专利名称：用于水稻细菌性谷枯病菌检测的引物对及检测方法
技术领域：
本发明涉及生物检测技术，具体地说涉及水稻细菌性谷枯病菌检测用引物和检测方法。
背景技术：
水稻细菌性谷枯病(Bacterial grain rot of rice)是由颖壳伯克氏菌(Burkholderia glumae)引起，是近年来一种危害严重的水稻种传病害，它不但侵害谷粒，而且还引起水稻秧苗腐烂，造成水稻的严重减产和损失。种子带菌是该病菌远距离传播的主要途径，播种带菌病谷粒，遇有适宜的发病条件，如高温多日照，降雨量少易发病。病菌可通过气孔和伤口侵入，病菌在植株体内繁殖，在细胞间扩散，引起叶鞘薄壁组织的分解。
1970年代后期由于推行机械化生产而进行大面积的工厂化育秧，导致B. glumae引起的水稻苗腐病大流行，目前该病已成为日本水稻最严重的病害之一，并造成传播流行。目前水稻细菌性谷枯病已经蔓延到印度尼西亚、泰国、越南、韩国、斯里兰卡、马来西亚、菲律宾等东南亚国家及南美洲的哥伦比亚等国。非洲的坦桑尼亚及美国的路易安那洲相继报告有该病发生。Shahjahan等报道该病在美国可导致15 80X的产量损失。我国台湾地区1983年也有水稻细菌性谷枯病的发生报道并在病原及品种抗性方面做过一些研究。也曾有报道我国贵州省有细菌性谷枯病的发生，但未得到进一步的证实。
近年来，随着我国农业产业的多样化和引种种植及加工贸易的发展，我国农业种子出入境贸易在品种和规模上都逐年增长。目前我国有几十万吨水稻种子出口到国外，也有水稻、玉米等多种种质资源进口 ，经济一体化和引种种植等，我国对外的种子贸易逐年加大。水稻细菌性谷枯病随种子和相关材料从境外传入我国的风险加大。据报道，在具有枯萎症状的胡椒、番茄、马铃薯、茄子、紫苏、芝麻和向日葵中都分离到了B. glumae菌，说明其传入的潜在风险进一步加大。我国杂交水稻种子出口到多个国家，印尼等一些国家对我国的杂交水稻种子提出了细菌性谷枯病的检测要求，从检疫上也制约了我国水稻种子的进入。为了严格控制水稻细菌性谷枯病传入我国，严重危害我国的水稻种植和农业生产安全，我国必须加强对多种植物种子和材料的水稻细菌性谷枯病的检疫和控制。目前我国尚无水稻细菌性谷枯病的检测方法和相关的病理材料，极不适应我国检验检疫部门在种子出入境检疫中对该病的检测和控制。 日本、韩国、美国、越南等国已有多起细菌性谷枯病分离和危害的报道。日本和韩国由于Burkholderia glumae.对水稻的危害严重，在病原和危害发生等方面进行了较多的研究。1986年Tushima， S. ， S. Wakimoto，等研究了检测Burkhol deria glumae的检测性培养基；2000年，Mitsuo K， Kiyotsugu. 0等研究用于分离Burkholderia glumae的选择性培养基；1987年Wakimoto S.等对Burkholderia glumae特异性的血清学方面行了研究。Won, So-Yo皿，Lim， Jae-Yoon等对Burkholderia glumae全基因序歹腿行了分析；Jeong，Yeonwa， Kim， Jinwoo等确证了从多种萎蔫症植物中分离到Burkholderia glumae并提出其毒黄菌素与其产生腐根和烂种病理症状相关；日本学者Yukiiko Maeda等用MAMA-PCR方法检测Burkholderia glumae中的抗oxolinic acid基因。Schaad. N. W等在PLANTPATHOGENIC BACTERIA (Third Edition 2001)中就伯克氏菌的检测进行了论述。在检测方法方面，一些学者已建立了 Burkholderia glumae分离培养及细菌学鉴定方法，也有关于Burkholderia glumae的分子生物学检测的研究和报道，Ronald J. Sayler等曾设计了检测水稻细菌性谷枯病菌的引物及探针，并采用常规PCR方法和实时荧光PCR方法对水稻细菌性谷枯病菌进行了检测，Toru Takeuchi等也曾设计了一对检测水稻细菌性谷枯病菌的引物。 水稻细菌性谷枯病在我国还属于一种新病害(除台湾外)，被国家质检总局纳入了《中华人民共和国进境植物检疫性有害生物名录》。我国对于Burkholderia glumae的研究很少，病原材料和研究资料也相当缺乏。浙江大学谢关林等人在进行水稻谷枯病的风险分析研究。目前我国缺乏水稻细菌谷枯病的检测方法和标准。
发明内容
本发明目的在于提供用于水稻细菌性谷枯病菌双重PCR-DHPLC检测的引物和方法。 本发明通过已报道的水稻细菌性谷枯病菌ITS区域序列(genebank D87080)和gyrB基因(genebank AB207074)序列，设计了用于本发明的引物对，所述的两对由正向和反向引物组成的引物对，其核苷酸序列分别为
SEQ ID NO. 1 :5' -ACACGGAACACCTGGGTA-3'
SEQ ID NO. 2 :5' -TCGCTCTCCCGAAGAGAT-3，
SEQ ID NO. 3 :5' -GCAGCGGCAAGGAAGACG-3'
SEQ ID NO. 4 :5， -GTCGTCGCCCGACGTCTC—3，。 本发明还给出了应用上述引物的双重PCR-DHPLC方法，其以细菌DNA为模板，进行双重PCR扩增，扩增后的PCR产物直接进行DHPLC分析。 其反应体系为10XTaq buffer 2. 5 ii L， dNTPs (lOmmol/L) 0. 5 ii L，MgCl2(25,l/L)2iiL，10iimol/L弓l物各l.OiiL， Taq DNA polymerase (2U/ii L) 1. 0 ii L，lng/ ii L 10ng/ ii L DNA模板5 y L，以灭菌双蒸水补足至25 y L。 其中，上述反应条件可以是96。C预变性5min ;96。C变性30s， 55。C退火30s， 72°C延伸30s，循环反应30次；72。C延伸5min。 DHPLC分析条件设定为进样量5iiL，柱温50。C，起始A液(0. lmol *L—'三乙胺乙酰盐)浓度为44. 8%， B液(0. lmol L—1三乙胺乙酰盐和25%乙腈)浓度为55. 2%，起始时间为0. 5min，结束A液浓度为35. 8% ，B液浓度为64. 2% ，结束时间为5min，流速0. 9mL/miru 本发明还建立了进一步对双重PCR-DHPLC分析得到结果阳性的PCR产物进行鉴定的DHPLC分子鉴定体系和分子标本。即以引物SEQ ID NO. 3和4扩增水稻细菌性谷枯病菌菌株DNA的PCR产物作为PCR-DHPLC鉴定方法的标记物。未知扩增产物通过与该标记物进行半变性DHPLC分析可以对未知菌进行水稻细菌性谷枯病菌的鉴定。DHPLC检测条件为设定片段大小为317bp，每次进样5 ii L，检测温度Tm = 64°C ，以流速0. 9mL min—1进行分析。
4
本发明还提供含有所述弓I物的试剂盒。 进一步，本发明提供的试剂盒中还有引物SEQ ID N0.3和4扩增的阳性片段。
本发明设计用于检查水稻细菌性谷枯病菌的引物特异性好，检测灵敏度高，本发明的检测方法准确性高、灵敏度高，其能够快速简单地判断样品是否有水稻细菌性谷枯病菌，为进出口安全提供了保证。
图1双重PCR-DHPLC检测水稻细菌性谷枯病菌DNA结果；
图2本发明方法灵敏度检测结果； 图3引物BGF3-BGR3扩增水稻细菌性谷枯病菌DNA片段DHPLC半变性检测。
具体实施例方式
下面实施例用于对本发明的进一步说明，但不用来限制本发明的范围。 实施例1 引物的设计和合成 根据报道的水稻细菌性谷枯病菌ITS区域序列(genebank D87080)，设计了引物序列为 SEQ ID NO. l(正向):5， -ACACGGAACACCTGGGTA—3，;
SEQ ID NO. 2(反向)5， -TCGCTCTCCCGAAGAGAT—3，。 根据报道的水稻细菌性谷枯病菌gryB基因(genebank AB207074)，设计了引物和探针，引物序列为 SEQ ID NO. 3(正向):5， —GCAGCGGCAAGGAAGACG—3，;
SEQ ID NO. 4(反向):5， -GTCGTCGCCCGACGTCTC—3，。
实施例2 杂交稻种中水稻细菌性谷枯病菌的分离 选用文献报道的水稻细菌性谷枯病菌半选择性分离培养基S-PG琼脂培养基对水稻材料中的病菌进行分离培养。细菌性谷枯病菌在S-PG上呈现两种生长形态，一种菌落为红褐色、圆形、光滑、隆起；另一种菌落为淡紫色、圆形、光滑、隆起。
样品处理方法 大量种子样品先用蒸馏水冲洗后，称取10g或400粒种子放入90mL 0. 001 %吐温_磷酸盐缓冲液(pH7. 0)中低温(5°C 15°C )浸泡4 6h，用均质器打碎，制备样品提取液。如果是检测少量的种子样品，取20粒种子加入10mL灭菌的0. 001%吐温-磷酸盐缓冲液(pH7. 0)，用灭菌槌和研钵或是搅拌器将种子充分碾磨，制成提取液。
将样品提取液置于22°C 25t:环境中4 6h后，旋涡混匀悬浮液5min，悬浮液进行十倍梯度稀释，稀释后的IOX，和100X以及1000X三个稀释度的悬浮液取1. OmL，分别放入到5个S-PG平皿中(每个平皿加0. 2mL)。用L-型玻璃棒将液体均匀涂布在琼脂的表面。 接种后的平皿28°C 士rC培养2d 3d后观察生长菌落形态。
实施例3
细菌DNA的提取 1)直接挑取S-PG平板上生长的典型或疑似菌落至少5个至1. 5mL离心管中，加入lmL灭菌水充分振荡，12000g离心3min，弃上清，再向管中加入lmL灭菌水，重复三次，取沉淀进行DNA提取； 2)在沉淀中加入TE缓冲液600 ii L， 10% SDS溶液30 y L， 20mg/mL蛋白酶K15 y L，
混匀，37t:水浴孵育lh。 3)加入等体积的三氯甲烷-异戊醇(24 : l)，混匀。10000g离心5min，将上清液
移至一个新离心管中。4)加入等体积酚-三氯甲烷-异戊醇(25 : 24 : 1)，混匀，10000g离心5min，将
上清液移至一新离心管。 5)加入O. 6倍体积的异丙醇，轻轻混匀，-2(TC沉淀lh， 10000g离心5min，弃上清。
6)加入lmL70X乙醇洗涤沉淀，8000g离心，弃上清，晾干。
7)加入50 ii LTE缓冲液溶解DNA沉淀，-2(TC长期保存备用。
实施例4 双重PCR-DHPLC检测方法的建立 本方法选择了 8株购买自NCPPB的不同国家地区发生的水稻细菌性谷枯病菌菌株作为阳性对照，同时采用了水稻种子中分离的部分微生物、几种常见并与水稻细菌性谷枯病菌近缘的植物病原菌及部分其它植物病原菌做为参试菌株进行比较分析。供试菌株具体情况如表l。 表1供试菌及其来源
菌株菌种名称来源菌株编 号菌种名称来源
Al水稻细菌性谷枯病菌NCPPB2391CK6洋葱伯克霍尔德氏菌CGMCC 1. 1813
A2水稻细菌性谷枯病菌NCPPB2891CK7燕麦假单胞菌CGMCC 1. 1726
A3水稻细菌性谷枯病菌NCPPB3591CK8丁香假单胞菌黍致病变种NCPPB 1835
A4水稻细菌性谷枯病菌NCPPB3673CK9成团泛菌NCPPB 2274
A5水稻细菌性谷枯病菌NCPPB3674CK10胡萝卜软腐欧文氏胡萝 卜软腐变种CGMCC 1. 1000
A6水稻细菌性谷枯病菌NCPPB3708CK11水稻白叶枯病菌NCPPB 2446
A7水稻细菌性谷^t病菌NCPPB3923CK12水稻细菌性条斑病菌NCPPB 1632
A8水稻细菌性谷枯病菌NCPPB3924CK13西瓜细菌性果斑病菌NCPPB 4207
CK1唐菖蒲伯克霍尔德菌自然种子分离CK14玉米细菌性^ 萎病菌ATCC 29227
CK2黄单胞菌属菌自然种子分离CK15草生欧文氏菌NCPPB 1269
CK3假单胞菌属菌自然种子分离CK16梨火疫病菌ATCC 15580
CK4泛菌属自然种子分离CK17兰花褐斑病菌ATCC 10200
CK5洋葱软腐病菌ATCC 11662CK18番茄溃疡病菌ATCC 14456 对上述菌株进行DNA提取后，应用下述反应体系和条件进行双重PCR检测研究。所使用PCR仪器为Biometra公司产品。 反应体系10 X Taq buffer 2. 5 ii L， dNTPs (lOmmol/L) 0. 5 ii L， MgCl2 (25,1/ L) 2 ii L， 10 ii mol/L弓|物各1. 0 ii L， Taq DNA polymerase (2U/ ii L) 1. 0 ii L， lng/ ii L 10ng/ ii LDNA模板5 ii L，以灭菌双蒸水补足至25 y L。 反应条件96。C预变性5min ;96。C变性30s，55。C退火30s，72。C延伸30s，循环反 应30次；72。C延伸5min。 将PCR产物放入DHPLC进样室，洗脱液由缓冲液A(O. lmol *L—'三乙胺乙酰盐)和 缓冲液B(O. lmol *L—工三乙胺乙酰盐和25%乙腈)组成，在检测起始为时间0. 5min，洗脱液 A液起始浓度为44. 8% ，缓冲液B液起始浓度55. 2% ，检测结束时间为5min，洗脱液A液终 止浓度为35. 8% ，缓冲液B液终止浓度64. 2% ，柱温50°C ，系统自动按照线性递增的方式， 以流速0. 9mL min—1的流速将DNAS印柱上的DNA分子洗脱下来，波长260nm处读取吸光 值，经系统自动处理后，形成DHPLC峰型图谱，供分析鉴定。
特异性检测 采用提取得到的水稻细菌性谷枯病菌阳性菌株DNA和其它参试菌株DNA进行检
测，用水作为对照进行扩增。 试验结果 8株水稻细菌性谷枯病菌均扩增出明显的阳性峰，见图1。其它参试菌株DNA均无 阳性信号。 灵敏度检测 接种水稻细菌性谷枯病菌于100ml PSA液体培养基中，28。C震荡培养24h，用平板 计数法对菌浓度进行测定，并将培养液用生理盐水制成105、 104、 103、 102、 101 (CFU/mL) 5个稀 释梯度。提取DNA，进行双重PCR-DHPLC灵敏度检测。 试验结果如图2，利用本方法能有效地从含有4X 102CFU/mL的水稻细菌性谷枯病 菌的菌液中检测出该病原菌。 实施例5PCR-DHPLC分子标准体系的建立 通过鉴定8株水稻细菌性谷枯病菌DNA扩增产物序列的同源性是否一致，以期建 立统一的分子标本和分子标准体系。 采用DHPLC对同一对引物扩增得到的PCR产物间进行了序列半变性检测将每两 种同数量级浓度的PCR产物相互间按照1 : 1的比例混合，将混合产物及单一 PCR产物在 PCR仪上进行以下变性_复性过程95t:起始变性5min，94. 5"C变性20s，以后每20s —个 循环降低0. 5t:，缓慢降温到25°C，以形成同源或异源双链DNA分子混合物。将降温处理后 的PCR产物放入DHPLC进样室，输入被检测片段序列，设定每次进样5ii L。检测温度以该序 列片段的解链温度(Tm = 63. 9°C )为参照，分别选择柱温为64。C，设定片段大小317bp，以 流速0. 9mL min—、进行DHPLC分析。 通过变性并缓慢复性处理的PCR混合产物，进行半变性DHPLC分析结果为引物 SEQID NO. 1和2扩增8株阳性菌株DNA得到的PCR产物进行DHPLC半变性比较分析时， 部分阳性菌株出现非特异性的多峰，可能在扩增片段区间内存在部分位点的差异而影响 DHPLC分析结果；引物SEQ ID NO. 3和4扩增水稻细菌性谷枯病菌A1-A8DNA的PCR产物在 4. 27min(图3)左右均只出现一个明显的吸收峰，结果与相同处理后的单一 PCR产物结果一致。试验证明通过引物SEQ ID NO. 3和4进行PCR扩增后，各水稻细菌性谷枯病菌DNA 的PCR产物片段序列一致，同源性高，无突变位点。 因引物SEQ ID NO. 3和4扩增8株菌株的PCR产物序列均一致，可以建立起以引 物SEQ ID NO. 3和4扩增A1-A8中任意一株菌株DNA的PCR产物作为PCR-DHPLC鉴定方法 的标记物。将未知的片段大小一致或相近的PCR产物与分子标本进行变性并缓慢复性处理 后，进行DHPLC半变性分析。DHPLC鉴定条件为设定片段大小为317bp，每次进样5 y L。检 测温度Tm = 64°C ，以流速0. 9mL *min—、进行DHPLC分析。结果出现单一的峰型且其它峰 型正常情况下，可判断为水稻细菌性谷枯病菌。序列表〈110〉湖南出入境检验检疫局检验检疫技术中心〈120〉用于水稻细菌性谷枯病菌检测的引物对及检测方法〈130>PLH09659〈140>200910043810. 4〈141>2009-07-01〈160>4〈170>PatentIn version 3. 1〈210>1〈211>18〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>13C3cgg朋ca cctgggte〈210>2〈211>18〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>2tcgctctccc gaagagat〈210>3〈211>18〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>3gcagcggc朋gg朋gacg〈210>4〈211>18〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>4
gtcgtcgccc gacgtctc 18
权利要求
用于水稻细菌性谷枯病菌检测的引物对，其核苷酸序列为SEQ ID NO.15’-ACACGGAACACCTGGGTA-3’；SEQ ID NO.25’-TCGCTCTCCCGAAGAGAT-3’。SEQ ID NO.35’-GCAGCGGCAAGGAAGACG-3’；SEQ ID NO.45’-GTCGTCGCCCGACGTCTC-3’。
2. —种利用引物SEQ ID N0.3和4所扩增的阳性片段。
3. —种检测水稻细菌性谷枯病菌的方法，该方法以水稻细菌性谷枯病菌的DNA为模 版，利用权利要求1所述的引物进行双重PCR扩增，反应结束后应用DHPLC进行结果分析和 判定。
4. 如权利要求3所述的方法，其特征在于，双重PCR的反应过程中的退火温度为55°C。
5. 如权利要求3所述的方法，其特征在于，DHPLC检测过程中，检测片段设定大小为 317bp。
6. 如权利要求3所述的方法，其特征在于，DHPLC判定过程中，应用权利要求2中的 阳性片段作为分子标本并建立分子标准体系进行水稻细菌性谷枯病菌的判定，判定柱温为 64°C。
7. 含有权利要求1所述引物的试剂盒。
8. 如权利要求7所述的试剂盒，其还包括权利要求2所述的阳性片段。
全文摘要
本发明提供了两对水稻细菌性谷枯病菌检测用的引物，所述引物的核苷酸序列为SEQID NO.15’-ACACGGAACACCTGGGTA-3’；SEQ ID NO.25’-TCGCTCTCCCGAAGAGAT-3’和SEQ ID NO.35’-GCAGCGGCAAGGAAGACG-3’；SEQ ID NO.45’-GTCGTCGCCCGACGTCTC-3’。本发明还进一步提供了检测水稻细菌性谷枯病菌的方法，该方法对样品中水稻细菌性谷枯病菌进行分离，以细菌DNA为模板，利用上述引物进行双重PCR扩增，扩增产物进行DHPLC分析，得到的阳性结果，利用引物BGF3和BGR3扩增得到阳性片段作为的分子标本进行鉴定。本发明引物特异性好，检测方法准确性高，灵敏度高，为进出口安全提供了保证。
文档编号C12Q1/68GK101712982SQ200910043810
公开日2010年5月26日 申请日期2009年7月1日 优先权日2009年7月1日
发明者朱金国, 莫瑾 申请人:湖南出入境检验检疫局检验检疫技术中心