专利名称：：一种防治甜瓜细菌性斑点病的菌株及其在田间防病中的应用的制作方法一种防治甜瓜细菌性斑点病的菌林及其在田间防病中的应用发明领域本发明涉及生物防治领域，具体的说，本发明涉及一种防治甜瓜细菌性斑点病的菌4朱及其在田间防病中的应用。
背景技术：
：哈密瓜(俗称甜瓜)是驰名中外的新疆特产之一，在我国甜瓜生产中占有重要地位，在国内外都享有较高的声誉。但近十余年来，甜瓜细菌性病害一直是制约新疆甜瓜生产发展的主要障碍，尤瓜类细菌性叶斑病(/^ei/c^7朋^STr/^gse/ac力i"j27s/751)禾口纟田菌'I"生果腐病(Jc/t/c^oraxa7e/7ae5"w々57.c/""///)成为新疆哈密瓜生产中的严重病害。该病害一般发病率在30-40%，严重者达80%,甚至造成全田绝收，特别在6、7月份多雨年份，常可造成毁灭性损失。1965年Webb等人首先发现于美国佛罗里达州的西瓜上[6]。1978年，Schaad等人首次鉴定了美国佐治亚州的西瓜苗凋萎病病原为类产碱假单胞西瓜亚种(j9e5^i/o^;zao3s/^ewo^/cs//^^/^subsp.citrulliSchaadetal.1978)。1992年，该病原菌即类产碱假单胞西瓜亚种被重新命名为燕麦噬酸菌西瓜亚种(爿c/fl^raraxaze/^esubsp.citrulli)。1992年才艮才居该病菌的rRNA和DNA—DNA分子杂交结果，将其更名为JcA/oraraxsubsp.citrulli我国从1987年开始就不断有报道国内张荣意等人分离到的病菌某些生理生化性状与标准菌林不一致，他认为是不同地区间菌系的差异造成的；平文祥等人鉴定的病菌为芽孢杆菌，与其他参考文献均不相同；该病近年来在全国迅速蔓延，2000年8月美国农部马里兰州疫病杂草科研中心，植物病理专家Norman来新疆昌吉瓜田考察西瓜果腐病发生情况，西瓜上未釆集到BFB病菌，却在甜瓜细菌病叶上采集到BFB病菌，已将此菌林命名为FB-440,并被其收集。2001年，北京的赵廷昌等在内蒙古和新疆的哈密瓜上发现了细菌性果腐病。2002年新疆、内蒙古大面积暴发，张昕等人对哈密瓜细菌性斑点病病原进行了鉴定，认为侵染叶片的为丁香々支单月包菌黄瓜至丈病变种(/^ew^6waoas5yr/"^3eiac力r7/ffs/^)，而4曼染果实的病菌为p蓝酉臾菌(aKe刀aesi/6^a"7i7i/7/),^人为可負fe是细菌'l"生果腐病病害。目前对瓜类细菌性病害主要采取种植抗病品种、种子处理和农业防病措施，并辅之以化学防治的综防措施。如以广泛发生的黄瓜细菌性角斑病为例，人们通常采用种子处理(所用药剂一般为曱醛和次氯酸钠等)、加强田管、清除田园以及生育期采用药剂预防保护等，对于西瓜果腐病菌(Jci&rar^rsubsp.citrulli)，1993年Hopkins等对其进行了抗性品种选育，发现供试所有品种均发病，但感病程度有所不同，因此选用抗性较好的品种进行田间栽培是抑制病害发生的有利手段。勘;Cwcyzza和,t纟erso"(1996)的试验证明种瓜经过24-48h的发酵可将种子带菌率由61。/。减少到r/。以下。之后用P/。HCL或J7。CaOCL2处理,然后再水洗干燥是消除种子细菌污染最有效方法，且这种方法不影响种子的发芽。除HCL和CaOCL2外，其它的种子处理药剂还有农用链霉素、科博、升汞、抗菌剂"402"、新植霉粟等。生育期常采用化学防治与农业手段相结合的措施，所用杀菌剂主要有农用链霉素、新植霉素、琥珀肥酸铜、DT、甲霜铜、络同等铜制剂。此外据^^艮道加收米、科博对抑制病害的发生也有明显作用。目前，通用的农业防治措施均采取避免大水漫灌，降低田间湿度，增加通风透光等手段，创造不利病害发生的环境以减轻危害。另据报道土壤紧密度对甜瓜根表微生物种群有较大影响，土壤越紧实，荧光假单胞菌的数量就越高，而细菌总量并不随土:t襄紧密度的改变而改变("e&，7byo"a/2"hVz^r5)这为运用农业措施防治哈密瓜细菌性病害开辟了新途径。Z/w、i7oe;^e/f口n/w/7(1995)报道，培植促进生长的根瘤菌，能向黄瓜引入抗细菌性角斑病的系统抗性，这方面的工作也可在哈密瓜上试验。Wi^arage，化orar等(1995)运用PCR(polymeraseChainReaction)技术了能观测定Acidovraxavenaesubsp.citrulli存在的特异性引物和基本实验模板。2000年Walcott和itaitis采用免疫/f兹性分离法和PCR才支术才企测出西瓜种子中的Acidovraxavenaesubsp.citrulli，这为迅速而准确地检测种子是否带菌、并及早防除侵染源，防止其在田间定植做出了贡献。2004年，云、罗明等对哈密瓜内生细菌进行了分离，明确其种群、分布和数量动态，从中筛选对瓜类细菌性叶斑病和细菌性果腐病菌具有拮抗活性的生防菌林，从而为进一步利用内生生防菌资源，及开展拮抗菌生防机制的分子生物学和遗传改良等分子生物学研究奠定重要基础。目前，在传统的农业病虫害防治中，不少人对化学农药防治农作物病虫害已形成习惯，虽然起到了一定的防治效果，但其负面影响日趋严重。随着主要作物的病虫危害逐年加重，每年喷施的大量农药既加重了农民负担，增产不增收，又严重破坏了人类赖以生存的生态环境，还造成了食物中农药残留，危害人类健康。到目前为止，对植物真菌病害生物防治的研究已有许多相关报道，但对细菌性病害的生物防治研究较少，而且目前对甜瓜细菌性斑点病的生物防治国内外研究报道甚少，因此，以功能微生物为核心的生物防治方法前景广阔，已经成为国内外研究的热点。世界各国提出开发和使用绿色农药，开展生物防治农作物病虫害，对其进行系统而深入的研究，搞清该类病害的病原种类及发病规律并寻求安全有效的生物防治措施，对于甜瓜病害的控制，提高其产量和品质，确保新疆甜瓜生产的高产稳产具有重要的现实意义。
发明内容针对国内外有关本领域的研究现状，有关甜瓜细菌性斑点病拮抗菌的研究工作刚刚开展，有关甜瓜细菌性斑点病拮抗菌的研究报道甚少。本发明提供一种防治甜瓜细菌性斑点病的生防菌林-多粘类芽孢杆菌抹及其在田间防病中的应用。所述的多粘类芽孢杆菌防病方法较传统的化学防治具有效果好、成本低、使用安全、不污染环境等特点。针对甜瓜细菌性病害一直是制约甜瓜生产发展的主要障碍，为有效控制甜瓜的病害，提高其产量和品质，甜瓜生产的高产稳产具有重要的现实意义。本发明提供的一林甜瓜细菌性斑点病拮抗菌菌抹，通过在新疆昌吉及吐鲁番甜瓜地健康甜瓜植抹根际的土壤样本分离、筛选和培养，获得一批具有拮抗作用的微生物菌林，从中筛选出一株编号为G-14的菌林，从而提供了一种甜瓜细菌性斑点病拮抗菌林，其具有稳定而显著的防病效果，经微生物学分类与鉴定，属于类芽孢杆菌属的多粘类芽孢杆菌(/^e//^d7/^/7o////xa)。本发明在获得的多粘类芽孢杆菌(/^e/7/^c///^po/j^rxa)的基础上，提供了一种甜瓜细菌性斑点病的生物防治应用方法。本发明提供了一种甜瓜细菌性斑点病的生防菌林，命名为G-14,其能够产生稳定而显著的拮抗作用。该菌抹已于申请日前保藏于布达佩斯条约微生物国际保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)。地址北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，邮编100101。保藏日期是2007年11月12日，保藏号是CGMCC.No2250。经微生物学鉴定为多粘类芽孢杆菌(/^ew'^c///^;w/y/z/j^3)。该菌株生长于改良的牛肉膏蛋白胨培养基上菌落呈象牙白色、圓形、隆起、无褶皱，边缘整齐。显微观测呈杆状，中生芽孢，且芽孢椭圆形，孢嚢膨大，革兰氏染色呈阴性，在7%NaCl中不能生长。其最适生长条件为25°C~28°C、pH6~7。依照第九版《伯杰氏系统细菌学鉴定手册》(《Aerge7，s他"〃a/5y^e鹏〃c勘"eWo—/c^7〉〉)和《常用细菌系统鉴定手册》对G-14菌抹进行形态学测定，生理生化检测确定G-14菌林为多粘类芽孢杆菌(尸ae/2/^3"7/^中的成员。16SrDNA同源分析、系统发育分析结果都表明G-14菌为类芽孢杆菌属中的成员，属多粘类芽孢杆菌(/^e/7/^c///^本发明的甜瓜细菌性斑点病的生防菌株，其菌学特性如表1所示。其菌学特性通过法国梅里埃公司生产的r/7KTW自动鉴定仪测定。其结果与多粘类芽孢杆菌(尸se/72'&c27/〃s;70/7^^3)相似性达99%。<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>上述微生物菌种为原始菌林，具有较好的遗传稳定性，通过自然变异或人工诱导变异的菌林也可用作本发明甜瓜细菌性斑点病的生物防治。作为上述变异菌林的研制方法，包括物理诱变，如紫外线辐射处理、钴60辐照处理、离子注入处理、激光辐照等各种射线处理；化学诱变，如亚硝基胍(NTG)、硫酸二乙酯等化学诱变剂处理，用常规果胶酶产生菌分离筛选培养基及方法优选出生产性能优异的菌抹。另外，也可通过分子生物学技术，从原始菌抹或诱导变异菌种中获取抗病基因，以原菌核微生物，如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌等、真核微生物，如酵母等，作为基因受体菌，构建基因工程生产菌林，也可作为本发明的甜瓜细菌性斑点病的生防菌才朱。作为培养基的营养源，可广泛使用通常用于培养的营养源。只要是可作为碳源同化的碳化合物或者是含有该^灰化合物的，微生物菌种可利用的、适合于发酵培养的碳源即可，例如，可使用葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、甘露醇、玉米粉、甘油、乙酸钠、可溶性淀粉等。其用量依据培养基的成分选择及培养条件的不同而有所差异。本发明中优选甘露醇、玉米粉、葡萄糖为最优碳源。通常，可选择以下的条件进行培养。即，培养温度为2G37。C,最适培养温度为25~28°C，培养时间约为24~48小时，只要在本发明的抑菌活性达到最高时结束培养即可；培养基的pH可在5~9的生产范围，特别是在67更适于本发明的抑菌物质的产生。经如上所述的培养，主要在菌体外(培养液中)产生目的产物的抑菌物质。通过本发明如上的阐述，得到后面实施例进一步的验证，得知本发明多粘类芽孢杆菌的生物学特性及其防病效果。本发明菌株的最适抑菌pH为7左右，在pH6~7范围内可保持较高的抑菌活性；在2037。C范围内均有抑菌活性，其最适作用温度在2530。C。通过实施本发明具体的技术指标，实现本
发明内容，可以达到以下有益效果。通过试一验表明，本发明的多粘类芽孢杆菌O^e/^'/^c///^/w/j^/xa)CGMCC.No.2250菌株及在菌学上来说与其同等的菌抹及其变异菌林，可有效地用于甜瓜细菌性斑点病的防治，预防处理对P4、BFB、F159的防治效果分别为60.58°/。、98.23%、57.42%。综合分析，预防处理优于治疗处理。再有，本发明的优点在于，使用所述菌林进行病害的防治安全可靠，不危害人类健康，不污染环境。图1:所示为多粘类芽孢杆菌(/^e/2i^c///^，///Z7j^3)平板抑菌试验的图。图2:所示为温度对多粘类芽孢杆菌(Ae/7//^c///^po///ff7")的生长的影响的图表。图3:所示为初始pH对多粘类芽孑包杆菌(尸ae/2i'6a"7/t;s/w/jwyxa)的生长和抑菌活性的影响的图表。下面，举实施例说明本发明，但是，本发明并不限于下述的实施例。具体实施例方式实施例1:拮抗菌的初筛方法吸取病原菌稀释发酵液lmL(血球计数并稀释至lx1(^个/mL)，不同梯度土壤稀释液各lmL于灭菌空试管中混匀，然后吸取该混匀液O.1mL于平板中涂布，倒置培养(28。C，48h)观察有无抑菌圈产生，记录产圏大小，并挑取产圏单菌落采用平板划线法进行纯化，在28。C下培养，培养基上长出单菌落时即为纯菌种，将获得的单菌落接种于改良的斜面培养基上，28。C下培养48h后放入4。C冰箱中保存备用，参见附图l。采用试管混菌平板涂布法，从86份不同的土样中共计筛选到195抹产抑菌圈菌株。通过对195个菌林进行初步拮抗作用测定，共得到63抹对细菌性斑点病有拮抗作用的菌抹，占到分离菌抹总数的32.4%。按抑菌圈直径大小将拮抗菌分为强、中、弱三类。从中筛选出对斑点病菌有较强拮抗作用菌林6个，中等作用的菌林29个，其余皆为弱菌株，参见表2。表2拮抗菌对斑点病菌抑菌作用Table2Inhibitoryactivitiesofantagonisticbacteriatobacterialspotpathogen^抑菌作用抑菌直径/mmSSI<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>注(Note)"+++"强(Strong);"+十"中(Middle);"+"弱(Weak);"—"无(Nothing)实施例2:拮抗菌的复筛方法选取抑菌距离在10誦以上的菌林，进行管碟法复筛。将病原菌菌悬液(1xl(T个/mL)吸取0.lmL涂布于平板上，并用灭菌打孔器在平板上打孔，然后将拮抗菌发酵液(28。C发酵培养48h)加于打好的孔中，然后放置培养箱中培养(28°C,48h)观察抑菌圈大小，重复三次。采用管碟法从分离到的63抹拮抗菌中筛选出了高效而稳定的G-14,其拮抗效果参见附图2。实施例3:温度对多粘类芽孢杆菌(户ae/7/^d7/^;70///7")生长的影响接种G-14至液体基础培养基，接种量与生长曲线试-睑相同，分別于20°C，25°C，28°C,30°C，37。C摇床培养，转速180r/min，培养至稳定期，用UV-2550分光光度计在600nm波长下测OD值，设不接菌培养液为对照，重复多次。通过上述实施例得知本发发明菌抹的最适生长和培养温度在2037。C范围内均有抑菌活性，其最适作用温度在2530。C。实施例4:pH对多粘类芽孢杆菌(尸ae/7/^3C27/〃s/^/jffi^jrs)生长和抑菌活性的影响H离子浓度(以pH表示)直接影响细菌的酶活性。在一定的pH值环境中生长最好，称其为最适pH值。当pH值高于或低于一定限度时，就不能生长，这一从最高到最低的范围，称为它的pH值适应范围。某种细菌在其他环境条件固定时，其生长的pH范围也是固定的，故可作为一个鉴定指标。用l。/。NaOH或iy。HCl，将基础培养基初始pH值分别调节为3，5,6,7，8，9,11,并用PHS-25C型酸度计测定其最终pH值。G-14接种量与生长曲线试验相同，28。C摇床180r/min培养至稳定期，用UV-2550分光光度计在6QOnm波长下测0D值，设不接菌培养液为对照，重复多次。同时取不同pH值培养基培养的拮抗菌做抑菌活性试验，28。C温箱中培养48小时，用游标卡尺测定拮抗菌抑菌圈直径，研究初始pH值对拮抗菌抑菌活性的影响。作用pH与抑菌活性的关系，参见附图3所示。通过上述实施例得知本发发明菌株的最适生长和抑菌pH为7,在pH6~7范围内可保持较高的抑菌活性。实施例5:盆栽防病试'验试—睑温室盆栽防病试^r试—险-使用细菌性斑点病原菌P4、F159和BFB菌才朱，用SPA培养基摇床培养，配制成lx1()S个/mL菌悬液备用。供试盆栽苗使用三叶期的甜瓜盆栽苗，采用人工喷雾接种法进行接种。温室盆栽采用以下两个处理方法1.预防处理先在盆栽甜瓜叶片正面和背面上喷雾接种浓度为lx1()8个/mL左右的拮抗菌菌悬液或在28。C下180r/min摇床培养2d发酵液，24h后再喷洒斑点病病原菌菌悬液，然后套袋保湿48h,同时喷洒清水作为对照，以上每个处理各5盆，同时每个处理设对照5盆。2.治疗处理先在盆栽甜瓜叶片上喷雾接种角斑病病原菌菌悬液；套袋保湿48h初见症状后再喷洒浓度为lx108个/mL左右的拮抗菌菌悬液或28。C下180r/min摇床培养M发酵液，然后套袋保湿48h,同时喷洒清水作为对照。以上每个处理各5盆，同时每个处理设对照5盆。甜瓜细菌性斑点病发病情况调查方法在斑点病发病稳定期时进行病害调查和统计，纟姿下列甜瓜细菌性斑点病分级标准调查记录，并计算病情指数。0级全叶无病；l级有很少小斑，占叶面积115以下；2级少数小斑，占叶面积的l/5-l/3;3级许多病斑，占叶面积l/3—2/3;4级:许多中等大小病斑，占叶面积2/3以上，细菌溢量中度；5级全叶发病，细菌溢量多，部分病斑干枯，形成穿孔。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage12</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage12</formula>试验结果见表3。试验结果表明拮抗细菌G-14对甜瓜细菌性斑点病均有显著的防效。预防处理对P4、BFB、F159的防治效果分别为60.58%、98.23%、57,42%。综合分析，预防处理优于治疗处理。表3拮抗菌抹G-14的盆栽防病效果<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>实施例6:为了验证拮抗菌G-14对甜瓜细菌性斑点病的防病效果，在甜瓜种植季节采用喷雾接种法进行了G-14的防病实验，参见表4。所用品种为杂交皇后，其中该品种肉脆、味香，倍受消费者青睐，但该品种抗病性差，易被细菌性病害浸染，故选该品种易于进行效果评价。所用的拮抗菌G-14液体菌剂为含多粘类芽孢杆菌活菌数10MVmL。表4生防菌G-14液体菌剂田间防病试验设计<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>病害调查采用大田定点法进行,每点随机定点调查20抹，三次重复，一周调查一次，记载每林的发病情况，计算其发病率、病情指数和防效。发病叶数发病率=_接种总叶数E发病级数x本级叶数病情指数=_x100%发病最重级数x小区抽样总叶数对照病情指数-拮抗菌病情指数防治效果(W=_xio0%对照病情指数试验结果见表5。试验结果表明拮抗细菌G-14对甜瓜细菌性斑点病均具有-定的防效。综合分析，预防处理优于治疗处理。表5拮抗菌抹G-14田间防治效果菌株FT^发病率病指防效发病率病指防效发病率病指防效10056.0719.7760.0032.3150.8158.0635.4837.1910063.539.1093.2153.4418.6467.8539.2030.4510069.8910065.6889.8756.49G防理疗理预处治处g权利要求1、一种多粘类芽孢杆菌(Paenibacilluspolymyxa)CGMCC.No.2250。2、如权利要求1所述的多粘类芽孢杆菌(Ae/i^d7/^;w/7/ff/xa)CGMCC.No.2250,其特征在于，该菌株的培养温度为20~37°C，培养时间约为2448小时，培养基的pH可在5-9的生产范围内适于抑菌物质的产生。3、如权利要求1所述的多粘类芽孢杆菌(/^e/2/^c27/^/w/y/7//xs)CGMCC.No.2250,其特征在于，该菌林的最适培养温度为25~28°C,培养基的pH可在6-7的生产范围内优先适于抑菌物质的产生。4、一种利用权利要求1所述的多粘类芽孢杆菌(/^e/7/^c///^CGMCC.No.2250在治疗甜瓜细菌性斑点病中的应用。5、一种利用权利要求1所述的多粘类芽孢杆菌(/^e/7/^c/〃MpW"y^3)CGMCC.No."50通过自然变异或人工诱导变异的菌林在治疗甜瓜细菌性斑点病生物防治中的应用。6、一种利用权利要求l、4、5中任一种菌种通过常规分子生物学技术获得的抗病基因，以原菌核微生作为基因受体菌构建基因工程生产菌抹在治疗甜瓜细菌性斑点病生物防治中的应用。全文摘要本发明公开了一种多粘类芽孢杆菌(Paenibacilluspolymyxa)CGMCC.No.2250的生防菌株及其在治疗甜瓜细菌性斑点病中的应用。该发明提供的菌株及在菌学上来说与其同等的菌株及其变异菌株，可有效地用于甜瓜细菌性斑点病的防治，且预防处理优于治疗处理。通过使用所述菌株进行病害的防治安全可靠，不危害人类健康，不污染环境，较传统的化学防治具有效果好、成本低、使用安全、不污染环境等特点，可广泛应用于工农业的生物防治领域。文档编号C12N1/20GK101215543SQ200810072810公开日2008年7月9日申请日期2008年1月18日优先权日2008年1月18日发明者刘文玉,史应武,恺娄,王杏琴申请人:新疆农业科学院微生物应用研究所