一株核桃基腐病的拮抗细菌及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一株拮抗菌菌株，特别涉及一株拮抗核桃基腐病病原菌的枯草芽孢杆 菌及其应用。
【背景技术】
[0002] 核桃（Juglans regia L.)属落叶乔木，是我国重要的经济树种，具有丰富的营养 价值和保健功能，可制取食用油和制作各种食品。核桃作为新疆的第二大果树，栽培面积占 全疆林果总面积的四分之一，核桃产业已成为新疆农民致富增收的重要支柱产业之一。核 桃适生范围广，常被栽植于山区和田园，是重要的用材树种和生态树种。近几年，随着新疆 核桃种植面积逐渐扩大，大面积种植单一品种、管理粗放以及栽培模式等原因，病虫害问题 日益增多，核桃基腐病（Pythium oligandrum Drechsler)的大面积严重发生制约了新疆核 桃产业的健康发展。
[0003] 目前，防治核桃基腐病的方法主要以化学方法为主，通过大田试验筛选出了咪酰 胺等防效较好的药剂。常规的化学药剂在防治核桃基腐病方面，有经济、高效和方便等优 势，但其易环境污染，不利于打造生态健康果园。最近几年通过生防菌株防治果树病害已成 为一种重要的防治手段，目前应用较多的拮抗细菌主要有芽孢杆菌Bacillus SUbtiliS、假 单胞杆菌Pseudomonas spp·、土壤放射杆菌Agrobacterium radiobacter等。然而通过诘 抗菌株防治核桃基腐病的研宄尚未见报道。因此，筛选出抗菌谱广、生防活性高及对环境安 全的新型拮抗细菌，制备成高效的生防菌剂，对该病害的防治具有重要意义。本研宄将从分 离核桃基腐病病原菌过程中得到的细菌与病原菌通过平板对峙培养法筛选出抑制效果较 好的生防细菌，并对其进行种类鉴定，为生防菌株的进一步开发利用奠定基础。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的问题，提供一种防治核桃基腐病 的拮抗菌菌株。
[0005] 本发明进一步提供含有上述菌株作为有效菌，可作为生物防治菌剂对核桃基腐病 进行防治。
[0006] 本发明进一步提供利用上述生物防治菌剂的防治方法。
[0007] 本发明人等从新疆和田地区墨玉县采集的核桃基腐病病害标本中分离出一株枯 草芽孢杆菌株，发现该菌株对植物生长无不良影响，具有抑制核桃基腐病病原菌的效果，并 由此完成了本发明。
[0008] 本发明涉及以下的菌株和核桃基腐病生物防治剂，以及核桃基腐病防治方法。
[0009] (1)枯草芽孢杆菌菌株GY-Il。
[0010] (2)核桃基腐病生防剂，其特征在于含有芽孢杆菌菌株GY-Il作为有效菌。
[0011] (3)核桃基腐病防治方法，其特征在于使用上述（2)中记载的核桃基腐病生防剂。
[0012][枯草芽孢杆菌菌株GY-Il的分离与保藏]
[0013] 本发明的枯草芽孢杆菌菌株GY-Il是从新疆和田地区墨玉县采集的核桃基腐病 病害标本中分离出的菌株。
[0014] 具体的，本发明是通过以下步骤得到核桃基腐病拮抗菌菌株GY-Il的：
[0015] 拮抗菌株的分离：将核桃基腐病病害标本材料的病健交界部位切成5mm的组织 块，先用75 %乙醇消毒该组织块30s，立即取出，再置于1 %次氯酸钠消毒90s，最后用无菌 水冲洗3次后，利用灭菌滤纸将组织块表面的水吸干，得到消毒后的组织块。将消毒后的组 织块在PDA培养基上进行培养，28°C恒温培养，每24h观察一次，使用划线法将长出的细菌 菌落纯化在NA平板上，得到单菌落，最后将得到的单菌落于4°C保存。
[0016] 拮抗菌株的筛选：将分离得到的单菌落进行活化培养，在距离病原菌2. Ocm处等 距离地将所述单菌落划线至已接种核桃基腐病病原菌的PDA平板上，以只接病原菌的PDA 平板培养基为对照，每个处理3个重复。28°C恒温培养，待对照的平板培养基的菌丝即将长 满时，测量细菌菌株与病原菌之间的抑菌带宽度，选取得到对核桃基腐病病菌抑菌带最宽 的拮抗菌株GY-Il。
[0017] 其中，所述PDA培养基的配方是去皮土豆200g，葡萄糖17g，琼脂15g，蒸馏水 lOOOmL，pH 自然。
[0018] 其中，所述NA培养基的配方为：蛋白胨10g，牛肉膏5g，NaCl 5g，琼脂15g，蒸馏水 1000mL? pH 7. 2〇
[0019] 该菌株根据其后所述的培养特征和生理生化特征，参考《常见细菌系统鉴定手册》 和《芽孢杆菌属》的描述，结合分子生物学结果确定拮抗菌株GY-Il为枯草芽孢杆菌，于 2015年5月14日作为"枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis)GY-ll"保藏于中国微生物菌 种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC);保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号 院3号，中国科学院微生物研宄所。
[0020] (a)形态学性质
[0021] 形态：杆状
[0022] 单细胞大小：0· 7 ~0· 8 μπιΧ2 ~3 μπι
[0023] 运动性：+
[0024] 鞭毛着生状态：周生
[0025] 芽孢形态：椭圆
[0026] 芽抱大小：0· 6 ~0· 9 X I. 0 ~1. 5 μ m
[0027] (b)培养性质
[0028] 菌落形状：圆形
[0029] 菌落颜色：乳白色
[0030] 液体培养基培养：乳白色，白色边缘不圆滑似圆形，表层不规则突起，褶皱明显。
[0031] (C)生理学性质
[0032] 革兰氏染色：+
[0033] 接触酶试验：+
[0034] VP 实验：+
[0035] 甲基红试验：+
[0036] 淀粉水解：+
[0037] 柠檬酸的利用：+
[0038] 卵磷脂试验：-
[0039] 菌膜形成试验：+
[0040] 吲哚物质的生成：-[0041] 好氧兼性厌氧测定：_
[0042] 硫化氢的产生：_
[0043] 硝酸盐的还原：_
[0044] 2% NaCl ：++
[0045] 5 % NaCl ：++++
[0046] 7% NaCl ：++++
[0047] 10% NaCl ：++
[0048] 需要说明的是，" + "代表阳性，代表阴性，"++"代表生长一般，"++++"代表生 长最适。
[0049] (d)化学分类学性质
[0050] 菌株GY-11与枯草芽抱杆菌Bacillus subtilis的16SrDNA序列同源性为99%， 在GenBank注册的序列号为KP876486。从基于邻接法构建的16SrDNA系统发育树（如图 4所不）可以发现；菌株GY-Il与模式菌株枯草芽孢杆菌（KF496886)聚类在同一大分支内 (支持率99% )，并结合菌株的形态学及生理生化特征，最终确定菌株GY-Il为枯草芽孢杆 菌 Bacillus subtilis。
[0051] [GY-11菌株的培养]
[0052] 有关本发明的GY-Il菌株的培养方法可以选择任何适宜的培养基和培养条件。此 外，除液体培养基之外可以使用加入了琼脂的斜面培养基和平板培养基等固体培养基。通 过培养使GY-Il菌株增殖以获得所需的菌体量。
[0053] 培养基中的碳源可以利用所述GY-Il菌株可以同化的所有物质。具体地说，除葡 萄糖、半乳糖、D-土塘、蔗糖、麦芽糖、麦芽提取物、淀粉水解物等糖之外，还有GY-Il可以利 用的各种合成或天然碳源，但是不包括乙酸。
[0054] 培养基中的氮源，同样的，除含有有机氮的蛋白胨、酵母提取物、硫酸铵、谷氨酸、 酵母膏、磷酸二氢铵、硝酸钾、氯化铵、硝酸钙、天冬氨酸、亚硝酸钠之外，还可以是GY-Il菌 株可以利用的各种合成或天然氮源，但是不包括尿素。
[0055] 根据常规的微生物培养方法，必要时可以相应地添加 NaCl、磷酸盐等无机盐类、 钙、镁、铁等金属盐，维生素、氨基酸等微量营养源。
[0056] 培养可以在摇床培养、震荡培养、通气培养等好氧条件下进行。培养温度为20~ 40°C，优选25~30°C，进一步优选为25°C ;pH5~9,优选6~7,进一步优选为7 ;培养时间 24-48h，优选24h为宜，其中，摇床培养的转速为120-220r/min，优选160-200r/min，进一步 优选为180r/min。
[0057] [GY-11菌株的应用]
[0058] 对于本发明的枯草芽孢杆菌GY-11，使其培养物（含有菌体）或其处理产物（培 养物和其他成分混合物等）、或培养分离的菌体（培养物经离心分离所得的菌体或其他成 分的混合物等）及其处理产物（培养分离的菌体和其它成分的混合物等），以及有这些处理 产物（这些的经液体或固体稀释的稀释物）存在于根、茎、叶、种子等植物体上，或存在于栽 培土壤中，具有抑制核桃基腐病病原菌的性质。
[0059] 本发明的核桃基腐病生防剂是含有GY-Il菌株为有效菌的生防剂。在本发明的生 防剂可以使用GY-Il菌株，也可以将GY-Il菌株和其变异体一起使用。变异体是具有上述 GY-Il菌株的细菌学性质、具有核桃基腐病防治作用的物质，可以利用自然突变株、用紫外 线或化学诱变剂所得的突变株、或细胞融合株以及基因重组株。本发明中，在核桃基腐病生 防剂中所含的GY-Il菌株包括GY-Il菌株的变异体。
[0060] 本说明书