞而被运输到优选脑和肾的内皮细胞(Thorpe CM, Food Safety CID.2004，38:1298-1303)。这些细胞具有特异性的STEC受体，这可以解释在器官方面的某些特异性和并发症。在该疾病的初始状态，总的来说，主要症状是水性腹泻，有时随后发生血性腹泻(在德国发生在25%患者中)，并随后发生以血液学改变、肾衰竭、癫痫发作伴随脑水肿为特征的HUS。
[0006]死亡率达到患者的10%。致病性STEC细菌主要通过人的食物链转移(肉、蔬菜、黄瓜、豆芽菜、鲑鱼)。而且很有可能在人类之间转移。在治疗这种特定的细菌传染时，反而表现出抗生性，因为这导致患者血液中志贺毒素浓度增加(Safdar等人，JAMA,2002,288:996-1001 ;Dundas 等人，Clin Infect Dis, 2001, 33:923-931)。目前，治疗的重点在于卫生措施，以避免细菌出现在人类食物链中。
[0007]使被感染的患者的肠中和更重要的是血液中的毒素负载降低的努力尚未表现出任何可证实的临床结果(Thorpe等人，Food Safety CID.2004，38:1298-1303)。医学方法还没有通过动物试验阶段(猪、小鼠)。一期临床试验由于没有什么效果而被中止(Trachtman等人，JAMA2003，290:1337-1344)。
[0008]因此，直到今天，在医学技术方面尚没有可用的药物、物质或措施具有针对人的志贺毒素疾病的发病机理的目标导向性治疗和改善。对于例如下述来说，情况也是这样:
[0009]a)用于口服给药的合成毒素结合剂(Trachtman等人，JAMA, 2003，290:1337-1344 ；Watanabe 等人，J Infect Dis，2004，189:360-368)
[0010]b)通过特异性细胞表面蛋白质(Gb3-受体)与志贺毒素竞争的益生菌(Pinyon等人，J Infect Dis，2004，189:1547-1555)，或
[0011]c)使用针对志贺毒素的单克隆抗体进行试验(Mukherjee等人，Infect Immun,2002, 70:5896-5899 ;Sheoran 等人，Infect Immun, 2003, 71:3125-3130)?
[0012]所有已知的治疗措施都是以希望受益于肠腔中的毒素结合的努力为基础的。将来应该而且会继续探索合适的方法。
[0013]此外，也可能有用的是关于与生产Stxl和Stx2的菌株竞争结合受体的细菌重组工程的方法(Pinyon等人，J Infect Dis，2004，189:1547-1555)。另外，使用针对志贺毒素的单克隆抗体或抗体混合物似乎也是有吸引力的并且是理论上有利的，因为这种方法适用于许多其它疾病。然而，从临床的观点考虑，针对致病性EHEC感染的理论上可能的所有治疗措施到至今为止还没有令人满意。
[0014]关于致病性大肠杆菌感染(尤其是EHEC感染)的治疗和另外的HUS的治疗的目前已知知识的概述中，显而易见的是，基于研究的医学和临床医学仍没有对抗这种威胁性传染病的有效措施。在临床水平上，通过血浆交换治疗来应对这个问题的尝试也不太可信。这是一种非选择性的但却不那么有效的方法。除了计划除去志贺毒素之外，还同时从患者提取了保护性和抗炎性的介质。这种血浆交换需要每名患者大约12升血浆的交换量，这需要大量的供体并且可能伴随其它感染和变态反应的较高风险。此外，血浆交换治疗涉及昂贵的治疗费用。
【发明内容】
[0015]因此，本发明的目的在于提供可以避免目前的治疗措施的缺点并通常能够有效治疗感染致病性大肠杆菌(尤其是EHEC)的患者的治疗方法和相应的材料以及适当的装置。这个问题的解决是利用了在EP1602387中描述的原本被开发用于在体外灌注系统中从患者的血液或血浆中除去细菌内毒素(脂多糖，LPS)和脂磷壁酸(lipoteichonic acids,LTA)的方法和相应的材料或装置。
[0016]本发明涉及用于治疗与腹泻有关的肠疾病和(如果适用)与后遗症有关的物质，这种肠疾病是由产生外毒素的大肠杆菌弓I起的，所述物质包含化学改性的中空纤维材料，所述化学改性的中空纤维材料选自聚酰胺、聚砜、聚醚、聚乙烯、聚丙烯、聚酯、及其衍生物和/或混合物，其中所述中空纤维材料经过改性而包含具有阴离子交换基团的触须，其中所述阴离子交换基团包含合成的聚阳离子链、半合成的聚阳离子链和天然的聚阳离子链中的至少一种，其中所述合成的、半合成的和天然的聚阳离子链是直链或支链的。
[0017]本发明意外地发现，借助这种物质和包含这种物质的装置可以通过吸附而有效地从血液或血浆中除去志贺毒素，尽管细菌毒素LPS和LTA与志贺毒素在化学结构和生物化学功能方面都是不同的。LPS和LTA是用脂肪酸酯化的低聚糖/聚糖，它们属于革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌的膜的一部分。
[0018]然而，志贺毒素是革兰氏阴性菌的酶促活性的胞内蛋白质(外毒素)。
[0019]感染致病性大肠杆菌的患者在感染肠毒性大肠杆菌的情况下可能经历不同类型的腹泻，所述腹泻可以是儿童的水性的、轻度的、短暂的、自限性的、断奶性的腹泻，导致严重排便的腹泻或旅行者腹泻；在感染肠聚集性大肠杆菌的患者中发生了伴随轻度发烧和很少的呕吐至没有呕吐的水性的、粘液样的、带血的和分泌性的腹泻疾病。在感染肠出血性大肠杆菌1-2天后，腹泻变成血性腹泻并伴随腹痛，其可以持续4到10天，并且在一些情况下(5-10%)，该疾病可能会进展到HUS。
【具体实施方式】
[0020]如本文中使用的，术语“外毒素”是指由任何致病性大肠杆菌菌株、优选ETEC、EAEC、最优选EHEC产生的任何外毒素。
[0021]优选将本发明的物质在装置中提供，所述装置布置为过滤器模块的形式，最优选可用于血浆灌流/吸附性血浆分离置换系统。对要用于吸附性血浆分离置换法的装置来说，尤其要满足以下条件:
[0022]1.外毒素的清除应该是选择性的和尽可能有效的。
[0023]2.所用的吸附剂的结合能力应该满足最佳的实践要求。
[0024]3.吸附剂必须能够在性能没有损失或改变的情况下通过热或Y辐射灭菌。
[0025]4.吸附剂应该允许最大200ml/min的足够高的流速。
[0026]5.清除方法必须表现出医学上必须的生物相容性和血液相容性，并且必须不损害任何生理学控制系统和保护机制，例如免疫系统、补体系统或凝血系统。
[0027]本领域技术人员应该能够根据这种性能要求找到适合的中空纤维吸附材料。原则上，可以使用由聚酰胺、聚砜、聚醚、聚乙烯、聚丙烯、聚酯、或这些聚合物的衍生物和/或混合物制造的中空纤维材料。在本发明的一个特别优选的实施方案中，所述中空纤维由聚酰胺组成，优选尼龙。
[0028]本发明的适合的中空纤维材料是基于亲合性膜，如在例如美国专利US5053133和US5766908以及W096/22316中所述。这些膜基体材料可以通过已知的方法进行改性，特别是通过接枝聚合来改性，关于这一方面，参见例如W096/22316，其中描述了一种适合的方法。适合于生产中空纤维吸附材料(即，本发明物质)的用于适当的聚合物材料的其它衍生化方法也是本领域技术人员公知的并且可以在本发明的范围内加以使用。
[0029]优选将本发明的物质布置在装置中，使得有效流量的血液或血浆流过它们，确保中空纤维膜的最大润湿，以便可以发生外毒素在中空纤维吸附材料上的最佳吸附。中空纤维材料在本发明装置中的优选的布置方法公开在W098/57733、W098/33581、W098/19777或W098/28064中，特别优选的布置方式还描述在EP1002566中。
[0030]除了中空纤维材料，本发明的装置可以包含另外的材料，例如在中空纤维之间的平坦的膜，其通常可以提供进一步的吸附和分离性能。相应的吸附装置布置描述在EP0956147 中。
[0031]在上述的文献中公开的材料和改性方法和吸附装置的最终布置都可以用在本发明的装置中。然而，其它布置、材料和改性方法也被包括在本发明范围内，条件是它们可以有效地将外毒素从血液和血浆中除去，并且满足对于吸附性血浆分离置换的上述要求1-5。
[0032]为了使从血液或血浆中除去外毒素特别有效，所述装置利用了化学改性的中空纤维，使得外毒素尤其充分地结合于中空纤维材料并由此被从血液或血浆中除去。优选进行中空纤维材料的化学改性(化学修饰)，并且对于所述改性来说已经证明接枝聚合(参见上述)是尤其有利的，被接枝到中空纤维材料上的化合物表现出良好的外毒素结合能力。还已经证明了阴离子交换基团的接枝是尤其有利的。这些阴离子交换基团在具有大量阳离子基团的更长链的形式(称为触须)时是尤其有利的。基体材料上的这些触须样的伸长能够结合外毒素分子，使中空纤维材料的效率进一步提高。中空纤维材料利用触须的这种改性优选利用合成的和/或半合成的和/或天然的聚阳离子链，并且所述链可以是直链或支链的。尤其优选本发明的中空纤维材料用具有叔胺和/或季铵的阳离子链或聚阳离子链进行改性。
[0033]将阴离子交换基团固定在中空纤维材料上的另一种可能是本领域技术人员公知的用于化学固定的标准技术。
[0034]中空纤维材料上的优选的阴离子交换基团包括二 -或三烷基氨基烷基、二-或二 -烧基氨基芳基_、二-或二 -芳基氨基烧基、二 -或二 -芳基氨基芳基、二 -或二 -烧基铵基烷基_、二-或三-芳基铵基烷基、二 -或三-芳基铵基芳基_、和二 -或三-烷基铵基芳基残基。此外，由氨基酸形成的带正电荷的或者包含叔胺或季铵基团的聚合物，例如聚赖氨酸、聚精氨酸或聚组氨酸、或者其共聚物或衍生物，也适合作为本发明范围内的阴离子交换材料，以及聚乙烯亚胺。
[0035]在本发明的尤其优选的实施方案中，所述装置包含用二乙氨基烷基或二乙氨基芳基残基改性的聚酰胺中空纤维材料，特别是二乙氨基乙基聚酰胺。[0036]此外，优选设置装置使得其能够作为现有灌注系统的可更换的滤筒使用。其可以容易地被插入到灌注系统中，并且，由于所使用的中空纤维材料的高结合能力和特异性，其可以具有小的体积，使得可以实现与目前已有的系统相比大大降低的死体积。令人惊讶的是，可以将本发明的装置制成尺寸为例如长12cm和直径5cm的滤筒，其可以非常有效地用于体外灌注系统中。在本实施例中的滤筒的死体积可仅为大约115ml。因此，在本发明的范围内优选使滤筒的尺寸实现< 150ml、优选80-130ml的死体积。
[0037]如可显示的那样，所述滤筒可以除去外毒素，特别是有效地和选择性地除去志贺毒素，除了本发明新发现的可能性之外，仅这么小的死体积就提供了相对于现有技术的令人惊讶的和显著的除去外毒素的优点，尤其是在一次性操作中同时除去志贺毒素和LPS。在治疗结束和装置的清洁之后或甚至在实施延长的(连续的)血液或血浆灌流之后，可以简单地插入一个新的滤筒。
[0038]在本发明的范围内，发现相关的中空纤维材料在生理学pH下通过吸附以高的选择性和能力从全血和/或血浆中清除外毒素，尤其是志贺毒素。
[0039]已经发现，甚至在生理学pH，只有较少的、组成安全的量的血液和血浆蛋白质被吸附。特别地，在本发明范围内仅有相当少量(< 2%)的纤维蛋白原被从患者的血液中除去，使得天然的凝血级联在使用本发明的装置时几乎没有受损。
[0040]因此，本发明的另一个目的是上述的和包含在本发明装置中的中空纤维材料用于制造用于从体液(特别是血液或血浆)中除去外毒素的装置的用途。
[0041]优选选自聚酰胺、聚砜、聚醚、聚乙烯、聚丙烯或聚酯、和这些材料的衍生物和/或混合物的用于本发明的中空纤维材料允许从患者的血液循环中清除外毒素，特别是志贺毒素，并由此可以有利地用于吸附性血浆分离置换装置中。通常，在这种装置中，首先将全血分离为血浆和微粒性血液组分，然后将血浆导向通过吸附材料，然后把微粒性血液组分返回到血浆中。
[0042]在一个优选的实施方案中，作为本发明的吸附剂使用的中空纤维材料是经过化学改性的，使得可以在其上发生最佳的外毒素吸附。尤其优选通过接枝聚合进行中空纤维的改性，并且优选阴离子交换基团的接枝，特别是以所谓的触须形式，即链状的、具有尽可能多的阴离子交换基团的支链分子的形式。
[0043]尤其优选的中空纤维材料是DEAE-改性的聚酰胺。
[0044]如上述已经描述的，对于本发明的装置，有利的是将装置设置为过滤器的形式，如有可能可以布置为一次性滤筒的形式，以确保容易的和安全的使用。
[0045]因此，本发明的另一个目的是本发明的装置或根据本发明生产的设备用于从体液(尤其是血液或血浆)中除去外毒素的相应用途。尤其有利的是，利用了本发明物质的装置被用于体外灌注系统，所述体外灌注系统提供细菌外毒素从患者血液的尤其有效的去除并使患者获得特别成功的治疗。此外，在本发明的应用过程中，外毒素以非常高的选择性被除去，而内源性蛋白质仅以非常小的程度被除去(即使有的话)，或者所述去除仅适用于可容易地被置换的蛋白质并且这种去除不会导致已经很虚弱的患者的显著应激。患者的治疗可以是治疗性的和/或预防性的。因此，本发明的治疗可用于感染致病性大肠杆菌的患者，以便治疗肠疾病以及与感染有关的后遗症，例如在EHEC感染情况下的HUS。所述治疗可以被认为是预防性的，因为它可以降低发展成HUS的风险。[0046]在本发明的范围内，还可以使用上述吸附材料用于外毒素、尤其是志贺毒素的分离、富集和检测。本发明物质的这种用途是本发明的另一个目的。所述分离、富集和检测可以从任何流体进行，优选从血液或血浆中进行，并且可以为了任何目的而操作，尽管尤其优选用于分析和/或诊断。
[0047]通过以下实施例进一步说明本发明。
[0048]实施例
[0049]实施例1:在体外条件下通过选择性吸附而除去志贺毒素
[0050]A)志贺毒素的制备
[0051]为了制备和富集志贺毒素，将大肠杆菌EHEC0104在包含以下物质的培养基中培养过夜:NaCl (10g/L)、胰蛋白胨(Triptone, 10g/L，Becton Dickinson)和酵母提取物(5g/L, Becton Dickinson)。在将悬浮液离心分离(200g, 30min)和将大肠杆菌沉降之后,获得志贺毒素2(Stx2)被高度浓缩的上清液。Stx2的浓度相当于4.06的“光密度”(0D450/620)。该数值是通过使用专用的ELISA检测试剂盒(Premier EHEC, Meridian Bioscience)测定的。
[0052]B)通过S.A.F.E.bt吸附装置灌注志贺毒素溶液(B.BraunMelsungen AG)
[0053]根据A)中所述的方法获得上清液的等分试样，其包含被以1:2比例稀释的Stx2。通过向吸附装置滤筒施加负压而将该溶液分别灌注通过S.A.F.E.bt吸附装置(4次)。得自相应灌注液的数据列于表1中。
[0054]表1:志贺毒素的清除率
[0055]
【权利要求】
1.用于治疗与腹泻有关的、以及如果适用的话与后遗症有关的肠疾病的物质，所述肠疾病是由产生外毒素的大肠杆菌引起的，所述物质包含改性的中空纤维材料，所述中空纤维材料选自聚酰胺、聚砜、聚醚、聚乙烯、聚丙烯、聚酯、及其衍生物和/或混合物，其中所述中空纤维材料经过改性而包含具有阴离子交换基团的触须，其中所述阴离子交换基团包含合成的聚阳离子链、半合成的聚阳离子链和天然的聚阳离子链中的至少一种，其中所述合成的、半合成的和天然的聚阳离子链是直链或支链的。
2.权利要求1的物质，其中所用的中空纤维是通过接枝聚合和/或化学固定来改性的。
3.权利要求1或2的物质，其中所述阴离子交换基团由包含叔胺或季铵的聚阳离子链组成。
4.上述权利要求任一项的物质，其中阴离子交换基团选自:二-或三-烷基氨基烷基、二-或三-烷基氨基芳基、二-或三-芳基氨基烷基、二-或三-芳基氨基芳基、二-或三-烷基铵基烷基、二-或三-芳基铵基烷基、二 -或三-芳基铵基芳基、二 -或三-烷基铵基芳基残基，衍生自氨基酸的带正电荷或者包含叔或季氨基的聚合物，如聚赖氨酸、聚精氨酸或聚组氨酸、或者其混合物或衍生物，或聚乙烯亚胺。
5.上述权利要求任一项的物质，其中所述中空纤维材料是用二乙氨基乙基改性的聚酰胺。
6.上述权利要求任一项的物质，其中所述中空纤维材料是尼龙。
7.上述权利要求任一项的物质，其中所述物质在一个装置中提供，所述装置被布置为过滤器模块形式。
8.权利要求7的物质，其中所述过滤器模块具有<150ml、优选80-130ml的死体积。
9.权利要求7或8的物质，其中所述装置允许最大为200ml/分钟的流速。
10.上述权利要求任一项的物质，其中所述装置设计为用于血浆灌流系统。
11.上述权利要求任一项的物质，其从患者的血液或血浆结合并除去毒素。
12.上述权利要求任一项的物质，其中所述治疗可以是预防性的和/或治疗性的。
13.上述权利要求任一项的物质，其中所述物质结合由肠出血性大肠杆菌、肠毒性大肠杆菌或肠聚集性大肠杆菌产生的外毒素。
14.上述权利要求任一项的物质，其中所述物质结合由肠出血性大肠杆菌产生的毒素。
15.上述权利要求任一项的物质，其中所述毒素属于志贺毒素家族。
16.上述权利要求任一项的物质，其中所述物质用于治疗由大肠杆菌产生的外毒素引起的腹泻和/或溶血性尿毒症综合征，所述外毒素优选为志贺毒素。
17.上述权利要求任一项的物质，其中所述物质同时结合外毒素和LPS，所述外毒素优选为志贺毒素。
18.权利要求1-17任一项的物质用于从任何流体非治疗性地分离、富集和/或检测由大肠杆菌产生的毒素的用途。
【文档编号】B01J41/04GK103842083SQ201280042706
【公开日】2014年6月4日 申请日期:2012年9月7日 优先权日:2011年9月8日
【发明者】D·赛德尔, B·R·耶格尔 申请人:安全Bt股份有限公司