专利名称：大肠杆菌TolC抗原及其抗体与应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种抗大肠杆菌TolC片段的抗体。
背景技术：
近年来细菌耐药日趋严峻，成为医药界倍受关注的问题。由于抗生素滥用造成细 菌耐药性问题尤为突出。我国临床分离的一些细菌对某些药物的耐药性已居世界首位。除 耐青霉素的肺炎链球菌、耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌、肠球菌、真菌等多种耐药菌外，进 入我国仅20多年的喹诺酮类抗生素的耐药率已经达60%-70%。据报道，包括广州在内的 国内一些大城市人群感染的金黄色葡萄球菌中，80%已经产生了对青霉素G的耐药性。凯 福隆、头孢三嗪等第三代的头孢类菌抗生素的应用已日趋普遍，抗生素品种的选用明显超 前。抗生素的滥用主要是由于抗生素生产和销售管理薄弱、临床的误用和滥用、以及将抗生 素作为生长促进剂在动物养殖中广泛使用所导致。由于在抗生素使用与病原菌耐药水平之 间存在着一种宏观的量化关系，即一定范围内的抗生素使用可以导致病原菌整体耐药水平 以及耐药菌感染率的变化。由此，人和动物的肠道正常菌群暴露于抗生素而普遍产生耐药 性，并通过粪便直接污染环境、水、食品，导致耐药菌不断增加，也使人体接触耐药菌的机会 不断增加。因此耐药菌的种类非常广泛。这样一来，人体如果再获得耐药菌的感染治疗起 来就比较困难。因此，控制目前已经广泛存在的耐药菌已成为一个重要的社会和科学问题。耐药菌的防制尚不能完全寄托在新抗生素的发现和发明，因为抗生素的生产与发 展伴随着细菌耐药性的不断发展，一种新的抗生素投入使用后，很快就发现有相应的抗性 菌株出现。在细菌中普遍存在的抗药性是对抗菌药物的生产开发及对细菌性疾病防治的一 个巨大挑战，直接危害食品安全和人类健康。对细菌耐药机理的深入研究，发现其作用靶点 是解决这一难题的关键。业已报道，大肠杆菌外膜蛋白TolC是耐药关键蛋白，是AcrAB-TolC药物外排系统 中重要组成组分。我们先前证明，采用抗TolC可以负调TolC的耐药作用，起到靶向抑制耐 药菌生长的目的，但其作用的靶序列不清楚。我们先前采用的抗TolC的抗体，是针对整个 TolC蛋白。根据生物信息分析，整个TolC蛋白具有线性B细胞表位27个，此外还有非线 性B细胞表位。由于每个表位均能够刺激机体产生免疫应答，故针对整个TolC蛋白至少可 以产生27个各自表位特异性的抗体。由于各表位氨基酸序列不同，其生物学功能亦具有差 异，抗体作用后产生的效应亦存在差异。此外，抗体也存在一定的交叉反应，可以跨物种进 行反应，即所谓的抗体异嗜性现象。因此，采用针对整个蛋白的特异性抗体，具有靶序列特 异性不明确、副反应不清楚的不足，不利于其有关成药特性的研究。
发明内容
本发明的目的是在于针对现有技术的不足，提供一种针对TolC耐药关键结构域 的抗体，以克服目前的抗体具有靶序列特异性不明确、副反应不清楚的的缺陷，提高抗体的 有效性和安全性。
本发明通过以下技术方案实现上述目的发明提供了一种大肠杆菌(E. coli) TolC抗原，包括如SEQ ID NO :1(SEQ ID NO: 1 :SNGYRDANGI)所示的序列。本发明也提供了一种抗原，由上述大肠杆菌TolC抗原与血蓝蛋白偶连。)同时发明保护了编码如权利要求1所述大肠杆菌TolC抗原的基因片段，具有SEQ ID NO :2 所不的序歹丨J0 SEQ ID NO :2 :agca acggctaccg cgacgcgaac ggcatc。上述两种抗原可用于制备抗体，所产生的抗体可以与大肠杆菌外膜蛋白TolC特 异结合，从而抑制细菌的耐药性。该抗体具有针对SEQ ID NO :1氨基酸序列的多肽，由以下 方法获得根据NCBI公布的E. coli K-12 TolC氨基酸序列，合成SNGYRDANGI片段(简称 TolC-十肽)，合成多肽产物与血蓝蛋白偶连以提高免疫原性。将人工合成SNGYRDANGI片段 和血蓝蛋白的偶连物与福氏完全佐剂混合均勻形成油包水乳剂，注射免疫动物，注射量100 微克-1毫克/只；其后采用福氏不完全佐剂；每次间隔10-20周，第3-5次免疫后的第7-10 天取血，于低温下静置，使血清自然析出。可以优选以下方法制备将人工合成SNGYRDANGI 片段TolC-十肽和血蓝蛋白的偶连物与福氏完全佐剂1 1 (ν/ν)混合均勻形成油包水，采 用背部多点注射免疫动物家兔，注射量每千克动物体注射为500 μ g/只；其后采用福氏不 完全佐剂，每次间隔2周，第3次免疫后的第10天，心脏取血，摆成最大斜面后在4°C冰箱中 静置过夜，使血清自然析出。以未与血蓝蛋白偶连的合成多肽产物为抗原，采用Dot-ELISA 技术测定效价为1 4000。本发明提供的抗体，可用于制备抑制细菌耐药性药物；所述的 细菌为大肠杆菌、痢疾杆菌、沙门氏菌、克氏柠檬酸杆菌、戴阿利斯特杆菌属、肺炎克雷伯菌 或链霉菌。通过大量的试验证明，本发明的针对SEQ ID NO :1氨基酸序列的多肽特异性抗体 (即抗TolC-十肽)，可以与大肠杆菌TolC基因编码蛋白TolC的关键耐药结构域结合，具 有非常特异、稳定的靶向性作用，从而抑制耐药菌的耐药性。为了进一步验证发明的有效性和抗耐药机理，本发明采用基因突变技术，构建了 大肠杆菌TolC片段SNGYRDANGI的突变体TolCl。通过抑菌试验，证明该突变体的耐药功能 较野生型明显下降。这些结果表明，TolC片段SNGYRDANGI对TolC的耐药功能至关重要。接着制备了 TolC片段SNGYRDANGI的抗体(命名为抗TolC-十肽)，采用体外抗体 靶向疗法，证明抗TolC-十肽能够在含四环素的培养基中明显抑制包括耐药大肠杆菌在内 的该种细菌的生长。经抗TolC-十肽处理后的细菌，其生长被抑制的程度与同条件培养下 抗TolC处理的生长情况一致。此结果说明TolC片段SNGYRDANGI是抗TolC负调TolC耐 药功能的作用靶点。进一步建立了大肠埃希菌外阴感染小鼠模型，通过抗TolC-十肽配合低浓度庆大 霉素可以明显抑制小鼠外阴细菌感染的试验，进一步证明TolC片段SNGYRDANGI是抗TolC 负调TolC作用的靶点。研究结果表明，抗TolC-十肽靶向疗法能够明显抑制耐药菌的生长，为耐药菌抗 体靶向疗法提供了一个有效的作用靶点。本发明通过构建TolC片段的突变体TolCl，以及制备针对此片段即SNGYRDANGI的 抗血清，寻找到最为关键的TolC抗体靶向抑制耐药菌生长的作用靶点——SNGYRDANGI，从 而建立针对性强、目标明确的抗体靶向作用提高耐药菌对抗生素敏感性的技术方法。同时针对该结果，提供了抗TolC-十肽，作为抗大肠杆菌TolC的抗体，该抗体所针对的氨基酸序 列仅为10个氨基酸，经预测不含有B细胞表位。我们制备的针对该序列的特异性抗体可灵 敏而特异地结合到靶向位点上，从而克服了现有技术中的多个B细胞表位容易产生抗体异 嗜性、靶序列特异性不明确、副反应不清楚等缺陷，使用更安全。与现有技术相比，本发明具有以下有益效果(1)本发明所提供的抗TolC片段SNGYRDANGI的抗体，明确了所作用的靶序列位 点，消除了原有针对整个蛋白质所有位点抗体可能存在的副作用，可以特异而有效地抑制 细菌的耐药性蛋白的耐药功能，从而克服细菌耐药性问题。(2)本发明所提供的抗体，比现有的抗体在作为药物的应用上，具有更高的安全性 和操作性。
图1为大肠杆菌K12的tolC基因PCR扩增(A)、重组子双酶切(B)及其诱导表达 (C)。图2为大肠杆菌K12 tolCl基因PCR扩增(A、B)、重组子双酶切(C)及其诱导表 达⑶。图3为TolC短片段结构域SNGYRDANGI突变体tolCl基因功能研究。图A和B为 TolCl基因在基因补救菌株(AtolC-pET-28a-tolCl)中的表达研究，A为聚丙烯凝胶电泳 分析，B为Western blotting分析。图C为最低抑菌浓度分析，图D为生存率分析。(注 A tolC为tolC基因缺失菌株)图4为抗TolC-十肽对细菌生长的抑制作用。A，免疫前血清、抗TolC和抗TolC-十 肽分别处理对TC-R，TC-R-0和A tolC在加和不加四环素培养基中生长的影响。B，A的抑 制率比较图5为抗TolC-十肽对小鼠外阴感染的治疗作用。
具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发 明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规 条件，例如Sambrook等分子克隆实验室手册(2001 by Cold Spring Harbor Laboratory Press)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例1TolC基因的克隆、原核表达、蛋白纯化及兔抗血清的制备在该实施例中，将全长的大肠杆菌TolC编码序列或片段构建入大肠杆菌蛋白质 原核表达载体之中，以达到表达和提纯目的蛋白。TolC基因编码序列如SEQ ID NO 3所示。SEQ ID NO 3 1 atgaagaaat tgctccccat tcttatcggc ctgagccttt ctgggttcag ttcgttgagc61 caggccgaga acctgatgca agtttatcag caagcacgcc ttagtaaccc ggaattgcgt121 aagtctgccg ccgatcgtga tgctgccttt gaaaaaatta atgaagcgcg cagtccatta
181ctgccacagctaggtttaggtgcagattacacctatagcaacggctaccgcgacgcgaac
241ggcatcaactctaacgcgaccagtgcgtccttgcagttaactcaatccatttttgatatg
301tcgaaatggcgtgcgttaacgctgcaggaaaaagcagcagggattcaggacgtcacgtat
361cagaccgatcagcaaaccttgatcctcaacaccgcgaccgcttatttcaacgtgttgaat
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TolC氨基酸序列如SEQ ID NO 4所示。
SEQID NO 4
1mkkllpiliglslsgfsslsqaenlmqvyqqarlsnpelrksaadrdaafekinearspl
61lpqlglgadytysngyrdanginsnatsaslqltqsifdmskwraltlqekaagiqdvty
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1. TolC基因的克隆
根据NCBI公布的大肠杆菌K12的基因序列，设计一对引物。引物序列如下正义引物(SEQ ID NO 5) :5，hCGA GAA TTC ATG CAA ATG AAG AAA-3，，反义引物(SEQ ID NO:
6) :5，-GGT AAG CTT TCA GTT ACG GAA AGG G_3，。为便于克隆和表达载体的构建，在引物 上分别引入限制性内酶位点EcoR I和Hindlll。引物由大连宝生物工程公司合成。以热变 性法获得的大肠杆菌K12全基因组为模板，通过PCR反应获得目的条带(图1A，泳道1为
6DNA分子量标准，泳道2为目的条带)。用限制性内酶EcoR I和Hindlll分别酶切回收的 DNA片断和pET-His (Novagen)表达载体，参照Takara公司的使用说明书进行连接反应，连 接产物转化E. coli DH5 a感受态，通过双酶切(图1B，泳道1为DNA分子量标准，泳道2为 目的条带)和序列测定重组子的正确性，结果证明与数据库公布序列完全一致。2.TolC基因的表达将正确的重组质粒以热激法转化大肠杆菌BL21表达菌，37°C培养12_16小时。接 种单菌落于含氨苄青霉素(Amp)的LB液体培养基中，同时接种含有pET-HIS质粒的BL21 作为对照，于30°C培养至0D(600nm)值0.6，加入IPTG 100 u g/mL 35°C诱导2个小时，离心 收集菌体，用SDS-PAGE检测插入片段是否表达蛋白，以及表达蛋白的分子量大小。接着，进 行蛋白表达产物为可溶组分抑或是不溶组分(包涵体)的鉴定。具体过程如下将离心后 沉淀重悬于1/10体积的PBS或50mmol/L Tris缓冲液(pH8. 0)中；加入溶菌酶至100 u g/ mL，保温30分钟；反复冻融数次以破坏细胞壁，用超声波处理剪切DNA(超声波的强度以不 能产生气泡为适宜；裂解的时间根据实际情况掌握，一般将云雾状的细菌悬浮物裂解至比 较清朗即可)；离心(12，OOOrpm) 15分钟后将培养物分为可溶部分和不溶部分；将15 y L上 清与4yL 4XSDS样品缓冲液混合，将沉淀物重悬于1XSDS样品缓冲液；将表达样品(上 清及沉淀)和非表达对照物进行SDS-PAGE电泳并以考马斯亮蓝染色以便在预计分子量范 围内观察表达蛋白带。经鉴定表达产物为可溶蛋白。表达后的图谱如图1C(泳道1为蛋白质分子量标准，泳道2和3分别为pET_28a 和目的基因诱导表达)所示。由图可见，E. coli K-12 tolC基因确实已经连接到pET-28a 载体上，并能在E. coli BL21中成功表达，其重组蛋白大小约为53. 9kDa，与其实际分子量 相符。3. TolC基因产物的纯化大量培育菌体，离心后超声处理，离心收集上清用Ni-NTA His亲和柱纯化。采用 pH5. 9 (buffer F)和pH4. 5 (buffer G)两个不同pH值的缓冲液纯化蛋白。用冲洗缓冲液 buffer E(8mol/L 尿素，0. lmol/L NaH2P04，lOmmo 1/LTr is-He l，pH 6. 3)洗涤 5 次，每次 lmL; 用洗脱缓冲液 buffer F(8mol/L 尿素，0. lmol/LNaH2P04,10mmol/LTris-HCl, pH 5.9)洗脱 目的蛋白4次，每次lmL，收集洗脱液；用洗脱缓冲液buffer G(8M尿素，0. lmol/L NaH2P04, 10mmol/LTris-HCl,pH 4. 5)洗脱蛋白4次，每次lmL，收集洗脱液。取收集液进行SDS-PAGE 分析。纯化蛋白进行紫外检测，测定蛋白含量。4.兔抗血清的制备将纯化蛋白溶液与福氏完全佐剂1 l(v/v)混合均勻形成油包水，采用背部多点 注射免疫家兔，注射量为500 u g/只；其后采用福氏不完全佐剂，每次间隔2周，第3次免疫 后的第10天，心脏取血，将得到的血摆成最大斜面后在4°C冰箱中静置过夜，使血清自然析 出。通过Dot-ELISA测定效价为1 8000。分装，_80°C保存。实施例2TolC片段SNGYRDANGI突变基因(tolCl)的克隆1. TolC片段突变基因tolCl引物的设计以疏水氨基酸替换为其它疏水氨基酸、亲水氨基酸替换为其它亲水氨基酸为原 则，对TolC氨基酸序列中片段SNGYRDANGI进行氨基酸替换，替换结果为RQCATKFHCL。在
7tolC基因的核苷酸序列中，找到该氨基酸序列相应的核苷酸序列(SEQ ID N0:7) 5' -AGC AAC GGC TAC CGC GAC GCG AACGGC ATC-3’，根据氨基酸的密码子，该核苷酸序列相应地被 替换为(SEQ IDN0 8) :5，-CGT CAG TGC GCT ACT AAG TTC CAT TGC CTG-3，。因此，根据 tolC基因的核苷酸序列进行短片段突变tolC基因(命名为tolCl)5’端和3’端两对引物 的设计(表1)，同时分别在5’正向引物及3’端反向引物中引入EcoRI和Hindlll酶切位 点(横线所示)，以进行融合PCR。tolCl-5’端反向引物的3’端从197位核苷酸处开始， tolCl-3，端正向引物5，端从216位核苷酸处开始，因此tolCl-5，端和tolCl-3，端两条引 物共有27个核苷酸的重叠，以利于融合PCR的进行。表ltolCl引物序列
权利要求
大肠杆菌TolC抗原，其特征在于包括如SEQ ID NO1所示的序列。
2.一种抗原，其特征在于由权利要求1所述的抗原与血蓝蛋白偶连。
3.编码如权利要求1所述大肠杆菌TolC抗原的基因片段。
4.如权利要求3所述的基因片段，其特征在于具有SEQID NO :2所示的序列。
5.如权利要求1或2所述的抗原在制备抗体方面的应用，所述抗体用于抑制细菌耐药性。
6.与权利要求1所述的大肠杆菌TolC抗原特异结合的抗体。
7.如权利要求6所述的抗体，其特征在于由以下方法获得根据NCBI公布的E.coli K-12TolC氨基酸序列，合成SNGYRDANGI片段，合成多肽产物与血蓝蛋白偶连以提高免疫原 性；将人工合成SNGYRDANGI片段和血蓝蛋白的偶连物与福氏完全佐剂混合均勻形成油包 水乳剂，注射免疫动物，注射量100微克-1毫克/只；其后采用福氏不完全佐剂；每次间隔 10-20周，第3-5次免疫后的第7-10天取血，于低温下静置，使血清自然析出。
8.如权利要求6所述的抗体在制备抑制细菌耐药性药物中的应用。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于所述的细菌为大肠杆菌、痢疾杆菌、沙门氏 菌、克氏柠檬酸杆菌、戴阿利斯特杆菌属、肺炎克雷伯菌或链霉菌。
全文摘要
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种大肠杆菌TolC抗原及抗体，该抗体具有特异性针对SEQ ID NO1所示的序列。本发明同时提供了编码该大肠杆菌TolC抗原的基因序列；以及该抗体在制备抑制细菌耐药性药物中的应用。本发明所提供的抗TolC片段SNGYRDANGI的抗体，提高了细菌对抗生素的敏感度，可以特异而有效地抑制大肠杆菌的耐药外膜蛋白TolC的功能，从而克服细菌耐药性问题。本发明所提供的抗体，比现有的抗体在作为抗细菌耐药性药物的应用上，具有更高的安全性和操作性。
文档编号C07K14/795GK101974072SQ20101051322
公开日2011年2月16日 申请日期2010年10月12日 优先权日2010年10月12日
发明者彭宣宪, 李惠 申请人:中山大学