一种卢娜林瑞链霉菌及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，特别是指一种卢娜林瑞链霉菌及其应用。
【背景技术】
[0002] 链霉菌属（Str印tomyces)，其基内菌丝多分枝，一般横隔稀疏，很少断裂，常产生 各种水溶性或脂溶性的色素；气生菌丝比基内菌丝稍粗，为外鞘所包，气生菌丝部分分化成 直形、柔曲、钩环状至松敞或紧密螺旋形的孢子丝，时常含50个左右的孢子，短者含5~10 个孢子；孢子为节孢子，由菌丝断裂而成，有的脱去外鞘，有的携带外鞘或残余，外鞘决定 孢子的表面结构；DNA中的G+C克分子含量为69~76 %。本属菌种数最多，分类鉴定比较 困难，一般认为孢子丝的形状、孢子的表面结构、孢子的颜色和在有机培养基内是否产生类 黑色素是最主要的分类指征。它们在土壤中分布极广，大多在人工培养基上生长茂盛，少数 是植物致病菌。
[0003] 香蕉是为芭蕉科芭蕉属多年生草本植物，是热带、亚热带主要水果之一。由于香蕉 栽培区域广泛，导致多种病虫害的爆发，如香蕉枯萎病、香蕉炭疽病、叶斑病等等，其中尤其 以香蕉枯萎病危害最为严重，一旦大规模爆发，会给当地香蕉栽培带来毁灭性的打击。香蕉 枯萎病是一种由真菌侵染引起的土传病害。此病原菌为尖孢镰刀菌，是一种土壤习居菌，土 壤消毒，降低土壤中病原菌的数量是防治香蕉枯萎的重要手段之一。而本研宄通过对香蕉 枯萎病发病区的蕉园土壤中微生物进行筛选，以期得到抑制香蕉枯萎病菌的菌株。
【发明内容】
[0004] 本发明提出一种链霉菌及其应用，对多种病原菌均有抑制作用，抑菌效果显著。
[0005] 本发明的第一个方面提供一种卢娜林瑞链霉菌，命名为卢娜林瑞链霉菌 (Streptomyces lunalinharesii)B_03,于2015年3月23日保藏于中国典型培养物保藏中 心，地址为湖北省武汉市武汉大学内，保藏编号为CCTCC NO !M2015148。
[0006] 所述卢娜林瑞链霉菌B-03的16S rRNA基因序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0007] 本发明的第二个方面是提供本发明第一个方面所述的卢娜林瑞链霉菌B-03在制 备防治香蕉枯萎病菌制剂中的应用。
[0008] 本发明的第三个方面是提供本发明第一个方面所述的卢娜林瑞链霉菌B-03在制 备抑制香蕉炭疽菌、香蕉长形叶斑病、香蕉大灰斑病、贡蕉眼斑病、香蕉叶缘枯萎病、荔枝炭 疽菌的制剂的应用。
[0009] 本发明的第四个方面是提供一种卢娜林瑞链霉菌菌株发酵液，将本发明第一个方 面所述的卢娜林瑞链霉菌B-03接种于大豆粉发酵培养基28°C培养3~5d后得到发酵种子 液，将所述发酵种子液接种于豆饼培养基中，28°C~30°C，ISOrpm震荡培养7~10d，得到所 述的菌株发酵液。
[0010] 进一步，所述的大豆粉培养及的组成，按重量份记为：大豆粉5~10份、NaCll~5 份、CaC03 1~3份、蛋白胨2~5份、葡萄糖5~10份；所述大豆粉培养基pH值为7. 0~ 7. 5 ;所述的豆饼发酵培养基的组成，按重量份记为：红糖180~200份，豆饼50~70份，水 800 ~1200 份。
[0011] 本发明的第五个方面是提供一种卢娜林瑞链霉菌菌株发酵液在制备抑制尖孢镰 刀菌1号小种、尖孢镰刀菌4号小种和胶孢炭疽菌制剂的应用。
[0012] 本发明的第六个方面是提供一种卢娜林瑞链霉菌菌株发酵液在制备抑制香蕉枯 萎病制剂的应用
[0013] 进一步，将本发明第六个方面所述的菌株发酵液稀释后，直接施用于大田作物。
[0014] 进一步，所述的菌株发酵液稀释50~100倍后灌根或者地面喷施。
[0015] 本发明所述的卢娜林瑞链霉菌菌株，经多项鉴定，确定为卢娜林瑞链霉菌 (Streptomyces lunalinharesii)B_03,并于2015年3月23日在中国典型培养物保藏中心 (CCTCC)进行了菌种保藏，并证明存活，保藏地址为中国湖北省武汉市武汉大学内，保藏编 号为 CCTCC NO :M2015148。
[0016] 本发明的有益效果：
[0017] 本发明所述的卢娜林瑞链霉菌B-03,对香蕉枯萎病菌具有较好的抑制作用，制备 的菌株发酵液施用在盆栽香蕉苗上，对香蕉枯萎病具有显著的防控效果。此外，本发明所述 的链卢娜林瑞链霉菌同时对香蕉炭疽菌、香蕉长形叶斑病、香蕉大灰斑病、贡蕉眼斑病、香 蕉叶缘枯萎病以及荔枝炭疽菌等病原菌也具有较好的抑制作用，具有广泛的抗菌效果，对 于植物病害的综合防控，尤其是香蕉栽培过程中多发、高发病害的综合防控，具有重大的意 义。
【附图说明】
[0018] 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现 有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本 发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可 以根据这些附图获得其他的附图。
[0019] 图1为卢娜林瑞链霉菌B-03在不同培养基上的生长状态图片；
[0020] 图中，ISPl为高氏一号培养基；ISP2为酵母膏麦芽膏琼脂培养基；燕麦片ISP3为 琼脂培养基；ISP4为无机盐淀粉琼脂培养基；ISP5为葡萄糖-天冬素琼脂培养基；ISP6为 蛋白胨-酵母浸膏琼脂培养基；ISP7酪氨酸琼脂培养基。
[0021] 图2为卢娜林瑞链霉菌B-03对贡蕉眼斑病菌抑制活性检测图片；
[0022] 图3为卢娜林瑞链霉菌B-03对荔枝炭疽病菌抑制活性检测图片；
[0023] 图4为卢娜林瑞链霉菌B-03对香蕉大灰斑病菌抑制活性检测图片；
[0024] 图5为卢娜林瑞链霉菌B-03对香蕉枯萎病菌抑制活性检测图片；
[0025] 图6为卢娜林瑞链霉菌B-03对香蕉叶缘枯萎病菌抑制活性检测图片；
[0026] 图7为卢娜林瑞链霉菌B-03对香蕉长形叶斑病菌抑制活性检测图片；
[0027] 图8为卢娜林瑞链霉菌B-03对香蕉炭疽菌抑制活性检测图片；
[0028] 在图2~图8中，a为卢娜林瑞链霉菌B-03菌株，b为贡蕉眼斑病病菌，c为荔枝 炭疽病菌，d为香蕉大灰斑病菌，e为香蕉枯萎病病菌，f为香蕉叶缘枯萎病菌，g为香蕉长 形叶斑病菌，h为香蕉炭疽菌。
[0029] 图9为采用生物自显影薄层色谱法检测卢娜林瑞链霉菌B-03发酵液原液对不同 病原菌的抑制作用图片。
[0030] 图9中，A为胶孢炭疽菌，B为尖孢镰刀菌1号小种，C为尖孢镰刀菌4号小种。
【具体实施方式】
[0031] 下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完 整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于 本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他 实施例，都属于本发明保护的范围。
[0032] 一、菌株的筛选
[0033] 分别于海南省南宝镇新营农场枯萎病发病区的蕉园取土壤样品。取样方法为每个 田块采用五点随机取样混合为一个样品，采集香蕉植株根围土壤（IOcm~30cm 土层）。从 田间采集的新鲜样品放入塑料样品采集袋中，并置于冰盒中，带回实验室置于4°C冰箱中保 存备用。
[0034] 采用梯度稀释法将上述土壤样品制成KT2~KT4浓度梯度系列悬浮液，放线菌的 分离，采用高氏一号培养基（使用前要加入3%重铬酸钾抑制细菌、真菌的生长）；细菌的分 离，采用LB培养基和KT 4~KT6稀释度。用移液器分别吸取上述不同稀释度的溶液0. lmL， 滴加于培养基平板上，用L型玻棒涂布均匀，稍晾干，培养皿倒置，于25~28°C温箱中培养 2~5d，根据平板上长出的菌落的颜色、形态、大小的细菌、和放线菌的单菌落挑出到新的 培养基上进行纯化培养，对纯化后的菌株分别编号，保存并记录不同样品分离到的菌株数 目。
[0035] 采用平板对峙培养法，检测上述分离到的各种细菌、放线菌菌株（以下称"待测菌 株"）对尖孢镰刀菌4号生理小种（以下称"靶标菌株"）的抑菌活性，用打孔器（直径6mm) 在提前3d活化并培养好靶标菌株菌落边缘切取菌丝块，并转接在另一个PDA平板中央，再 将活化后的待测菌株接种在距靶标菌株菌丝块2~3cm处，每平板接种四个待测菌株，以不 接任何待测菌株的靶标菌株为对照，每个菌株三次重复。25~28°C恒温培养一段时间后， 测量待测菌株与靶标菌株之间的抑菌带宽度，筛选出对尖孢镰刀菌4号生理小种具有拮抗 作用的菌株B-03。
[0036] LB培养基组成：胰蛋白陈10. 0g、酵母粉5. 0g、NaCl 10. 0g、琼脂17~20.0 gdK 1000.0 mL，用lmol/L NaOH调pH值至L 5。不加琼脂的为LB培养液。
[0037] PDA培养基组成：马铃薯200. 0g、葡萄糖20. 0g、琼脂粉17~20. 0g、水1000.0 mL。
[0038] 二、菌株的鉴定
[0039] L菌株B-03的16S rDNA基因序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0040] 2.菌株B-03的16S rDNA基因测序BLAST结果如下表1所示。
[0041] 表1菌株B-03的16S rDNA基因测序BLAST结果
[0042]
[0043]
[0044]
[0047] 4.菌株B-03的生长情况和形态
[0048] 在不同的培养基分别培养分离得到的链霉菌菌株，比较其培养性状，如表2所示， 菌株在不同培养基的培养性状如图1所示，菌种显微镜（1000X)下照片如图2-7所示。培 养基按照以下配方配制。
[0049] 高氏一号培养基（ISPl):可溶性淀粉 20. 0g、NaCl 0· 5g、KNO3 I. 0g、K2HPO4 · 3H20 0.5g、MgS0 4·7Η20 0.5g、FeS0 4·7Η20 O.Olg、琼脂 15-20g、H20 1000mL。大豆粉发酵培养 基：大豆粉 10. 〇g、NaCl 2. 5g、CaC03 2. 0g、蛋白胨 3. 0g、葡萄糖 10. 0g，pH 7· 2 ~7· 4。
[0050] 酵母膏麦芽膏琼脂培养基（ISP2):酵母膏10g、麦芽浸粉10g、葡萄糖4g、pH 7· 3。 燕麦片琼脂培养基（ISP3):麦片20g，微量盐溶液lmL。
[0051] 无机盐淀粉琼脂培养基（ISP4):淀粉 10g、K2HP04lg、MgS0