专利名称：番茄病原细菌的接种方法
技术领域：
本发明涉及一种植物病原细菌的接种方法，具体是番茄病原细菌的接种方法。
背景技术：
植物病原细菌的常用接种方法包括剪叶法、浸(蘸)根法、针刺法等，各种方法均存在各自的优缺点，研究不同细菌病害应选用不同的接种方法。生产中较为重要的番茄细菌性病害包括番茄溃疡病、青枯病、细菌性斑点病和疮痂病等。其中番茄细菌性溃疡病是全世界番茄生产中一种极为重要的毁灭性病害，病原菌为Clavibactermichiganensis subsp.michiganensis(以下简称Cmm)，是中国检疫性有害生物；该病菌以种子传带为主要传播方式，目前世界上尚无针对番茄细菌性溃疡病的有效防治方法，而且中国对该病害的研究较少，已有的研究仅限于病原菌的鉴定及病害的发生与防治报道。
在植物病害的防治实践中，抗病品种的使用是最为经济有效的方法，也是控制病害的最根本措施之一。在抗病品种的选育过程中，需要进行大量的抗病性检测试验，而建立病原菌对寄主植物稳定的致病体系是进行此项研究的重要前提。因此，一种操作简单、发病迅速、效果稳定的接种方法是研究中不可或缺的。
传统的几种接种方法中用于番茄苗期接种Cmm时具有不同的缺陷，如剪叶法发病不稳定；针刺法接菌量小，在苗期不易操作并易对幼苗造成机械伤害；浸(蘸)根法操作复杂，不适合用于大样本容量的试验等。本发明人在尝试了已报道的几种常用细菌病害接种方法之后，认为这些接种方法均不适合用于番茄苗期接种Cmm和在苗期对番茄进行抗溃疡病鉴定。
本发明人从果树修剪中的打顶操作中受到启发，由于番茄在打顶后还能继续生长，因此设想通过打顶将病原菌接种到受体植物上。在经过大量试验验证后，发明了接种番茄病原细菌的打顶法，可作为番茄苗期接种溃疡病菌及其它病原细菌的新方法。
发明内容
本发明目的是提供一种快速、简便的对番茄幼苗接种病原细菌的接种方法。
为实现上述目的，本发明番茄病原细菌的接种方法，包括如下步骤(1)准备接种体制备浓度为108-109cfu/mL的番茄病原细菌菌悬液作为备用接种体；(2)番茄幼苗生长至3～4片真叶期时，在番茄幼苗子叶上部1-2cm处将主茎剪断；(3)使接种体接触主茎剪断部位伤口，病原细菌侵入番茄幼苗。
优选地，用蘸有接种体的接种用手术剪刀剪断主茎，同时使病原细菌侵入番茄幼苗。
本发明的接种方法的优点和积极效果在于可用于对番茄幼苗进行快速、简便的病原细菌接种，接种量稳定均一，并能够通过调整接种体的浓度控制接菌量，适合进行大样本容量的试验，可操作性很强，显著减轻工作强度；接种后植株显症时间短，不同细菌病害显症时间不同，如接种Cmm后的幼苗在14～21天后可见到稳定且典型的番茄溃疡病症状，解决了其它几种传统接种方法的不足，如剪叶法发病不稳定；针刺法接菌量小，在苗期不易操作并易对幼苗造成机械伤害；浸(蘸)根法操作复杂，不适合用于大样本容量的试验等；并对于丰富植物病原细菌的接种方法具有积极意义。作为一种新的具有标准特征的方法，可以用于番茄种质资源抗细菌性病的鉴定、不同来源番茄病菌的致病性差异检测等规范性试验，具有潜在的社会经济意义。
具体实施例方式
实施例1以番茄细菌性溃疡病菌为例，本发明的接种方法包括如下步骤(1)播种及苗期管理将健康的番茄种子播种在盛有灭菌基质的育苗盘内，适当浇水保持基质的湿度，在温室条件下正常管理，播后25天，视不同的气候日照等条件在21～28天范围内都是可行的，即当番茄幼苗生长至3～4片真叶期时作为接种受体植物。
(2)接种体的准备将番茄溃疡病菌接种在YDC培养基，即酵母提取物、葡萄糖、碳酸钙培养基上，置于28℃下培养60小时，培养时间在48～72小时内都是可行的，然后用含0.85％NaCl的无菌生理盐水配制成浓度为108的菌悬液，菌悬液浓度在108～109cfu/mL范围内均是可行的。菌悬液浓度可根据试验需要进行调整，浓度参照麦法兰(McFarland)云度计比浊法确定。
(3)接种方法用灭菌后的接种用手术剪蘸取上述制备的接种体于番茄幼苗子叶上部1.5cm处将主茎剪断，剪断位置在子叶上部1～2cm范围内都是可行的；每剪一株则将手术剪置于菌悬液中蘸取一下接种体，接种后弃去幼苗顶部，从而造成伤口使番茄溃疡病菌侵入。
接种后的症状显现在接种后5～7天，可见番茄幼苗子叶与主茎的叶腋处有新枝长出；14～21天后可见到接种番茄溃疡病菌的幼苗子叶及长出的新枝出现典型的萎蔫和坏死症状，有时可见到茎部出现开裂的溃疡症状，萎蔫或茎部溃疡等症状的出现与不同菌株的致病力有关，一般来说，强致病力菌株在短期内会造成子叶萎蔫、植株坏死或死亡，致病力稍弱的菌株则造成茎部溃疡，而接种无菌生理盐水的对照幼苗则无任何溃疡病症状。
在接种体浓度为108cfu/ml，昼夜最低、最高温度分别为15～18℃、32～35℃和相对湿度为30％～60％的温室条件下，用本发明的接种法接种番茄幼苗后溃疡病发病率为87.5％-100％，病情指数随接种体浓度提高而增大，经柯赫氏法则(Koch’s postulate)验证，血清学和PCR技术鉴定表明，从发病后的幼苗上可再分离得到与原接种用的番茄溃疡病菌特性相同的病原细菌。多次重复试验表明，使用本发明的接种方法在感病番茄品种幼苗上均能产生稳定的溃疡病症状。
应用实施例1本申请人将本发明的方法用于中国主栽番茄品种苗期抗细菌性溃疡病的鉴定，已完成对中国内61个主栽番茄品种的抗性鉴定，并根据番茄发病后的病情指数，将这些番茄品种初步分为高度感病品种、感病品种、中度抗/耐病品种、耐病品种等。
具体应用条件及方法(1)播种及苗期管理将健康的番茄种子播种在盛有灭菌基质的50孔育苗盘内，每个品种播种1盘，适当浇水保持基质的湿度，在温室条件下正常管理，出苗后10天左右进行定苗，使每孔保留1株幼苗，每个品种50株；播后约26天，即当番茄幼苗生长至3～4片真叶期时作为接种受体。
(2)接种体的准备将1株来自中国的番茄溃疡病菌Cmm-BX接种于YDC培养基上，置于28℃下培养48小时后，用含0.85％NaCl的无菌生理盐水配制成浓度为108cfu/mL的菌悬液，菌悬液浓度参照麦法兰(McFarland)云度计比浊法确定。
(3)接种方法用灭菌后的接种用手术剪蘸取上述制备的接种体于番茄幼苗子叶上部1.5cm处将主茎剪断，每剪一株则将手术剪置于菌悬液中蘸取一下接种体，接种后弃去幼苗顶部。每个品种中留下10株“接种”无菌生理盐水，作为空白对照。
(4)病情调查接种后14天即可在大多数品种见到番茄溃疡病症状，接种21天后症状趋于稳定，此时按以下分级标准对各品种植株发病后的病情进行调查0级，不出现叶片(或子叶)萎蔫或茎坏死；1级，叶片(或子叶)轻度变黄或萎蔫；2级，叶片(或子叶)中度萎蔫或茎轻度坏死；3级，叶片(或子叶)严重萎蔫或茎严重坏死；4级，植株死亡；并依照下列公式计算病情指数。
病情指数＝[∑(病级数值×该病级株数)×100]/(病级最高值×调查株数)结果根据接种21后天调查的数据，经分析计算出病情指数后，按照不同品种对番茄溃疡病菌Cmm-BX的敏感程度，将供试的61个番茄品种初步分为高度感病品种、感病品种、中度抗/耐病品种、耐病品种4个等级。即将病情指数＞75的品种视为高度感病品种，共有20个，将50＜病情指数≤75的品种视为感病品种，共29个，将25＜病情指数≤50的品种视为中度抗/耐病品种，共11个，将病情指数≤25的品种视为耐病品种，共1个。
应用实施例2本发明人将本发明的方法用于不同来源的番茄溃疡病菌菌株的致病力测定，发现不同来源的菌株在同一番茄品种上表现出不同的致病力。
具体应用条件及方法(1)播种及苗期管理将北京主栽的番茄品种佳粉10号的种子播种在盛有灭菌基质的50孔育苗盘内，适当浇水保持基质的湿度，在温室条件下正常管理，出苗后10天左右进行定苗，使每孔保留1株幼苗，每个育苗盘共50株幼苗；播后约26天，即当番茄幼苗生长至3～4片真叶期时作为接种受体。
(2)接种体的准备将来自于中国(Cmm-BX)和美国的Cmm菌株(Cmm-09)和分别接种于YDC培养基上，置于28℃下培养48小时后，用含0.85％NaCl的无菌生理盐水配制成浓度为108cfu/mL的菌悬液，菌悬液浓度参照麦法兰(McFarland)云度计比浊法确定。
(3)接种方法用灭菌后的接种用手术剪蘸取上述制备的接种体于番茄幼苗子叶上部1.5cm处将主茎剪断，每剪一株则将手术剪置于菌悬液中蘸取一下接种体，接种后弃去幼苗顶部。在同一育苗盘中，每个菌株接种20株，另外留下10株“接种”无菌生理盐水，作为空白对照。
(4)病情调查接种后14天即可见到接种Cmm-BX的番茄幼苗产生典型的萎蔫、坏死等溃疡病症状，而接种Cmm-09的番茄幼苗仅有个别植株出现轻微的萎蔫症状，多数植株未见明显症状；接种21天后病情趋于稳定，按以下分级标准对植株发病后的病情进行调查0级，不出现叶片(或子叶)萎蔫或茎坏死；1级，叶片(或子叶)轻度变黄或萎蔫；2级，叶片(或子叶)中度萎蔫或茎轻度坏死；3级，叶片(或子叶)严重萎蔫或茎严重坏死；4级，植株死亡；并依照下列公式计算病情指数。
病情指数＝[∑(病级数值×该病级株数×100]/(病级最高值×调查株数)结果根据接种21后天调查的数据，经分析计算出病情指数后，发现接种Cmm-09的植株病情指数仅为7.8，而接种Cmm-BX的植株病情指数则高达78.3，差异显著。
本发明的番茄病原细菌的接种方法，接种量稳定均一，并能够通过调整接种体的浓度控制接菌量，适合进行大样本容量的试验，可用于进行抗/耐病品种的筛选、致病性试验和病原菌的毒力测定。
以上实施例中所述的是番茄溃疡病菌的接种，本发明的方法也适用于其它病菌的接种，如番茄青枯病菌(Ralstonia solanacearum)、番茄疮痂病菌(Xanthomonas campestris pv.vesicatoria)和番茄细菌性斑点病病菌(Pseudomonas syringae pv.tomato)等的接种。本发明的方法不仅仅限于番茄幼苗期溃疡病菌接种，其同样适用于其它的适合于打顶操作的植物的幼苗期病菌接种。
权利要求
1.一种番茄病原细菌的接种方法，其特征在于包括如下步骤(1)准备接种体制备浓度为108-109cfu/mL的番茄病原细菌菌悬液作为备用接种体；(2)番茄幼苗生长至3～4片真叶期时，在番茄幼苗子叶上部1-2cm处将主茎剪断；(3)使接种体接触主茎剪断部位伤口，病原细菌侵入番茄幼苗。
2.根据权利要求1所述的接种方法，其特征在于步骤(2)中用蘸有接种体的接种用手术剪刀剪断主茎，同时使病原细菌侵入番茄幼苗。
全文摘要
本发明涉及一种植物病原细菌的接种方法，具体是番茄病原细菌的接种方法。其包括如下步骤首先准备接种体制备浓度为10
文档编号C12N1/20GK1834224SQ20051001143
公开日2006年9月20日 申请日期2005年3月15日 优先权日2005年3月15日
发明者李健强, 罗来鑫, 刘西莉, 吴学宏, 刘鹏飞, 张文华 申请人:中国农业大学