专利名称：番茄细菌性病害锁式探针高通量检测方法
技术领域：
本发明涉及一种番茄细菌性病害的高通量检测方法，更具体涉及一种运用锁式探针对番茄青枯病原菌，番茄溃疡病原菌和番茄斑点病进行反向斑点杂交的高通量检测方法，属于农作物防病治病及出入境植物检疫范畴。
背景技术：
番茄细菌性溃疡病、番茄细菌性斑点病和番茄青枯病是番茄生产上的三种重要的病害。造成这些病害的病原菌分别为michiganensis subsp.michiganensis(以下简称 OM)、Pseudomonas syringae.pv.Tomato (以下简称 W、、Ralstoniasolanacearum(以下简称RSl)。这些病害主要作用于番爺经济类作物,造成很严重的经济损失，是番茄最难控制的细菌性病害。番茄细菌性溃疡病菌和番茄细菌性斑点病是欧洲和地中海植物保护组织(EPPO )检疫性有害生物(EPP0/CABI，1997)，在我国也属于植物检验检疫性的有害细菌。番茄溃疡病是一种系统维管束病害，在番爺苗期和收获期均可发生。它和番爺斑点病都主要危害番茄的叶片、茎和果实。番茄斑点病病原菌是丁香假单胞的致病变种之一，只侵染番茄但被感染的植株经常因为缺少明显的病症或者被其他病害的症状掩盖而检测不到。番茄青枯病病原菌有44个家族，能够在数百种植物上发病[1]。据报道，在台湾，这个病原菌在番茄，马铃薯，甜椒，花生，草莓，茄子、蓖麻子、芝麻、洋桔梗植物[2]和天堂鸟[3]均能发病。鉴于细菌性溃疡病、番茄细菌性斑点病和番茄青枯病分布范围广，危害严重，和其在番茄经济上造成的重大损失，各种检测方法应运而生。传统的检测和鉴定病原的方法包括病原被分离、纯化、生物化学检测、血清学鉴定和致病性检测M等，但是这些方法灵敏度低，缺乏特异性，检测时间长[5]，且很难在短时间内对大量的样品进行检测。此外还有许多其他鉴定的方法，但是也存在一定的缺陷。比如鉴定A syringae.pv.Tbaaio的方法,即细菌克隆体在半选择性培养基进行放射性的杂交，但是它受菌株产生的毒素的限制[6]。常规PCR不能进行精确地定量分析m，Real-t ime PCR虽然可以对许多病原微生物和病毒的进行定量检测[8_9]，但是经常会有假阳性结果的出现。而且所有的这些方法都不能在同一个体系中达到对多种病害进行检测的目的。自锁式探针被报道以来_，它以灵敏、特异、稳定等特点被大家广泛接受，并越来越多的应用在分子检测等试验中。锁式探针是由3’和5’端两段靶标序列和中间的一段对检测结果没有影响的连接序列构成的一种较长的单链寡核苷酸片段。它的工作原理是当检测体系中存在靶标DNA时，探针两端的靶标序列就会与靶标DNA完全互补配对，线型锁式探针就在连接酶的作用下被有效地连接成环型，而在没有相应目的DNA存在时锁式探针不被连接酶连接，仅以线性形式存在。在核酸外切酶的作用下，多余的线性锁式探针被消化水解，而连接成环状的锁式探针就在fei DNA聚合酶和通用引物的作用条件下恒温扩增[11]，它的扩增效率在一小时之内就可以达到IO9或更多拷贝[12]。扩增后的产物经过标记就和固定在膜上的探针进行杂交，通过显色反应实现在同一体系中进行多靶标的高通量的检测。
发明内容
本发明旨在提供一种番茄细菌性病害锁式探针高通量检测方法，基于锁式探针的滚环扩增技术，用一对通用引物扩增多种病原物，之后，与反向斑点杂交技术结合起来，通过显色反应来判断结果，实现番茄青枯病原菌，番茄溃疡病原菌和番茄斑点病菌的高通量检测。本发明根据Jens Dreier, V.Fanelli和Yeng-an Lee等人分别获得番爺溃瘍病菌、番茄斑点病菌、番茄青枯病菌的一段特异性片段，通过Blast与其近似种进行比对，在与其近似种碱基差异较大的地方找出一段序列作为Tl、T2区，根据锁式探针的设计原则，设计锁式探针。并用 Mfold (http://www.bioinf0.rp1.edu/applications/mfold/)预测探针的二级结构，确保了锁式探针的二级结构最小。线性探针经过环化连接，探针两端的靶标序列就会与靶标DNA完全互补配对，线型锁式探针在Taq DNA连接酶的作用下被有效地连接成环型，而在没有相应目的DNA存在时锁式探针不被连接酶连接，仅以线性形式存在，而后续反应中的核酸外切酶1、III将多余的线性锁式探针消化水解。然后再用通用引物PCR扩增，PCR产物进行反向斑点杂交，可实现一条通用引物同时检测多种病原菌的高通量检测方法。本发明的一种番茄细菌性病害锁式探针高通量检测方法，具体操作的步骤如下:
(I)锁式探针PCR扩增:首先设计锁式探针，然后经过环化连接、消化反应，再用通用引物PCR扩增，PCR反应中加入含DIG-labeled dUTP的dNTPs，使PCR产物带上地高辛标记；
(2)反向斑点杂交:通过显色反应读出杂交信号，以此来判断体系中是否含有番茄青枯病菌RS1、番茄溃疡病菌CMM和番茄斑点病菌PST ;所述锁式探针的核苷酸序列如下:
权利要求
1.一种番茄细菌性病害锁式探针高通量检测方法，其特征在于:步骤如下:(1)锁式探针PCR扩增:首先设计锁式探针，然后经过环化连接、消化反应，再用通用引物PCR扩增，PCR反应中加入含DIG-1abeled dUTP的dNTPs，使PCR产物带上地高辛标记；(2)反向斑点杂交:通过显色反应读出杂交信号，以此来判断体系中是否含有番茄青枯病菌RS1、番茄溃疡病菌CMM和番茄斑点病菌PST ;所述锁式探针的核苷酸序列如下:
2.根据权利要求1所述的番茄细菌性病害锁式探针高通量检测方法，其特征在于:所述环化连接的反应体系为IOyL =IOXTi^ DNA连接酶缓冲液I μ L，CMM、PST及RSl的 400pmol/L 锁式探针各 0.2μ L，40U/y L Taq DNA 连接酶 0.15 μ L，Sterilized ddH205.25 μ L，样品模板3 μ L，采用热循环连接法连接:94°C 4 min ； 94°C 30s, 65°C 5min, 15个循环；95°C 15min灭活Taq DNA连接酶，反应结束后立即将反应管冰浴5min。
3.根据权利要求1所述的番茄细菌性病害锁式探针高通量检测方法，其特征在于:所述消化反应的条件如下:向冰浴后的反应管中加入10μ L的混合液:10Χ核酸外切酶I缓冲液2 μ L，5U/ μ L核酸外切酶I 0.35 μ L，10 X核酸外切酶III缓冲液2 μ L，5U/ μ L核酸外切酶III 0.15 μ L, Sterilized ddH20 5.5 μ L，37°C反应 2 h，再于 95°C反应 3h。
4.根据权利要求1所述的番茄细菌性病害锁式探针高通量检测方法，其特征在于:通用引物PCR扩增的反应体系为25 μ L:2 XPCR buffer 12.5 μ L, 10 μ M通用引物Pad F 0.5μ L, 10 μ M 通用引物 PadR 0.5yL，含 DIG-labeled dUTP 的 IOXdNTPs L5yL，环化连接、消化反应的产物 2 yL，Sterilized ddH20 8 μ L ;反应条件:94°C 4min ； 94°C 30s，57°C 30s, 72°C 30s，35 个循环；72°C 8min。
5.根据权利要求1所述的番茄细菌性病害锁式探针高通量检测方法，其特征在于:所述反向斑点杂交:将番茄溃疡病菌CMM、番茄斑点病菌PST和番茄青枯病菌RSl的杂交探针CMM-T1/T2、PST-T1/T2和RS1-T1/T2点在杂交膜上，之后与用地高辛标记的的PCR产物进行杂交，通过显色反应来判定是否存在目标病原细菌。
6.根据权利要求1所述的番茄细菌性病害锁式探针高通量检测方法，其特征在于:所述杂交探针如下: 番茄溃疡病菌杂交探针:CMM-T1/T2: 5’ -ATGACTCCTGGCCTGATCGGTTCCTTGCGCCGAAGACCTCA-3’，番茄斑点病菌杂交探针:PST-T1/T2: 5’ -TTATTTCCCAATCATAGTTAGCCCACTCGC GTAACGCAGTGACGC-3 ’，番茄青枯病菌杂交探针:RS1-T1/T2:5’ -GAGCGGATGCGTAACAGACGATGCGA AGCCTGACGCGAACG-3’。
全文摘要
本发明涉及一种番茄细菌性病害的高通量检测方法，更具体涉及一种运用锁式探针对番茄青枯病原菌，番茄溃疡病原菌和番茄斑点病进行反向斑点杂交的高通量检测方法，属于农作物防病治病及出入境植物检疫范畴。本发明是基于锁式探针的滚环扩增技术，用一对通用引物扩增多种病原物，之后，与反向斑点杂交技术结合起来，通过显色反应来判断结果，可以缩短传统番茄细菌性病害的检测时间、确保检测的特异性和灵敏度，实现高通量检测。而且这种方法可以缩短传统病原菌检测的周期、提高通关速度。这对于提高进境大宗农产品疫情截获检出率，提高防范外来有害生物入侵能力，加快我国口岸进出口货物的通关速度，降低企业成本都具有重大的意义。
文档编号C12Q1/68GK103215357SQ20131011724
公开日2013年7月24日 申请日期2013年4月7日 优先权日2013年4月7日
发明者王念武, 翁瑞泉, 沈建国, 王婷, 于文涛 申请人:中华人民共和国福清出入境检验检疫局