专利名称：：水稻基腐病致病细菌毒素的制备方法及其应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及植物保护和生物
技术领域：
，具体涉及一种水稻基腐病致病细菌毒素的制备方法及其应用。
背景技术：
：植物病原毒素是病原物代谢过程中产生的，在生理浓度范围内，干扰植物正常生理功能的非酶类化合物。大多数毒素作为毒力因子增强病害的发生程度，有些毒素为病原物致病性所必需，属于致病因子。病原微生物毒素的研究不仅对揭示病害致病机理有重要意义，而且有着广泛的实际应用价值。(1)在抗病育种和品种抗性鉴定中的作用利用粗毒素作为选择压力进行品种(系)的抗病性测定，可加速杂交组合后代和抗性突变体的筛选，进而培育抗病的作物品种(系)，卢同等(2000)建立了用甘薯青枯菌粗毒素鉴定甘薯品种抗瘟性的良好方法。庞冬辉等(1995)用水稻稻瘟病菌产生的毒素获得了水稻抗病突变体。在杂交育种中，用毒素处理过的花粉粒授精可明显提高后代对毒素的忍耐力。(2)在植物病害化学防治上的应用植物病原菌毒素的研究为开发新型杀菌剂提供了理论上的依据。杀菌剂的作用方式可以是抑制病菌产生毒素或是钝化毒素，也可以是使寄主细胞的毒素受体失活。人们在弄清毒素结构的基础上，利用合成的与病菌毒素相拮抗的化学物质以毒攻毒的方式防治作物病害。1984年有人利用甘蔗眼斑病菌毒素结构类似的化合物(新型杀菌剂)或类毒素作用于病原体，部分地抑制或限制了甘蔗眼斑病菌产生的致病毒素。(3)毒素物质的利用及开发用毒素对某些种子的萌发具有促进或抑制作用将其进一步开发为作物的促生剂或化学抑制剂等。如小麦赤霉病菌毒素DON可以促进愈伤的生长、分化，在低浓度下可以促进再生植株的生长，表明DON在小麦愈伤组织的诱导和分化过程中有类似生长激素的作用。在用低浓度的棉花黄萎病菌毒素处理棉花可诱导棉株体内一些抗病酶系的活性，用稻瘟病菌毒素处理水稻可诱发苯丙氨酸解氨酶的活性。某些病原菌可产生胞外多糖、杂环类化合物、有机酸、蛋白脂多糖等人工难以合成的具天然活性的复杂化合物类毒素，在商业上具有一定的开发应用前景。利用非寄主专化性毒素可进一步研究开发生物除草剂，叶建仁等(1999)报道了松针褐斑病菌产生的毒素对空心莲子草、稞草等农田杂草有致萎性，为毒素的利用提供了新思路。张金林等(2000)研究发现，葱紫斑病菌C^^/77ar^产生的毒素对稗草有一定的抑制作用，可望开发成为除草剂。某些病原菌产生的毒素对人、畜有毒，可通过研究、模拟其合成途径来了解其作用机理，采取适当的措施控制其合成。细菌毒素也可以用于病害抗性工程的靶标，张炼辉(1999)曾证实在转基因甘蔗中表达毒素降解酶能明显提高甘蔗对病原细菌Za/z^,愿aMiJi/7e愿的抗性。本申请人首次发现一种病原细菌一水稻基腐病细菌(￡n^'/^3c力iT^rt力e孤'pK能产生毒素，该毒素对病菌的致病是必需的，具有对水稻秧苗致萎和烟草细胞坏死的作用。进一步发现，低浓度毒素能够诱导水稻抗病防卫酶活性，促进水稻、玉米、番茄和烟草等种子萌发和植物根、芽生长，同时，毒素还具有抑制植物病原细菌的作用。为此，建立该细菌毒素的提取、分离和纯化方法具有重要的研究意义和应用价值。
发明内容本发明的一个目的是替补现有技术的空白，提供一种水稻基腐病致病细菌毒素的制备方法。本发明的另一个目的是提供所述水稻基腐病致病细菌毒素的应用。本发明的目的通过以下技术方案实现提供一种水稻基腐病致病细菌毒素的制备方法，包括以下步骤(1)水稻基腐细菌致病菌株用培养液恒温振荡培养，离心，取上清液即粗毒素液；(2)粗毒素液经树脂吸附柱层析分离收集流出液，进行洗脱，并收集流分，室温风干得到活性组分；(3)活性组分经聚酰胺柱层析获得的有活性毒素组分，制备薄层层析，获得活性组分；(4)活性最强组分制备薄层层析，获得水稻基腐病致病细菌毒素。经以上四个步骤得到的水稻基腐病致病细菌毒素可以经葡聚糖凝胶柱层析纯化步骤得到纯化的单品。步骤(1)所述培养液pH7.0，培养液组成为lmol/L的NaOH9mL、10%CaCl2、2H206mL、腿032g、蔗糖10g、K2HP042g、KH2P040.5g和蒸馏水1000mL。步骤(1)所述恒温振荡培养是在30'C下振荡培养24h;所述离心是在4。C下10000Xg离心15min。步骤(2)所述洗脱溶剂为甲醇。步骤(3)所述薄层层析展开系统为甲醇水甲酸体积比为2:1:0.001。步骤(4)所述制备薄层层析展剂系统为甲醇水甲酸体积比为2:3:0.03混合液。本发明同时提供了所述水稻基腐病致病细菌毒素在促进农作物的种子萌发方面的应用，以及对植物病原细菌的抑制作用方面的应用和诱导水稻防卫酶活性方面的应用。前述水稻基腐细菌致病菌株是本申请人从广东佛山水稻田中，分离获得的产毒素的水稻基腐细菌致病菌株Ech7。本发明的有益效果是(1)本发明的无机盐培养液成分简单，成本低，细菌生长快，培养24h即可用于毒素的大量提取。(2)在水稻基腐病菌毒素分离纯化过程中，没有使用大量有机溶剂萃取的方法，避免了毒素化合物分解的可能，节省了有机溶剂的使用量；应用较安全的AB-8吸附树脂，能较好吸附细菌毒素，有效去除培养液中的无机盐成分，减少了粗毒素液浓縮歩骤，方法简便，采用制备TLC和葡聚糖凝胶方法，分离纯化效果好。(3)本发明获得的纯化毒素T3具有促进作物种子萌发后根芽生长、诱导水稻抗病防卫酶和抑菌植物病原细菌的显著作用。毒素T3有望进一步开发为作物的促生剂、植物保护诱抗剂及广谱的植物病害杀菌剂等。对该致病细菌毒素的获得，为今后筛选降解毒素的基因，用于抗病基因工程的靶标，奠定基础。具体实施例方式下面结合具体实施例来进一步说明本发明。实施例1(1)水稻基腐细菌致病菌株用培养液恒温振荡培养，离心，取上清液即粗毒素液；水稻基腐细菌Ech7，先在NA培养基斜面培养24h后，接种于无机盐培养液中，3(TC恒温振荡培养24h，4。C下10000Xg离心15min，弃沉淀，取上清液即粗毒素用于分离纯化。培养液配方lmol/L的NaOH9mL，10%CaCl22H206mL，NaN032g，蔗糖10g，K2,42g，KH2P040.5g，蒸馏水1000mL，pH7.0。(2)粗毒素液经树脂吸附柱层析分离收集流出液，进行洗脱，并收集流分，室温风干得到活性组分；选择安徽三星树脂有限公司的AB-8树脂粉，用20iranX300iim层析柱，每次将6L粗毒素上清液不断加入柱中，经树脂柱吸附后，收集流出液，收集完毕进行洗脱。洗脱时，依次用水、甲醇、乙酸乙酯和三氯甲烷洗脱并收集流分，每种洗脱溶剂收集约250mL。室温风干后，进行生物活性测定。粗毒素经AB-8树脂柱共收集了6L流出液，以及水、甲醇、乙酸乙酯和三氯甲烷洗脱液各250mL，生物活性测定结果表明，毒素活性组分在甲醇洗脱液中，见表l。表1吸附树脂洗脱活性测定<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>(3)活性组分经聚酰胺柱层析获得的有活性毒素组分，制备薄层层析，获得活性组分；选用20imiX300imi的层析柱，每次称取AB-8树脂柱甲醇洗脱流分活性组分1.2g和25g聚酰胺粉(200300目，浙江台州市路桥四甲生化塑料厂出品)。以甲醇水(含O.1%甲酸，V/V)系列浓度的混合溶剂进行洗脱。以20mL/瓶接取流分，所接流分经聚酰胺薄膜上检验后，选取Rf值相同或相近的流分合并，旋转蒸发仪抽去有机溶剂，室温风干，随即进行生物活性测定。实验结果聚酰胺柱层析，得到50个流分(F1F50)，共1000mL，经薄层层析，其展开系统为甲醇水(含0.1%甲酸，V/V)=2:1，TCL检测合并相同或相似的流分8个，经活性测定流分F3F9活性最强，结果见表2。该活性组分呈黄色。表2聚酰胺柱层析第一级洗脱活性测定流Fl-2F3-9F10-13F14-25F26-33F34-39F40-43F44-50分活一++++—————性注"一"，表示无活性；"+"，表示有活性；"+++"，表示活性较强(4)活性最强组分制备薄层层析，获得水稻基腐病致病细菌毒素。将聚酰胺柱层析获得的有活性毒素组分F3F9，制备薄层层析，展剂系统为甲醇水甲酸为2:3:0.03，在三用紫外分析仪360rM下检测，获得了6个不同组分，分别命名为Tl、T2、T3、T4、T5和T6，Rf值分别为8.2，6.7，5.5，3.8，2.8和1.7。切取T1T6各部分，甲醇洗下各部分，除去甲醇后，进行生物活性测定，结果表明，T3组分生物活性最强，紫外灯下呈黄色荧光，Rf值约为5.5，此外，T2(Rf值6.7)也有微弱活性，但不如T3活性强，结果见表3。表3制备TLC活性测定组分TlT2T3T4T5T6活性—++++—__注"—"，表示无活性；"+"，表示有活性；"+++"，表示活性较强实施例2步骤(1)至(4)同实施例1，完成上述步骤后，本发明将T3进一步纯化。即水稻基腐病致病细菌毒素经葡聚糖凝胶柱层析纯化步骤选择15咖X700腿层析柱，填料为葡聚糖凝胶S印hadexLH_20(Pharmacia公司进口原装)，先用甲醇平衡，每次过柱取0.lgT3活性组分，溶解于lmL甲醇中，小心上样，以甲醇作为流动相进行洗脱，每管2mL。收集50个流分，进行TLC，三用紫外分析仪360nm下对流分进行检测，流分120和流份3350均观察不到荧光，并无毒素生物活性，仅流分2132只有一个黄色斑点，且具有生物活性，表明已经获得较纯的毒素组分。实施例3毒素T3对植物种子的萌发作用将毒素T3配制成浓度为10ug/mL，5ug/mL，分别浸泡水稻、玉米、番茄、烟草等种子24h，以不加毒素为对照，每处理共150粒种子，3个重复。浸种24h后，将种子置于有湿滤纸的培养皿中，于3(TC培养箱中发芽，5d后测量种子萌发后的根、芽生长情况。结果表明毒素T3对水稻、玉米、番茄、烟草等种子的根芽生长具有明显的促进作用(p<0.05)见表4。表4水稻基腐病菌毒素对4类作物种子根、芽生长作用<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>表中数据用SAS软件进行分析，多重比较采用Duncan法，表中数值为平均值，其后为标准误，同列数据中相同字母的数据无显著性差异(P二O.05)实施例4毒素T3对植物病原细菌的抑菌作用供试病原细菌为番茄叶斑病菌(/^ew/o膨77a6Ti^'/2卵et。啦to)，根癌土壤杆菌(4groZ3cteri娜^//7e/acies)，青枯病菌(^/feJstozia5"o/a朋cear匿)，荧光假单胞(尸se〃(3b銜朋6"/7o"i"。6"ev75e)，甘蓝黑腐病菌(X朋z^。ffl。/75sc柳/e5^r7'61,.c湖pes^r/51)，海棠叶斑病菌(Z朋z^(9迈o朋51c柳/estri51Z6^。/7j'ae)，~^品红叶斑病菌(Z朋t/，。朋sca/w/es^rj'51,P(9i/7se"j'icoJa)，菜豆疫病菌(yTa/t/o膨/7351ca顺e5"tr7'61p力asecJi)，马铃墓环腐病菌(67a「i6scz^ari5ic力i^3/e/751平板抑菌测定方法是取一环培养24h的供试植物病原细菌，加5mL无菌水稀释，制成5X107CFU/mL菌悬液，取50uL涂布于细菌培养基平板上。取一灭菌滤纸小片，浸于T3毒素液(浓度20ug/mL)中，晾干，置于培养皿平板中间，于3(TC培养2d，观察并测量记录抑菌圈直径。结果表明水稻基腐病菌毒素对供试的10种植物病原细菌都表现不同程度的抑菌作用，表明该毒素作用的广谱性，其中对水稻白叶枯病菌和甘蓝黑腐病菌的抑菌作用最强，抑菌圈直径分别为15mm和14mm，见表5。表5毒素对植物病原细菌的抑菌作用<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>实施例5毒素T3诱导水稻防卫酶活性过氧化物酶(POD)和苯丙氨酸解氨酶(PAL)是防御酶系中重要的生理生化指标。许多研究已经表明，POD和PAL为参与植物抗性反应的重要酶，能促进木质素的合成，提高组织的木质化程度，从而促进植物的抗病能力。其活性可作为植物抗病性的一项生理生化指标。本发明在水稻第4片叶完全展开时，以压伤斑法处理水稻品种128，每处理6片叶，每片叶8个压伤斑，压伤斑直径为2ran，在每个压伤斑上滴加2uL毒素T3(浓度2ug/mL)，分别于处理后12h、24h、48h、72h取样，冻存于-2(TC冰箱中。参照Schaffrath等(1995)方法进行POD活性测定，参照肖栓锁(1997)方法进行PAL活性测定。酶的活性用U/mgprot表示。本发明用水稻基腐病细菌毒素处理水稻后不同时间，水稻POD和PAL活性均显著高于清水对照(p<0.05)，表明毒素T3能明显诱导水稻防卫酶活性，见表6。表6毒素诱导水稻P0D和PAL活性<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>权利要求1、一种水稻基腐病致病细菌毒素的制备方法，其特征在于包括以下步骤(1)水稻基腐细菌致病菌株用培养液恒温振荡培养，离心，取上清液即粗毒素液；(2)粗毒素液经树脂吸附柱层析分离收集流出液，进行洗脱，并收集流分，室温风干得到活性组分；(3)活性组分经聚酰胺柱层析获得的有活性毒素组分，制备薄层层析，获得活性组分；(4)活性最强组分制备薄层层析，获得水稻基腐病致病细菌毒素。2、根据权利要求1所述的水稻基腐病致病细菌毒素的制备方法，其特征在于步骤(4)后还包括水稻基腐病致病细菌毒素经葡聚糖凝胶柱层析纯化步骤。3、根据权利要求1所述的水稻基腐病致病细菌毒素的制备方法，其特征在于步骤(l)所述培养液pH7.0，培养液组成为lmol/L的NaOH9mL、10%CaCl2、2H206mL、NaN032g、蔗糖10g、K2HP042g、KH2P040.5g和蒸馏水1000mL。4、根据权利要求1所述的水稻基腐病致病细菌毒素的制备方法，其特征在于步骤(1)所述恒温振荡培养是在3(TC下振荡培养24h;所述离心是在4。C下10000Xg离心15min。5、根据权利要求1所述的水稻基腐病致病细菌毒素的制备方法，其特征在于步骤(2)所述洗脱溶剂为甲醇。6、根据权利要求1所述的水稻基腐病致病细菌毒素的制备方法，其特征在于步骤(3)所述薄层层析展开系统为甲醇水甲酸体积比为2:1:0.001。7、根据权利要求1所述的水稻基腐病致病细菌毒素的制备方法，其特征在于步骤(4)所述制备薄层层析展剂系统为甲醇水甲酸为2:3:0.03。8、权利要求1或2所述制备方法制备得到的水稻基腐病致病细菌毒素的应用，其特征在于促进农作物的种子萌发的应用。9、权利要求1或2所述制备方法制备得到的水稻基腐病致病细菌毒素的应用，其特征在于对植物病原细菌的抑制作用方面的应用。10、权利要求1或2所述制备方法制备得到的水稻基腐病致病细菌毒素的应用，其特征在于诱导水稻防卫酶活性方面的应用。全文摘要本发明公开了一种水稻基腐病致病细菌毒素的制备方法，水稻基腐细菌致病菌株经无机盐培养液培养后离心取上清液，经AB-8吸附树脂柱、聚酰胺柱层析、制备薄层层析、葡聚糖凝胶获得毒素纯品T3。本发明的无机盐培养液成分简单，成本低，细菌生长快，培养24h即可用于毒素的大量提取，在水稻基腐病菌毒素分离纯化过程中，避免了使用大量有机溶剂，减少了粗毒素液浓缩步骤，方法简便，分离纯化效果好，获得的纯化毒素T3具有促进作物种子萌发后根芽生长、诱导水稻抗病防卫酶和抑菌植物病原细菌的显著作用，有望进一步开发为作物的促生剂、植物保护诱抗剂及广谱的植物病害杀菌剂等，为今后筛选降解毒素基因用于抗病基因工程的靶标奠定重要基础。文档编号C07K14/195GK101186638SQ20071003241公开日2008年5月28日申请日期2007年12月13日优先权日2007年12月13日发明者刘琼光,张静一,王振中,王玉涛,罗建军申请人:华南农业大学