专利名称：番茄溃疡病菌单克隆抗体制备方法及其试剂盒和使用方法
技术领域：
本发明涉及一种高特异性、高灵敏性检测引发番茄溃疡病的密执安棒杆菌的单克隆抗体，属于植物检疫和植物保护领域，专一针对番茄溃疡病菌(Clavikicter michiganensis subsp. michiganensis, Cmm)的检测。该抗体适用于番茄溃疡病的田间预防和植物检疫及植物保护中番茄溃疡病菌的快速检测。
背景技术：
番茄溃疡病(Bacterial canker of toma to)是番茄生产中最为严重、具有毁灭性的病害之一，病原菌为密执安棒形杆菌密执安亚种(Clavikicter michiganensis subsp. michiganensis, Cmm)。该病自从1909年首次在美国密执安州的温室番茄上发现以来，现已广泛分布于美国各番茄产区，并逐渐成为世界性病害。自1989年以来，我国相继在北京、黑龙江、吉林等10多个省区报道发生此病，使许多地区番茄生产受到了不同程度的影响。因此，我国将该病原菌列入全国农业和进境植物检疫性有害生物名单中。番茄溃疡病主要危害植株维管束，苗期至成株期均可染病。苗期染病，发病初始产生于下部叶缘，并逐渐由下部叶片向上部叶片引起萎蔫，甚至在胚轴或叶柄产生溃疡状稍凹陷小条斑，造成病苗矮化或枯死。成株期染病，发病初始下部近地面叶片萎蔫下垂或卷缩，似缺水状，上部叶片仍正常生长，此时内部病菌在维管束内扩散迅速，扩展后在病株茎杆上产生狭长稍凹陷的开裂状条斑，使病部增粗，产生气生根，并向病茎部上下扩散。发病后期病株茎杆出现狭长的褐色条斑，上下扩展，茎杆增粗，呈现出黄绿相间凹陷斑。湿度大时，可见菌脓从病茎或叶柄中溢出，呈白色污状物，后期茎内变褐并中空，沿凹陷处枯黄开裂。主茎上常产生大量气生根。幼苗被害，皱缩滞育、畸形，受害果实出现白色圆形小点，后变黄褐色，病斑中央粗糙突起，四周有白色晕圈，呈“乌眼状”。茎杆溃疡和果实的斑点往往不在同一植株上出现。“乌眼斑”是病果的一种特异症状，由在侵染引起，不一定与茎部系统浸染同发一株。建立番茄溃疡病菌快速、有效的检测方法，对密执安棒杆菌的防治非常重要。现行的检测方法主要包括传统的鉴别培养方法和免疫学、分子生物学等发展较快的现代方法。免疫学方法经过近几年不断的研究改进可针对现场大量样品快速筛查，具有简单、快速、高灵敏度、高特异性、可同时筛查大量样品的优点。用于样品中密执安棒杆菌的单克隆抗体在特异性和灵敏度等方面仍需要进一步的完善，因此选择适宜抗原制备高特异性、高灵敏度的单克隆抗体是非常必要的。本发明以密执安棒杆菌全菌为抗原免疫BALB C小鼠制备了该菌特异性单克隆抗体，并进行了鉴定，为番茄溃疡病菌的进一步检测奠定了基础。
发明内容
本发明的目的在于避免现有技术的不足提供一种番茄溃疡病菌单克隆抗体的制备方法。发明的又一目的提供一种番茄溃疡病菌单克隆抗体的试剂盒和番茄溃疡病菌单克隆抗体的试剂盒的使用方法。本发明的创新点在于运用单克隆抗体的原理和技术并加以改进，制备出番茄溃疡病菌的特异性抗体，运用到植物病原的检测上来，将B淋巴细胞分泌抗体的能力和肿瘤细胞无限增殖的能力相结合，用番茄溃疡病的致病菌密执安棒杆菌免疫 BALB/C小鼠，以获得可以分泌产生这种细菌抗体的特异性的B淋巴细胞，将此B淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合，通过杂交瘤细胞的筛选，克隆化培养、单克隆抗体的制备与鉴定等一系列的实验技术，制备出番茄溃疡病菌的单克隆抗体。建立了一种将免疫学和分子生物学有机结合起来的检测方法，检测的准确性和灵敏度也大幅度提高，以克服传统现有植物病原菌检测方法灵敏性低、特异性差、检测措施不得力的缺陷。为实现上述目的，本发明采取的技术方案为一种番茄溃疡病菌单克隆抗体的制备方法，其主要特点是用密执安棒杆菌免疫BALB/C小鼠，以获得分泌产生该种细菌抗体的特异性的B淋巴细胞，将此B淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合，依次通过HAT、HT培养基筛选出针对番茄溃疡病菌阳性的杂交瘤细胞， 用有限稀释克隆的方法进行克隆化培养，通过杂交瘤细胞体内诱导腹水产生和体外培养， 制备大量单克隆抗体；进一步分离和纯化单克隆抗体，得到单克隆抗体。所述的番茄溃疡病菌单克隆抗体的试剂盒，包括有①包被缓冲液稀释抗番茄溃疡病菌的单抗100-150uL ；② 待测样品包被酶标板lOOul，以双蒸水为阴性对照；以CMM菌液IOOul为阳性对照；③洗板， PBST洗涤4次，每次aiiin ；④酶标抗体HRP羊抗鼠IgG，每孔IOOul ；⑤洗板，PBST洗涤4次， 每次aiiin;⑥加TMB为3'，3'，5'，5'，-四甲基联苯胺显色液，每孔IOOul。所述的番茄溃疡病菌单克隆抗体的试剂盒的使用方法，用包被缓冲液将抗番茄溃疡病菌的单抗作为一抗，稀释至l-10ug/mL，在酶标板反应孔中加0. ImL ；然后加浓度为103_8cfu/mL稀释的待检样品0. ImL,同时做空白对照，以双蒸水为阴性对照；以CMM菌液IOOul为阳性对照；再加酶标抗体HRP羊抗鼠IgG ；再加底物液显色；最后终止反应于各反应孔中加入终止液0. ImL ； 测0D450/630值，并计算P/N值，N为标准品对照孔的OD值，P为竞争抑制物的OD值；重复3次，以测定值大于2. 1者判定为阳性。酶标板分别用CMM(密执安帮杆菌)标准菌株和 CMT(小麦花叶病菌)、CMS(马铃薯环腐病菌)、CMI (苜蓿细菌性萎蔫病菌)、CMN(玉米高氏细菌萎蔫病菌)菌株倍比稀释包被酶标板。本发明的有益效果本发明用番茄溃疡病菌多次皮下免疫BALB/C小鼠，以获得可以分泌产生这种细菌抗体的特异性的B淋巴细胞，将此B 淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合，通过HAT、HT培养基筛选杂交瘤细胞，筛选得到大量针对不同抗原或不同抗原表位的抗体，用有限稀释克隆的方法进行克隆化培养，通过体内杂交瘤细胞诱导腹水的产生和体外冻存的方法大量制备单克隆抗体，同时由于单克隆抗体的均质性及易于大量生产，进而解决了抗体全部依赖进口，检测成本高等问题，使免疫学检测在番茄溃疡病检测中的运用得到普及，为番茄溃疡病菌敏感、稳定和快捷的检测提供必要的保证。
图1单克隆抗体制备原理图；图2单克隆抗体制备流程图；图3纯化菌液直接 PCR结果；图4细胞融合后亚克隆过程中杂交瘤细胞生长情况；图5体内诱生腹水法制备单克隆抗体；图6单抗纯度鉴定；图7图6单克隆抗体特异性鉴定。
具体实施例方式以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。实施例1 一种番茄溃疡病菌单克隆抗体的制备方法，其特征是番茄溃疡病病原菌为密执安棒形杆菌密执安亚禾中(Clavibactermi chiganensissubsp. michiganensis，Cmm)， 用密执安棒杆菌免疫BALB/C小鼠，以获得可以分泌产生该种细菌抗体的特异性的B淋巴细胞，将此B淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合，依次通过HAT、HT培养基筛选出杂交瘤细胞，用有限稀释克隆的方法进行克隆化培养，通过杂交瘤细胞诱导腹水产生和体外培养，制备大量单克隆抗体。最后，进一步分离和纯化单克隆抗体，鉴定单克隆抗体亚类，测定抗体亲和力，效价等。(见图1 2)制备特异性识别番茄溃疡病菌的单克隆抗体，步骤如下1抗原制备 取Cmm菌株于523液体培养基(包括蔗糖10g、聚蛋白胨Sg、酵母粉4g、琼脂18g、磷酸氢二钾2g、结晶硫酸镁0. 3g)中25 (最适温度^°C)，振荡培养18h，用接种环挑取密执安棒杆菌液在523固体培养基上划线，28°C静置培养48h ；用接种针将培养后长出的单个菌落挑取少许接种于523液体培养基中，置于恒温振荡器上振荡培养15 18h，此时菌液0D600nm值为0.25(细菌约为108cfu/mL)收集菌体，进行菌落计数。用PCR对该菌进行鉴定，将该菌液分装于IOmL离心管中离心，6000rpm、20min，弃去上清，加入适量生理盐水， 混勻后再离心。同上操作三次后用生理盐水将所得沉淀垂悬，调节浓度至2X109cfu/ml，无菌检验合格后做免疫抗原。(见图3)2.动物免疫(1)取纯化菌液与等量福氏完全佐剂混合乳化至滴入水中呈不分散状时，以皮下四点免疫方法分别免疫4只6 8周的BALB/C小鼠， 免疫剂量0.5mL/只(全菌3 X IO8Cfu/只)。首免21d后加强免疫，间隔14d追加免疫，直至间接ELISA检测血清抗体效价达1 10000以上。首免用福氏完全佐剂乳化，以后用福氏不完全佐剂。融合前3d再冲击免疫1次。(2)实验所需溶液ELISA检测用溶液(1)包被液称取 NaHCO3 2. 93g, Na2CO3 1. 59g，加蒸馏水至 lOOOmL，调节 PH 值 9. 6，4°C保存。(2) PBS 缓冲液称取 NaC18. Og, 4ΗΡ04 · 12H20。2. 9g，KCl 0. 2g，KH2PO4O. 2g，加蒸馏水至 IOOOmL,调节 PH7. 4。(3)洗涤液1000mL PBS 缓冲液，加 0. 5mL Tween-20。(4)底物缓冲溶液(TMB3， 3，5，5，_四甲基联苯)购置北京天耕。( 终止液蒸馏水与浓硫酸按照1778 222比例混合，制得2M H2SO4溶液。单克隆抗体制备用溶液(1)双抗溶液100mL双馏水中加入青霉素80万U、链霉素100万U，0. 22 μ m滤膜过滤除菌。⑵不完全培养液PRMI_1640培养液(购于美国Sigma公司)1袋按照使用说明书称取相应的药品加超纯水定容，0. 22 μ m滤膜过滤除菌。( 完全培养液不完全培养液和标准胎牛血清按照1 4的比例进行混合。 (4)HAT培养液(购于美国Sigma公司)完全培养液与HAT(购于美国Sigma公司)按照 49 1比例混合。(5)HT培养液(购于美国Sigma公司)完全培养液与HT按照49 1比例混合。 3.细胞融合将已制备好的SP2/0骨髓瘤细胞及脾细胞以1 5混合，1000r/min 离心5min，弃上清，用手指轻弹离心管，振散细胞团块。将离心管倾斜，缓慢加入37°C预热的PEG1500 (在30s内勻速加完0. 6mL, 1. 5min滴完，再作用90s，并轻轻吹打几次)，再缓慢滴入1640基础培养基10mL，轻轻转动离心管将细胞悬起，1000r/min离心5min，同样的方法再洗涤2次，彻底去除PEG。最后一次离心后弃上清，加入IOml的IXHT培养液轻轻将细胞悬起，滴入已准备好饲养细胞的96孔板中，每孔100 μ L，置37°C 5%的(X)2培养箱中培养。4.间接ELISA检测方法的建立与阳性杂交瘤细胞株的克隆、筛选用倍比稀释的方法测定免疫小鼠的多抗血清效价，在酶标板上做方阵点样，根据反应结果确定抗原、抗体的最佳稀释度，最适封闭液和封闭时间，包被温度和时间。以标准菌株CMM作抗原筛选多抗血清和阳性杂交瘤细胞株，操作步骤如下CMM菌液包被酶标板，免疫小鼠多抗血清用保温液 100X、200X、400X、800X、1600X ,3200X ,6400X、12800X 稀释纵向加入，正常小鼠血清 1000X倍比稀释作为阴性对照，二抗加1 8000稀释的HRP标记羊抗鼠。待底物显色适中，每孔滴加100 μ L终止液，酶联检测仪测定双波长0D450630值。用建立的ELISA方法测定杂交瘤细胞培养上清效价，选择效价高的细胞进行亚克隆。4次亚克隆后阳性率为100% 的细胞株扩大培养，然后细胞冻存。(见图4)有限稀释克隆方法(1)制备饲养层细胞取正常小鼠腹腔巨噬细胞，制成细胞悬液，接种96孔板，每孔0. Iml，含个细胞2 X IO4个细胞。 (2)吹打杂交瘤细胞培养板中孔内的克隆，悬浮于完全培养液中。(3)取样，用血球计数板计数，调整细胞浓度至100、50、10个/ml. (4)分别用三种浓度的杂交瘤细胞浓度接种于含饲养细胞的培养板中，每孔0. lml，理论上每孔含10、5、1个细胞。(5)置37°C 5%的0)2培养箱中培养。培养5-7天取细胞上清进行抗体检测。(6)对阳性单克隆再克隆化培养，直到100%的克隆分泌特异性抗体为止。5.单克隆抗体的大量制备选8 10周体重20g以上雌性BALB/C小鼠，采用动物体内诱生单克隆抗体的方法制备。将0. 5mL的石蜡油注射到小鼠腹腔1周后，将细胞注入经石蜡油处理过的小鼠腹腔，IO5Cfu/只。7 IOd后，当小鼠腹部极度膨胀时用无菌18号针头抽取腹水。将收集好的腹水置37°C 2h，随后置4°C过夜， 第2d将腹水lOOOr/min离心lOmin，20°C冰箱保存备用。(见图5)6.单克隆抗体鉴定6. 1 单克隆抗体效价测定将单克隆抗体倍比稀释，用建立的ELISA方法测定纯化后腹水中的抗体效价，以待测孔的OD值大于或等于阴性对照孔的2. 1倍者判为阳性，以判为阳性的最高稀释倍数为效价判定终点效价。试验重复3次，计算平均值。6. 2单克隆抗体的亚类鉴定及纯化按亚类测定试剂盒说明书测定单抗亚型。IgG采用辛酸=饱和硫酸铵法进行纯化，纯化的腹水IgG进行12% SDS-PAGE电泳测定抗体分子量，具体操作参照《分子克隆实验指南》，参考抗体的含量测定采用双波长紫外分光光度法。(见图6)6. 3单克隆抗体的亲和力测定采用间接ELISA法。CMM菌液包被酶标板，用纯化的单克隆抗体倍比稀释进行间接 ELISA检测，绘制反应曲线。以曲线上趋于平坦段的最大0D490值一半时的抗体浓度计算单克隆抗体的亲和常数，确定抗体与抗原的结合能力。6. 4杂交瘤细胞染色体的计数采用秋水仙素阻断法检测杂交瘤细胞染色体的平均数目。6. 5、单克隆抗体特异性检测酶标板分别用CMM标准菌株和CMT、CMS、CMI, CMN等菌株倍比稀释包被酶标板，然后按间接ELISA操作程序加单克隆抗体及HRP-羊抗鼠IgG，测定0D450/630值，并计算P/N值(N为标准品对照孔的OD值，P为竞争抑制物的OD值)。重复3次，以测定值大于2. 1者判定为阳性。实施例2 番茄溃疡病菌单克隆抗体的试剂盒，其主要特点是包括有①包被缓冲液稀释抗番茄溃疡病菌的单抗100-150uL ；②待测样品包被酶标板lOOul，以双蒸水为阴性对照；以CMM 菌液IOOul为阳性对照；③洗板，PBST洗涤4次，每次aiiin ；④酶标抗体HRP羊抗鼠IgG， 每孔IOOul ；⑤洗板，PBST洗涤4次，每次aiiin ；⑥加TMB (3，3，5，5，-四甲基联苯)显色液，每孔lOOul。实施例3 番茄溃疡病菌单克隆抗体的试剂盒的使用方法，用包被缓冲液将抗番茄溃疡病菌的单抗作为一抗，稀释至Ι-lOug/mL，在酶标板反应孔中加0. ImL ；然后加一定浓度(IO3-8CfuAiL)稀释的待检样品0. ImL,同时做空白对照，阴性对照及阳性对照； 再加酶标抗体HRP羊抗鼠IgG ；再加底物液显色；最后终止反应于各反应孔中加入终止液 0. ImL ；测0D450/630值，并计算P/N值，N为标准品对照孔的OD值，P为竞争抑制物的OD 值；重复3次，以测定值大于2. 1者判定为阳性。实施例4 对番茄溃疡病菌和非番茄溃疡病菌菌株特异性性验证试验(见图7)收集1株番茄溃疡病菌(Clavikicter michiganensis subsp. michiganensis, Cmm)和4株非番茄溃疡病菌菌株验证本试剂盒的特异性，这4株病菌分另 1J为玉米高氏细菌萎蔫病菌:Clavibacter michiganensis subsp, nebrakensis (CMN) 小麦花叶病菌 :Clavibacter michiganensissubsp，tessellarius (CMT)马铃暮环腐病菌 Clavibacter michiganensissubsp, sepedonicum(CMS) "猜细菌t生妻薦病菌:Clavibacter michiganensissubsp，insidisus (CMI)。将 CMM、CMN、CMS、CMT、CMI 菌液各 100 μ L(浓度为108Cfu/mL)，包被酶标板；置于96孔酶标板中，37°C孵育池后4°C过夜，然后弃去96孔酶标板内的检测样品，用PBST冲洗2-3次，然后用10%的BSA(小牛血清)封闭，37°C，1. 5h ； 免疫小鼠杂交瘤细胞血清用保温液100 X、200 X、400 X、800 X、1600 X、3200 X、6400 X、 12800X稀释纵向加入，正常小鼠血清1000X倍比稀释作为阴性对照，37°C，lh，用PBST冲洗2-3次；二抗加1 8000稀释的HRP标记羊抗鼠100 μ L，37°C，lh，用PBST冲洗2-3次; 然后加TMB显色液，100 μ L，15-30min,室温；待底物显色适中，每孔滴加100 μ L终止液，酶联检测仪测定0D630值。实验结果表明，本抗体和其它4种菌株交叉反应不明显，说明对番茄溃疡病菌具有较高的特异性。以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明， 凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
权利要求
1.一种番茄溃疡病菌单克隆抗体的制备方法，其特征是用密执安棒杆菌免疫BALB/C 小鼠，以获得分泌产生该种细菌抗体的特异性的B淋巴细胞，将此B淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合，依次通过HAT、HT培养基筛选出针对番茄溃疡病菌阳性的杂交瘤细胞，用有限稀释克隆的方法进行克隆化培养，通过杂交瘤细胞体内诱导腹水产生和体外培养，制备大量单克隆抗体；进一步分离和纯化单克隆抗体，得到单克隆抗体。
2.如权利要求1所述的番茄溃疡病菌单克隆抗体的试剂盒，其特征是包括有①包被缓冲液稀释抗番茄溃疡病菌的单抗100-150uL ；②待测样品包被酶标板lOOul，以双蒸水为阴性对照；以CMM菌液IOOul为阳性对照；③洗板，PBST洗涤4次，每次^iin ；④酶标抗体 HRP羊抗鼠IgG，每孔IOOul ；⑤洗板，PBST洗涤4次，每次aiiin;⑥加TMB为3'，3'，5'， 5'，-四甲基联苯胺显色液，每孔lOOul。
3.如权利要求2所述的番茄溃疡病菌单克隆抗体的试剂盒的使用方法，其特征是用包被缓冲液将抗番茄溃疡病菌的单抗作为一抗，稀释至Ι-lOug/mL，在酶标板反应孔中加 0. ImL ；然后加浓度为103_8cfu/mL稀释的待检样品0. ImL,同时做空白对照，以双蒸水为阴性对照；以CMM菌液IOOul为阳性对照；再加酶标抗体HRP羊抗鼠IgG ；再加底物液显色；最后终止反应于各反应孔中加入终止液0. ImL ；测0D450/630值，并计算P/N值，N为标准品对照孔的OD值，P为竞争抑制物的OD值；重复3次，以测定值大于2. 1者判定为阳性。
全文摘要
本发明涉及一种高特异性、高灵敏性检测引发番茄溃疡病的密执安棒杆菌的单克隆抗体，属于植物检疫和植物保护领域，专一针对番茄溃疡病菌的检测。一种番茄溃疡病菌单克隆抗体的制备方法，其主要特点是用番茄溃疡病菌免疫BALB/C小鼠，以获得分泌产生该种细菌抗体的特异性的B淋巴细胞，将此B淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合，依次通过HAT、HT培养基筛选出杂交瘤细胞，用有限稀释克隆的方法进行克隆化培养，通过杂交瘤细胞诱导腹水产生和体外培养，制备大量单克隆抗体；进一步分离和纯化单克隆抗体。
文档编号C07K16/12GK102206274SQ201110068329
公开日2011年10月5日 申请日期2011年3月22日 优先权日2011年3月22日
发明者刘箐, 孔君, 熊亮斌 申请人:上海慧耘生物科技有限公司