在植物中表达抗肠产毒性大肠杆菌的抗体的制作方法

专利名称：在植物中表达抗肠产毒性大肠杆菌的抗体的制作方法
背景技术：
肠产毒性大肠杆菌(Escherichia coli)(肠产毒性大肠杆菌(E.coli)；ETEC)是世界上人类和动物中急性腹泻疾病的主要原因。新生动物的感染性腹泻是动物农业产业中遇到的最普通和经济毁灭性的疾病之一(Holland，Clin Microbiol.Rev.，3345，1990)。表征ETEC的两种毒力特征是小肠表面的定居和肠毒素的产生。ETEC产生两种类型肠毒素，热不稳定肠毒素(LT)和热稳定肠毒素(ST)。LT与霍乱毒素密切相关，并且是包含环形排列的5个相同B亚基和一个A亚基的85kDa寡聚蛋白质。相反，STs是小的单体毒素，具有约5kDa的分子量。STs分为2个不同的类别，ST-1和ST-II(Fassano，Gut，50(增刊III)III9-III14，2002)。
其它必需的毒力特征是允许它们定居于肠粘膜的细菌细胞的结构成分。这些之中最重要的是菌毛或伞毛。病理包括伞毛结合绒毛上皮细胞的粘液和顶端细胞表面上糖蛋白或糖脂受体，和腹泻的诱导，很大程度是通过肠毒素的作用。用数字表述抗原性上鉴定的伞毛。家畜ETEC表达的主要抗原包括K88(F4)，K99(F5)，987P(F6)，F18ac(以前称为F107ac和2134P)，和F41。在人类中，抗原称为定居因子(CFs)。大多数CFs是伞毛蛋白质，并且由单CFA/I组成，而其它CFs，诸如CFA/II和CFA/IV由不同抗原的复合物形成，称为大肠菌表面抗原(CS)(Wiseman等，Emerging Infectious Diseases，5395-403，1999)。
家畜中集约化管理和人工饲养实践增加的应用增加了年幼家畜中临床ETEC感染的发病率。在出生后最初4天期间感染的动物中，由于肠毒素诱导的腹泻疾病的损失可能特别显著。尽管在猪中一直到5周龄，ETEC感染都可以引起问题，但是随着动物年龄的增长，它们自然获得了抵抗ETEC感染的能力。然而，在新生儿期，家畜没有抗ETEC的天然防御，并且感染动物中的死亡率可以达到70％。哺乳的新生家畜可以通过摄食初乳中母亲的抗体被动免疫，但是因为成年动物对ETEC伞毛蛋白质不敏感，成年母牛、母羊和母猪中抗体效价倾向于较低或不存在。为了试图加强母亲抗体的转移，已经使用了母畜妊娠后期的抗ETEC伞毛抗原的分娩前接种(Acres等，Infect.Immun.25121-126，1979；Nagy Infect.Immun.，2721-24，1980)。尽管这种方法是成功的，但是该方法受限于需要多次分娩前接种，需要精确地确定什么时候应该发生妊娠接种，和母畜之间对接种免疫应答的固有变异性。此外，该方法不适于人类个体或成年个体，诸如人类旅行者腹泻的预防。
另一种可替代的方法是通过施用含有抗ETEC抗体的组合物的被动免疫。因为ETEC存在于小肠中，使用了口服施用抗体。可以在Reilly等，Clin.Pharmacokinet.，32313-323，1997和Carlander等，Immunol.Res.，211-6，2000中发现口服施用抗体治疗肠病原体的综述。
抗ETEC被动免疫的结果是相互矛盾的。美国专利号4,652,448公开了通过施用由杂交瘤细胞获得的单克隆抗体(美国专利4,443,549)预防和治疗动物中肠毒素诱导的腹泻的方法。Tacket等，N.Engl.J.Med.，3181240-1243，1988报道了口服施用从初乳或用几种ETEC血清型免疫的母牛制备的冻干免疫球蛋白提供了抗ETECH10407(078H11)攻击的保护。Sherman等，Infect.Immun.，42653-658，1983，发现口服施用含有小鼠K99单克隆抗体的小鼠腹水降低了严重性和死亡率，但是没有降低小牛中腹泻的发病率。Yokoyama等，Am.J.Vet.Res.，54867-872，1992，报道每天以高剂量口服施用蛋黄IgG时，提供了抗K88攻击的保护。蛋IgG在新生和断奶前的猪中存活得很好，但是在28天龄的猪中很快消失。在相似的研究中，Yokoyama等，发现在3天期间，每日3次口服施用来自于抗ETEC免疫母鸡的干燥蛋黄粉末，以剂量依赖方式减少了ETEC攻击的死亡率。Freedman等，J.Infect.Dis.，177662-667，1998，报道来源于抗大肠杆菌(E.coli)免疫母牛牛奶的冻干抗体浓缩物与碳酸氢钠一起口服施用，在ETEC 服攻击后提供了抗临床腹泻的保护。在美国专利号3,984,539；4,096,244；4,623,541；和4,816,252中可以发现口服施用抗体的其它例子。
相反，Casswall等，Scand.J.Gastroenterol.7711-718，2000，发现口服施用来自于超免疫母牛的牛奶免疫球蛋白浓缩物在由肠产毒性或肠道病原大肠杆菌引起的急性腹泻治疗中没有显著的治疗益处。同样，Tacket等，J Infect.Dis.，1802056-2059，2000，报道口服施用来源于母牛牛奶的部分地肠包被浓缩免疫球蛋白制备物不能保护抗ETEC的攻击。这些互相矛盾的结果可能部分是由于不同单克隆抗体对特定靶亲和性的显著变异性。如果不生物化学测定确定的和最适宜的结合特征，这种变异性就可以产生异常的结果。
尽管在许多情况下报道是成功的，但是本领域认识到商业开发被动免疫抗ETEC的产品受缺少用于产生大量特异性抗体的方法的限制(Freedman等，J.Infect.Dis.，177662-667，1998)。
植物提供了产生大量蛋白质的有效和经济的方法。例如，在Walmsley和Arntzen，Curr.Opin.Biotechnol.，11126-129，2000；Doran，Curr.Opin.Biotechnol.，11199-204，2000；Giddings等，Nature Biotechnol.，181151-1155，2000；和Djaniell等，Trends Plant Sci.，6219-226，2001中可以发现植物用于产生医学有用的蛋白质的用途综述。有大量在植物中成功产生哺乳动物抗体的报道。其中的一些例子包括Zeitlin等，Nature Biotech.，161361-1364，1998；Artsaenko等，Molec.Breeding，4313-319，1998；Stoger等，Plant Molec.Biol.，42583-590，2000；Chargelegue等，Transgenic Res.，9187-194，2000；Bakker等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，982899-2904，2001；美国专利5,202,422；5,639,947；5,759,808；5,840,526；5,959,177；5,990,385；6,046,037；6,020,169；6,080,560；欧洲专利和专利申请EP 0497904；EP1048734；EP1118669；和PCT公布WO9106320；WO9742313；和WO0025574。
因此，特别是在当以未纯化、部分纯化或基本纯化形式肠内施用抗体时这种抗体有效地预防和/或治疗这种病原体的情况下，所需要的不仅是大量产生抗肠病原体抗体的经济的方法。本发明通过在植物中产生这种抗体、或其片段满足这种需要。

发明内容
本发明尤其提供了编码识别肠病原体的免疫球蛋白轻链和/或重链和其片段的多核苷酸。特别地，这种轻链和重链和其片段对大肠杆菌(E.coli)K88或K99抗原是特异的。
在本发明的几个方面中提供了包含SEQ ID NO.1或其互补序列的分离的多核苷酸。一个实施方式提供了与SEQ ID NO.1或其互补序列具有至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，至少90％，至少95％或至少99％序列同一性或同源性的分离的多核苷酸。另一个实施方式提供了包含至少15个核苷酸的分离的多核苷酸，该多核苷酸在严格性条件下或高严格性的条件下与任何一种前述分离的多核苷酸杂交。还是在另一个实施方式中，前述分离的多核苷酸编码免疫球蛋白的至少一个可变区。在一方面，多核苷酸编码免疫球蛋白重链的至少一个可变区。
另一方面提供了包含SEQ ID NO.3或其互补序列的分离的多核苷酸。一个实施方式提供了与SEQ ID NO.3或其互补序列具有至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，至少90％，至少95％或至少99％序列同一性或同源性的分离的多核苷酸。另一个实施方式提供了包含至少15个核苷酸的分离的多核苷酸，该多核苷酸在严格性条件下或高严格性的条件下与任何一种前述分离的多核苷酸杂交。还是在另一个实施方式中，前述分离的多核苷酸编码免疫球蛋白的至少一个可变区。在一方面，多核苷酸编码免疫球蛋白重链的至少一个可变区。
另一方面提供了包含SEQ ID NO.2或其互补序列的分离的多核苷酸。一个实施方式提供了与SEQ ID NO.2或其互补序列具有至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，至少90％，至少95％或至少99％序列同一性或同源性的分离的多核苷酸。另一个实施方式提供了包含至少15个核苷酸的分离的多核苷酸，该多核苷酸在严格性条件下或高严格性的条件下与任何一种前述分离的多核苷酸杂交。还是在另一个实施方式中，前述分离的多核苷酸编码免疫球蛋白的至少一个可变区。在一方面，多核苷酸编码免疫球蛋白轻链的至少一个可变区。
然而另一方面提供了包含SEQ ID NO.4或其互补序列的分离的多核苷酸。一个实施方式提供了与SEQ ID NO.4或其互补序列具有至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，至少90％，至少95％或至少99％序列同一性或同源性的分离的多核苷酸。另一个实施方式提供了包含至少15个核苷酸的分离的多核苷酸，该多核苷酸在严格性条件下或高严格性的条件下与任何一种前述分离的多核苷酸杂交。还是在另一个实施方式中，前述分离的多核苷酸编码免疫球蛋白的至少一个可变区。在一方面，多核苷酸编码免疫球蛋白轻链的至少一个可变区。
另一方面提供了包含SEQ ID NO.5或其互补序列的分离的多核苷酸。一个实施方式提供了与SEQ ID NO.5或其互补序列具有至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，至少90％，至少95％或至少99％序列同一性或同源性的分离的多核苷酸。另一个实施方式提供了包含至少15个核苷酸的分离的多核苷酸，该多核苷酸在严格性条件下或高严格性的条件下与任何一种前述分离的多核苷酸杂交。还是在另一个实施方式中，前述分离的多核苷酸编码免疫球蛋白的至少一个可变区。在一方面，多核苷酸编码免疫球蛋白重链的至少一个可变区。
还是另一方面提供了包含SEQ ID NO.7或其互补序列的分离的多核苷酸。一个实施方式提供了与SEQ ID NO.7或其互补序列具有至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，至少90％，至少95％或至少99％序列同一性或同源性的分离的多核苷酸。另一个实施方式提供了包含至少15个核苷酸的分离的多核苷酸，该多核苷酸在严格性条件下或高严格性的条件下与任何一种前述分离的多核苷酸杂交。还是在另一个实施方式中，前述分离的多核苷酸编码免疫球蛋白的至少一个可变区。在一方面，多核苷酸编码免疫球蛋白重链的至少一个可变区。
然而另一方面提供了包含SEQ ID NO.9或其互补序列的分离的多核苷酸。一个实施方式提供了与SEQ ID NO.9或其互补序列具有至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，至少90％，至少95％或至少99％序列同一性或同源性的分离的多核苷酸。另一个实施方式提供了包含至少15个核苷酸的分离的多核苷酸，该多核苷酸在严格性条件下或高严格性的条件下与任何一种前述分离的多核苷酸杂交。还是在另一个实施方式中，前述分离的多核苷酸编码免疫球蛋白的至少一个可变区。在一方面，多核苷酸编码免疫球蛋白重链的至少一个可变区。
另一方面提供了包含SEQ ID NO.11或其互补序列的分离的多核苷酸。一个实施方式提供了与SEQ ID NO.11或其互补序列具有至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，至少90％，至少95％或至少99％序列同一性或同源性的分离的多核苷酸。另一个实施方式提供了包含至少15个核苷酸的分离的多核苷酸，该多核苷酸在严格性条件下或高严格性的条件下与任何一种前述分离的多核苷酸杂交。还是在另一个实施方式中，前述分离的多核苷酸编码免疫球蛋白的至少一个可变区。在一方面，多核苷酸编码免疫球蛋白重链的至少一个可变区。
另一方面提供了包含SEQ ID NO.13或其互补序列的分离的多核苷酸。一个实施方式提供了与SEQ ID NO.13或其互补序列具有至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，至少90％，至少95％或至少99％序列同一性或同源性的分离的多核苷酸。另一个实施方式提供了包含至少15个核苷酸的分离的多核苷酸，该多核苷酸在严格性条件下或高严格性的条件下与任何一种前述分离的多核苷酸杂交。还是在另一个实施方式中，前述分离的多核苷酸编码免疫球蛋白的至少一个可变区。在一方面，多核苷酸编码免疫球蛋白重链的至少一个可变区。
另一方面提供了包含SEQ ID NO.15或其互补序列的分离的多核苷酸。一个实施方式提供了与SEQ ID NO.15或其互补序列具有至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，至少90％，至少95％或至少99％序列同一性或同源性的分离的多核苷酸。另一个实施方式提供了包含至少15个核苷酸的分离的多核苷酸，该多核苷酸在严格性条件下或高严格性的条件下与任何一种前述分离的多核苷酸杂交。还是在另一个实施方式中，前述分离的多核苷酸编码免疫球蛋白的至少一个可变区。在一方面，多核苷酸编码免疫球蛋白重链的至少一个可变区。
另一方面提供了包含SEQ ID NO.6或其互补序列的分离的多核苷酸。一个实施方式提供了与SEQ ID NO.6或其互补序列具有至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，至少90％，至少95％或至少99％序列同一性或同源性的分离的多核苷酸。另一个实施方式提供了包含至少15个核苷酸的分离的多核苷酸，该多核苷酸在严格性条件下或高严格性的条件下与任何一种前述分离的多核苷酸杂交。还是在另一个实施方式中，前述分离的多核苷酸编码免疫球蛋白的至少一个可变区。在一方面，多核苷酸编码免疫球蛋白轻链的至少一个可变区。
另一方面提供了包含SEQ ID NO.8或其互补序列的分离的多核苷酸。一个实施方式提供了与SEQ ID NO.8或其互补序列具有至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，至少90％，至少95％或至少99％序列同一性或同源性的分离的多核苷酸。另一个实施方式提供了包含至少15个核苷酸的分离的多核苷酸，该多核苷酸在严格性条件下或高严格性的条件下与任何一种前述分离的多核苷酸杂交。还是在另一个实施方式中，前述分离的多核苷酸编码免疫球蛋白的至少一个可变区。在一方面，多核苷酸编码免疫球蛋白轻链的至少一个可变区。
另一方面提供了包含SEQ ID NO.10或其互补序列的分离的多核苷酸。一个实施方式提供了与SEQ ID NO.10或其互补序列具有至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，至少90％，至少95％或至少99％序列同一性或同源性的分离的多核苷酸。另一个实施方式提供了包含至少15个核苷酸的分离的多核苷酸，该多核苷酸在严格性条件下或高严格性的条件下与任何一种前述分离的多核苷酸杂交。还是在另一个实施方式中，前述分离的多核苷酸编码免疫球蛋白的至少一个可变区。在一方面，多核苷酸编码免疫球蛋白轻链的至少一个可变区。
另一方面提供了包含SEQ ID NO.12或其互补序列的分离的多核苷酸。一个实施方式提供了与SEQ ID NO.12或其互补序列具有至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，至少90％，至少95％或至少99％序列同一性或同源性的分离的多核苷酸。另一个实施方式提供了包含至少15个核苷酸的分离的多核苷酸，该多核苷酸在严格性条件下或高严格性的条件下与任何一种前述分离的多核苷酸杂交。还是在另一个实施方式中，前述分离的多核苷酸编码免疫球蛋白的至少一个可变区。在一方面，多核苷酸编码免疫球蛋白轻链的至少一个可变区。
然而，另一方面提供了包含SEQ ID NO.14或其互补序列的分离的多核苷酸。一个实施方式提供了与SEQ ID NO.14或其互补序列具有至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，至少90％，至少95％或至少99％序列同一性或同源性的分离的多核苷酸。另一个实施方式提供了包含至少15个核苷酸的分离的多核苷酸，该多核苷酸在严格性条件下或高严格性的条件下与任何一种前述分离的多核苷酸杂交。还是在另一个实施方式中，前述分离的多核苷酸编码免疫球蛋白的至少一个可变区。在一方面，多核苷酸编码免疫球蛋白轻链的至少一个可变区。
另一方面提供了包含SEQ ID NO.16或其互补序列的分离的多核苷酸。一个实施方式提供了与SEQ ID NO.16或其互补序列具有至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，至少90％，至少95％或至少99％序列同一性或同源性的分离的多核苷酸。另一个实施方式提供了包含至少15个核苷酸的分离的多核苷酸，该多核苷酸在严格性条件下或高严格性的条件下与任何一种前述分离的多核苷酸杂交。还是在另一个实施方式中，前述分离的多核苷酸编码免疫球蛋白的至少一个可变区。在一方面，多核苷酸编码免疫球蛋白轻链的至少一个可变区。
另一方面提供了本发明任何一种分离的多核苷酸编码的分离的多肽。也包括与本发明任何一种多核苷酸编码的多肽具有至少50％，至少60％，70％，80％，90％，95％或99％氨基酸序列同一性和能结合抗原表位的多肽。还是另一个实施方式包括经历了保守性氨基酸置换的多核苷酸。在另一个实施方式中，本发明的多核苷酸密码子被最优化以在植物中表达。在一个实施方式中，最优化密码子以在单子叶植物中表达。在另一个实施方式中，最优化密码子以在玉米中表达。在另一个实施方式中，最优化密码子以在双子叶植物中表达。还是在另一个实施方式中，最优化密码子以在植物质体，例如叶绿体中表达。
另一方面提供了包含任何本发明多核苷酸中至少一个多核苷酸的重组载体。在一个实施方式中，载体是克隆载体，而在另一个实施方式中，载体是表达载体。一方面提供了重组表达盒，其包含作为可操作连接成分的至少一个启动子，本发明任何多核苷酸中至少一个多核苷酸，和至少一个终止序列。在另一个实施方式中，表达盒还包含可操作地连接本发明任何一种多核苷酸的内质网(ER)保留信号。
还是另一方面提供了包含本发明至少一种重组载体或表达盒的宿主细胞，及表达如这里所述免疫球蛋白分子或其片段的宿主细胞。宿主细胞可以是细菌细胞、真菌细胞、酵母细胞、藻类、植物细胞或动物细胞。在一个实施方式中，宿主细胞是植物细胞。在另一个实施方式中，宿主细胞是单子叶植物细胞。在进一步实施方式中，宿主细胞是双子叶植物细胞。还是在另一个实施方式中，宿主细胞是谷类植物细胞。然而在另一个实施方式中，在宿主细胞的质体或细胞器中包含重组载体或表达盒，和/或表达本发明的免疫球蛋白分子。另一个实施方式包括包含本发明宿主细胞的植物。产生这种宿主细胞和植物的方法形成了本发明的另一方面。
另一方面提供了编码含有轻链和重链的免疫球蛋白的重组核苷酸构建体，其中所述重链由SEQ ID NO.1或3编码，轻链由SEQ ID NO.2或4编码。在一个实施方式中，免疫球蛋白抗肠产毒性大肠杆菌(E.coli)细菌的K99抗原。在另一个实施方式中，该构建体进一步包含内质网(ER)保留信号。
另一方面提供了编码含有轻链和重链的免疫球蛋白的重组核苷酸构建体，其中所述重链由选自SEQ ID NOs.5、7、9、11、13和15的核苷酸序列编码，所述轻链由选自SEQ ID NOs.6、8、10、12、14和16的核苷酸序列编码。在一个实施方式中，免疫球蛋白抗肠产毒性大肠杆菌(E.coli)细菌的K88抗原。在另一个实施方式中，该构建体进一步包含内质网(ER)保留信号。
增加完全装配的功能性抗体产物的产量和稳定性(例如，分子的半衰期)是重要的。其中可以获得这种产物至少稳定性的一种方法是通过产生稳定化的CH3或Fc结构域。然后，这种稳定化的结构域可以用做功能设计的平台，特别是当这种功能设计涉及诱变抗体产物时。当为功能目的突变抗体分子时，从超稳定的平台起始提供了更多的妥协空间。
因此，本发明的另一方面提供了包含CH3结构域的免疫球蛋白分子，特别是重链，该CH3结构域含有至少一个选自S174G，Y179D，G197K，G197A，S207G和T246L的突变。在一个实施方式中，免疫球蛋白是分离的免疫球蛋白。在另一个实施方式中，重链是牛重链。也包括编码这种突变的CH3结构域的分离的多核苷酸。突变的CH3结构域可以联合这里公开的任何重链或轻链可变区。
另一方面提供了包含CH2结构域的免疫球蛋白分子，特别是重链，该CH2结构域含有至少一个选自N85H，R109P，T116L和H126N的突变。在一个实施方式中，免疫球蛋白是分离的免疫球蛋白。在一个实施方式中，重链是牛重链。也包括编码这种突变的CH2结构域的分离的多核苷酸。突变的CH2结构域可以联合这里公开的任何重链或轻链可变区。这些突变增加了结构域的总体稳定性，并且提供了用于功能设计的超稳定平台，并且可以被嫁接成全长抗体序列以增加分子产量和半衰期。
另一方面提供了包含这里所公开的突变的CH2和/或CH3结构域的免疫球蛋白分子。在一个实施方式中，免疫球蛋白分子是分离的免疫球蛋白分子。在另一个实施方式中，包含突变的CH3和/或CH2结构域的免疫球蛋白分子联合这里所公开的可变区。
另一方面提供了包含至少一种这里所公开的多核苷酸的转基因植物。在一个实施方式中，该植物表达这里所公开的一种多核苷酸编码的抗体或抗体片段。在另一个实施方式中，表达的抗体或抗体片段是单链抗体，scFv或VHH抗体。在进一步实施方式中，抗体或抗体片段结合ETEC的K88或K99抗原。产生这种植物的方法也认为是本发明的另一方面。
然而，另一方面提供了治疗或预防动物中肠疾病的方法，该方法包括经肠施用含有来源于任何转基因植物的材料或部分纯化材料的有效量化合物，该转基因植物包含这里所公开的任何多核苷酸。在一个实施方式中，材料或部分纯化的材料包含叶片材料、种子材料，果实材料、根材料、茎材料或它们的任何联合。在另一个实施方式中，在经肠施用前，从植物材料纯化抗体或抗体片段。还是在另一个实施方式中，肠施用包括口服施用。在另一个实施方式中，以液态形式施用植物材料、部分纯化的植物材料或从植物材料纯化的抗体。在一个方面，植物材料或部分纯化的植物材料含有至少0.1mg抗体/kg植物材料或部分纯化的植物材料。在另一个实施方式中，每天向动物施用含有至少10mg抗体或抗体片段的这里所公开的植物材料、部分纯化的植物材料或来自植物材料的纯化抗体。
另一方面提供了包含来源于这里所公开的任何转基因植物的植物材料或部分纯化的植物材料或纯化抗体或抗体片段的组合物。组合物可以是药物组合物，并且可以进一步包含药物学可接受稀释剂或赋形剂。在一个实施方式中，组合物是动物饲料或人类食品。在另一个实施方式中，组合物是液体或粉末形式的代乳品或婴儿乳粉(infantformula)。还是在另一个实施方式中，组合物是饲料或食品添加剂。然而在另一个实施方式中，组合物是营养补剂。


参考下面的说明、所附权利要求书和附图将更好地理解本发明的这些和其它特征、方面和优点，其中图1表示用于K99 VH和VL基因的引物。
图2表示用于玉米优化密码子使用和合成的抗K88κ轻链和IgG1重链的构建体Agro-RB-HindIII-γ玉米醇溶蛋白启动子-BanHI-gZSS-SpeI-抗-K99 V1-Xho-恒定轻链区-XmnI-SEKDEL-AgeI-PEPC内含子35S term-MluI-MluI-γ-玉米醇溶蛋白启动子-BamHi-gZSS-SpeI-抗-K99Vh CH1 aa 1-10-AccI-Chaal-铰链-CH2-Ch3-XmaI-SEKDEL-SacI-PEPC内含子35Sterm-KpnI-KpnI-Ubi启动子-BamHI＝PMI植物选择基因-SacI-NOS-LBAgro。
图3表示用抗K99轻链和重链(pTMR103和pTM105)转化的稻愈伤组织中的抗体表达。用还原凝胶通过Western印迹检测抗体表达。NT未转基因组织。条带1-8从8个不同事件提取的蛋白质。
图4表示来源于独立转基因玉米系的玉米叶片样品的Western印迹分析。每个条带加样10μg总的可溶蛋白质。条带1来源于用pTMR554(有ER信号)转化的玉米叶的提取物。条带2，3，4来源于用pTMR555(无ER信号)转化的玉米叶的提取物。条带NT来源于非转基因玉米叶片的提取物。条带MW分子量标记(kD)。条带mab从杂交瘤细胞纯化的40ng抗K88抗体。凝胶A，B，D3-8％(w/v)Tris-醋酸盐NuPAGE非还原条件；凝胶A用兔抗小鼠H+L(1∶500)，接着用碱性磷酸酶山羊抗兔H+L(1∶4000)检测。凝胶B用碱性磷酸酶抗小鼠Fc(1∶2000)检测。凝胶D用大鼠抗小鼠κ(1∶200)，接着用碱性磷酸酶山羊抗大鼠H+L(1∶5000)进行检测。凝胶CBis-Tris 4-12％还原SDS-PAGE；用兔抗小鼠H+L(1∶500)和用碱性磷酸酶抗小鼠Fc(1∶2000)进行检测。
图5a表示植物产生的抗体和K88菌毛之间结合复合物的表面等离子体共振评估。利用BIACORE 3000，通过表面等离子体共振分析从杂交瘤和植物细胞纯化的抗体。sensograms对应于注射从表达pTMR554的玉米叶片纯化的K88抗体(plmAb)，从杂交瘤细胞(杂交瘤36/44)纯化的K88抗体。用灰色表示空白试验。
图5b表示Biacore分析，证明了基于细胞器靶向的重组IgG1分子有差异的翻译后加工。两个图片都表示重组IgG1注射到抗原包被的芯片上。最大的应答(y轴)依赖于结合率和分子总的大小。A.有和无ER保留信号的IgG1的注射。+ER IgG1被浓缩的更多，这是为什么它结合的更快。然而，-ER IgG1必定具有稍微大些分子量(MW)，可能是由于更大量的糖基化作用，这解释了它如何产生更大的应答，尽管它结合的动力学稍微慢些(由于其较低的浓度)。B.9个单个的、-ER、转基因玉米种子提取物的注射。每个样品中IgG1浓度有差异，动力学轨迹从不交叉，因为每个-ER IgG1分子的MWs都是精确地相同的。因此，植物样品中翻译后修饰高度依赖于细胞的区室化，并且靶向相同细胞位置的蛋白质看起来有相同的翻译后修饰。
图6a表示7/46，36/41和17/44结合K88芯片的浓度分布图。6A.所示是0.5、2、5、10、20、50、100和250nM 17/44注射到K88固定的传感器芯片上的sensogram覆盖图(overlays)。6B.0.1、0.2、0.5、1.0、2、5和10nM 36/41注射到K88芯片上的覆盖图。6C.5、10、20、50和100nM 17/44注射到K88芯片上的覆盖图。所有这三种分布图都适合二价分析物模型。在每种分布图下面显示了每种配合的残留。
图6b表示(从杂交瘤细胞培养物纯化的)抗K99单克隆抗体通过K99包被的表面等离子体共振芯片的浓度分布图。该浓度分布图适合二价结合以确定适合的缔合/解离速率常数及总的平衡解离常数，KD。
图7表示对于单剂量治疗组，在第0天，回肠消化物中抗K99抗体的水平。
图8表示对于三倍剂量治疗组，在第0天，回肠消化物中抗K99抗体的水平。
图9表示对于单剂量治疗组，在第1天，回肠消化物中抗K99抗体的水平。
图10表示对于三倍剂量治疗组，在第1天，回肠消化物中抗K99抗体的水平。
图11表示对于单剂量治疗组，在第2天，回肠消化物中抗K99抗体的水平。
图12表示对于三倍剂量治疗组，在第2天，回肠消化物中抗K99抗体的水平。
图13表示回肠消化物中抗K99抗体的3天平均水平。
图14表示对于单剂量治疗组，在第0天，回肠消化物中IgG的水平。
图15表示对于三倍剂量治疗组，在第0天，回肠消化物中IgG的水平。
图16表示对于单剂量治疗组，在第1天，回肠消化物中IgG的水平。
图17表示对于三倍剂量治疗组，在第1天，回肠消化物中IgG的水平。
图18表示对于单剂量治疗组，在第2天，回肠消化物中IgG的水平。
图19表示对于三倍剂量治疗组，在第2天，回肠消化物中IgG的水平。
图20表示回肠消化物中3天平均的IgG水平。
图21表示人类CH3 X射线晶体结构的带状图(DeLano等，Science，2871279-1283，2000)。用棒条形式表示基于残基频率分析鉴定为优化位点的残基位置。利用MolMol形成该图(Koradi等，J.Mol.Graphs，1451-55，1996)。
图22表示IgGFc区的序列对齐。A.用于残基位置频率分析和熵计算的36个序列数据集的片段。B.最佳、牛科、人类和鼠科CH3序列的对齐。用红色显示牛科CH3结构域中的残基位置，其中对这些残基位置进行了可能稳定化的突变。在对齐下面，.＝保守性变异；＝严格变异；*＝无变异。
图23表示bCH3的分离/纯化。A.利用设定到280nm的吸光度检测器进行的天然bCH3的反相HPLC纯化。在22.9分钟洗脱的峰是氧化的CH3，而在25.4分钟洗脱的峰是还原的CH3。B.纯化的CH3构建体的10％聚丙烯酰胺凝胶(Invitrogen)分析。
图24表示bCH3，mCH3和hCH3的结构和稳定性分析。A.在5℃，pH7.5时bCH3，mCH3和hCH3的CD光谱。B.通过远UV CD信号，在217nm监测的bCH3，mCH3和hCH3温度变性。曲线拟合成2种状态的伸展模型以获得精确的Tm值。
图25是bCH3和该结构域6个突变构建体的结构和稳定性分析。A.在5℃，pH7.5时天然和突变的bCH3构建体的CD光谱。B.在325和375K之间的每个bCH3构建体的未折叠部分的图。
图26表示来源于8种独立转基因愈伤组织系的愈伤组织样品的Western印迹分析。每个条带加样40μg总的可溶蛋白质。条带1-2来源于用pTMR147转化的水稻愈伤组织的提取物；条带3-4来源于用pTMR149转化的水稻愈伤组织的提取物；条带5-6来源于用pTMR156转化的水稻愈伤组织的提取物；条带7-8来源于用pTMR160转化的水稻愈伤组织的提取物；条带NT来源于非转基因水稻愈伤组织的提取物；条带MW分子量标记(kD)；条带C1和C2从杂交瘤细胞纯化的10ng和5ng抗K99抗体。凝胶ABis-Tris 4-12％还原SDS-PAGE；用兔抗小鼠H+L(1∶500)和碱性磷酸酶山羊抗兔H+L(1∶4000)检测。凝胶B3-8％(w/v)Tris-醋酸盐NuPAGE非还原条件；用兔抗小鼠H+L(1∶500)，接着用碱性磷酸酶山羊抗大鼠H+L(1∶4000)进行检测。凝胶C3-8％(w/v)Tris-醋酸盐NuPAGE非还原条件；用碱性磷酸酶抗小鼠Fc(1∶2000)进行检测。凝胶D3-8％(w/v)Tris-醋酸盐NuPAGE非还原条件；用大鼠抗小鼠κ(1∶200)，接着用碱性磷酸酶山羊抗大鼠H+L(1∶5000)检测。
图27表示来源于6种独立品系的玉米种子样品的Western印迹分析。每个条带加样10μg总可溶蛋白质。条带1-4来源于用pTMR555转化的玉米种子的提取物(单克隆抗体36/41)；条带5-6来源于用pTMR554转化的玉米种子的提取物(具有ER保留信号的单克隆抗体36/41)；条带NT来源于非转基因玉米种子的提取物；条带MW分子量标记(kD)；条带C1从杂交瘤细胞纯化的40ng抗K88 36/41抗体。所有凝胶都是非还原条件下的3-8％(w/v)Tris-醋酸盐NuPAGE电泳。凝胶A用碱性磷酸酶抗小鼠Fc(1∶2000)进行检测。凝胶B用兔抗小鼠H+L(1∶500)，接着用碱性磷酸酶山羊抗大鼠H+L(1∶4000)进行检测。凝胶C用大鼠抗小鼠κ(1∶200)，接着用碱性磷酸酶山羊抗大鼠H+L(1∶5000)检测。
具体实施例方式
提供下面的详细描述以帮助本领域技术人员实施本发明。虽然如此，该详细描述不应该被解释为不适当地限制本发明，因为本领域普通技术人员可以对这里所述实施方式进行修改和变动，而不偏离本发明的精神或范围。
这里，将该申请所引用的所有出版物、专利、专利申请、公共数据库、公共数据库条目和其它参考文献整个并入为参考文献，就好像具体和单独地标明并入每个单独的出版物、专利、专利申请、公共数据库、公共数据库条目或其它参考文献为参考文献一样。
这里可互换地使用所用的“多核苷酸”，“寡核苷酸”和“核酸”，并且指任何长度核苷酸(核糖核苷酸或者脱氧核糖核苷酸的聚合形式(含有2或多个单体)。尽管通常核苷酸通过磷酸二酯键连接，但是该术语也包含肽核酸诸如含有由氨乙基甘氨酸单元组成的中性酰胺骨架连接的聚合核苷酸(Nielsen等，Science，2541497，1991Neilsen和Egholm，肽核苷酸方法和应用，Horizon ScientificPress，Wymondham，Norfolk UK，1999)。该术语仅指分子的一级结构。因此，该术语包括双和单链DNA和RNA以及可以是单链、但是更通常是双链的DNA/RNA杂合体。此外，该术语也指包含RNA或DNA或者RNA和DNA两者的三链区。该三链区的链可以来源于相同分子或来源于不同分子。该区可以包含所有或一种或多种分子，但是更通常地仅包含一些分子的区域。该术语也包含已知类型的修饰，例如，标记，甲基化，“帽子”，用类似物置换一个或多个天然存在的核苷酸，核苷酸之间的修饰诸如，例如具有不带电荷键(例如，甲基膦酸酯、磷酸三酯、磷酰胺、氨基甲酸酯等)的那些，含有附加部分诸如，例如蛋白质(包括，例如核酸酶、毒素、抗体、信号肽、聚L-赖氨酸等)的那些，带有嵌入剂(例如，吖啶、补骨脂素等)的那些，含有烷化剂的那些，具有修饰键(例如，α-异头核苷酸等)的那些及未修饰形式的多核苷酸。多核苷酸包含有义和反义，或者编码和模板链。该术语包括天然存在和化学合成的分子。除非特别限定，该术语包括含有天然核苷酸已知类似物的核酸，该核酸与参照核酸具有相似的结合特征，并且以与天然存在的核苷酸相似的方式被新陈代谢。除非特别说明，特定的核酸序列也隐含地包括其保守性修饰的变异体(例如，简并密码子置换)和互补序列及明确表明的序列。具体地，通过产生其中用混合碱基和/或脱氧肌苷残基置换一个和多个选定(或所有)密码子的第三位置的序列，可以获得简并密码子置换(Batzer等，Nucl.Acids Res.，19508(1991)；Ohtsuka等，J.Biol Chem.，2602605(1985)；Rossolini等，Mol.Cell.Probes，891(1994))。
这里所用的术语动物包括人类。
用“片段”或“部分”意指编码多肽或蛋白质或其氨基酸序列的全长或小于全长的核酸序列。做为可替代的方案，可用做杂交探针的核苷酸序列的片段或部分通常不编码保留生物活性的片段蛋白质。因此，核苷酸序列的片段或部分的范围可以是至少约6个核苷酸，约9个，约12个核苷酸，约15个核苷酸，约20个核苷酸，约30个核苷酸，约50个核苷酸，约75个核苷酸，约100个核苷酸或更多。当“部分”或“片段”涉及本发明的核酸分子、序列或片段时，当它连接其它序列用于表达时，其意指具有至少80个核苷酸，至少150个核苷酸，或者至少400个核苷酸的序列。当“部分”或“片段”不用于表达时，其意指至少约6个，至少约9个，至少约12个，至少约15个或者至少约20个连续的核苷酸，例如探针和引物(寡核苷酸)，对应于本发明核酸分子的核苷酸序列。
术语“抗体”用在这里包括具有全长重链和轻链的完整的抗体分子；其片段，诸如Fab，修饰的Fab，二Fab，Fab’，F(ab’)2或Fv片段；和包含轻链或重链单体和二聚体的单链抗体，及其中重链和轻链的可变区通过肽键接头连接的单链Fv(scFv)。
所用与抗体或免疫球蛋白分子有关的术语“片段”包括Fab，修饰的Fab，二Fab，Fab’，F(ab’)2或Fv片段。
“转基因”指通过转化引入到基因组中，并且可以稳定维持的基因。转基因可以包括，例如与待转化的特定植物DNA异源或同源的DNA。此外，转基因可以包含插入到非天然生物体中的天然基因或嵌合基因。术语“内源基因”指在生物体基因组中其天然位置的天然基因。“外源”基因指在宿主生物体中正常地不存在的，而通过基因转移引入的基因。
这里可互换地使用术语“蛋白质”，“肽”和“多肽”，并且意指通过肽键连接的2个或多个氨基酸。
“DNA改组”是在DNA分子中，通常是随机地，引入突变或重排的方法，或者通常也是随机地，在2个或多个DNA分子之间产生DNA序列交换的方法。由DNA改组产生的DNA分子是经改组的DNA分子，其是来源于至少一种模板DNA分子的非天然存在的DNA分子。优选地，经改组的DNA编码相对于模板DNA编码的多肽修饰的变异多肽，并且相对于模板DNA编码的多肽，可以具有改变的生物学活性。
特定核酸序列的“保守修饰的变异”指编码相同或基本相同氨基酸序列的核酸序列，或者当核酸序列不编码氨基酸序列时，指基本相同的序列，。因为遗传密码的简并性，大量功能相同的核酸编码任何特定的多肽。例如，密码子CGT，CGC，CGA，CGG，AGA和AGG都编码氨基酸精氨酸。因此，在密码子限定精氨酸的每个位置，该密码子可以改变为所述任何相应的密码子，而不改变所编码的蛋白质。这种核酸变异是“沉默变异”，其是“保守修饰的变异”的一个种类。除了另外指明，这里所述编码多肽的每个核酸序列也描述了每种可能的沉默变异。本领域技术人员认识到可以通过标准技术修饰核酸中每个密码子(除了ATG，其通常是仅有的甲硫氨酸密码子)以产生功能相同的分子。因此，在每个所述序列中隐含了编码多肽核酸的每种“沉默变异”。
术语“异源DNA序列”，“外源DNA片段”，“异源核酸”每个都指来源于特定宿主细胞外源来源的序列，或者如果来源于相同来源，对其原始形式进行了修饰。因此，宿主细胞中的异源基因包括相对于特定宿主细胞是内源的，但是通过例如应用DNA改组修饰了的基因。该术语也包括天然出现的DNA序列的非天然出现的多拷贝。因此，该术语指相对于细胞是外源或异源的DNA片段，或者相对于细胞是同源的，但是位于该元件通常不被发现的宿主细胞核酸中位置的DNA片段。表达外源DNA片段以产生外源多肽。
“编码序列”指编码特定氨基酸序列和不包含编码序列5’和3’非编码序列的DNA或RNA序列。它可以包含诸如在cDNA中的“不间断的编码序列”，即，缺少内含子，或者它可以包含例如在基因组DNA中可以发现的有适合剪接连接边界的一个或多个内含子。“内含子”是包含在初级转录物中，但是在细胞中通过切割和RNA再连接被移除，以产生可以翻译成蛋白质的成熟mRNA的RNA序列。
术语“开放读框”和“ORF”指在编码序列的翻译起始和终止密码子之间编码的氨基酸序列。术语“起始密码子”和“终止密码子”指编码序列中3个邻接核苷酸(“密码子”)单元，其分别规定蛋白质合成(mRNA翻译)的起始和链终止。
“调节序列”和“适合的调节序列”分别指位于编码序列上游(5’非编码区)、中间、或下游(3’非编码序列)的核苷酸序列，并且其影响连接的编码序列的转录，RNA加工或稳定性，或者翻译。调节序列包括增强子、启动子、翻译前导序列、内含子和聚腺苷酸化信号序列。它们包括天然和合成序列及可以是合成和天然序列联合的序列。如上所述术语“适合的调节序列”不限于启动子。然而，本发明中有用的一些适合的调节序列将包括但不限于组成型启动子、组织特异性启动子、发育特异性启动子、诱导型启动子和病毒启动子。
“启动子”指核苷酸序列，通常在其编码序列上游(5’)，其通过提供RNA聚合酶和正确转录所需其它因子的识别，控制编码序列的表达。“启动子”包括最小启动子，其是包含用于规定转录起始位点的TATA盒子和其它序列的短DNA序列，其中调节元件添加于该转录起始位点以控制表达。“启动子”也指包含最小启动子加调节元件的核苷酸序列，其能控制编码序列或功能RNA的表达。这种类型的启动子序列包含近端和更远端的上游元件，后者元件常常称为增强子。因此，“增强子”是可以刺激启动子活性的DNA序列，并且可以是启动子天然元件或插入以增强启动子水平或组织特异性的异源元件。它能够在两个方向(正常的或翻转的)起作用，甚至当其移动到启动子上游或下游时还是能起作用。增强子和其它上游启动子元件结合介导它们作用的序列特异性DNA结合蛋白质。启动子可以整体来源于天然基因，或者可以包含来源于天然发现的不同启动子的不同元件，甚至可以包含合成DNA片段。启动子也可以含有参与蛋白质因子结合的DNA序列，该蛋白质因子控制转录起始的有效性以应答生理或发育条件。
“组成型表达”指整个植物上发生的表达，其不限于植物中特定的组织或位置。这种组成型表达可以使用组成型(即，永久打开的)或调节型启动子。“条件型”和“调节型表达”指受调节型启动子控制的表达，因此包括诱导型表达。
“可操作地连接”指单核酸片段上核酸序列的连接，以致一个核酸序列影响另一个核酸序列的功能。例如，如果2条序列的位置使得调节DNA序列影响编码DNA序列的表达(即，编码序列或功能RNA受启动子转录控制)，那么调节DNA序列就称为“可操作地连接”或“连联合”编码RNA或多肽的DNA序列。编码序列可以在有义或反义方向上可操作地连接调节序列。
“表达”指多核苷酸，例如，植物中内源基因或转基因的转录或转录和翻译。在反义构建体的情况下，表达可以仅指反义DNA的转录。此外，表达指有义(mRNA)或功能RNA的转录和稳定积累。表达也指蛋白质的产生。
“部分纯的”或“部分纯化的”意指物质至少在一定程度上无其它杂质蛋白质、核酸和来源于原始来源生物体的其它生物物质(例如，以比该物质存在于来源生物体中时更少的量存在的杂质蛋白质、核酸和/或其它生物物质)。可以用标准方法测定纯度，并且通常是至少是约10％纯的，至少约25％纯的，至少约30％纯的，至少约40％纯的，至少约50％纯的，至少约60％纯的，或者至少约70％纯的。“基本纯的”或“基本纯化的”意指至少约75％纯的，至少约80％纯的，至少约85％纯的，至少约90％纯的，至少约95％纯的，至少约98％纯的，或至少约99％纯的。分析可以是通过凝胶染色、分光光度计或末端标记等评估的重量或摩尔百分比。
这里所用的“分离的多核苷酸”意指没有位于多核苷酸所来源的生物体天然存在的基因组中多核苷酸侧翼的一个或两个核苷酸序列的多核苷酸。该术语包含例如掺入到载体或表达盒中；自主复制的质粒或病毒中；原核生物或真核生物基因组DNA中；或做为独立于其它多核苷酸的单独分子存在的多核苷酸或其片段。它也包含是杂合体多核苷酸一部分的重组多核苷酸，例如编码多肽序列的重组多核苷酸。
当术语“治疗有效的”和“有效的”与术语“量”联合使用时，用于限定相对于未治疗而言，将实现疾病严重性和/或发病率频率改进之目的的每种药剂的量。
这里所用的短语“植物材料”可以指整个植物或植物的一部分诸如叶、茎、根、种子和其它植物组织，包括细胞器诸如，例如质体、叶绿体等。
这里提供了分离的多核苷酸哺乳动物抗体，该抗体抗肠产毒性大肠杆菌(E.coli)(ETEC)，特别是具有K88或K99抗原的ETEC株系。在一个实施方式中，分离的多核苷酸包含编码抗K99抗体重链(SEQ IDNO.3)，抗K88抗体重链(SEQ ID NOs11，13和15)的可变区的序列或其互补序列。该序列可以进一步包含编码重链恒定区的区域以形成完整的重链抗体片段，或可以仅含有可变区，诸如单链抗体中常常观察到的。也提供了编码抗K99(SEQ ID NO.4)，K88(SEQ ID NOs.12，14和16)的轻链可变区的分离的多核苷酸或其互补序列。该序列可以掺入到编码完整抗体轻链的更大序列中，即，除了可变区外，还含有轻链恒定区。做为可替代的方案，轻链可变区可以掺入到缺少恒定区的抗体，诸如单链(SC)抗体和单链Fv(ScFv)抗体片段中。
这里所公开的分离的多核苷酸可以具有改变的序列以在特定的宿主细胞或生物体中优化它们的表达(Wada等，Nucl Acids Res.，182367，1990)。对于植物参见，例如WO91/16432；Perlak等，Proc.Natl.Acad.Sci USA，883324，1991；和Murray等，Nucl AcidsRes.17477，1989。在这个方法中，可以利用植物偏爱的密码子合成基因或基因片段。参见，例如Campbell和Gowri，Plant Physiol.，921，1990，关于宿主偏爱密码子的使用。因此，可以优化核苷酸序列以在任何植物中表达。例如，SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2分别地代表已经被优化以在植物中表达的编码K99抗体重链和轻链可变区的多核苷酸。同样，SEQ ID NOs 5，7和9代表抗K88重链可变区，SEQ ID NOs6，8和10代表抗K88轻链可变区，它们已经被优化密码子以在植物中表达。认识到可以优化或合成所有或任何部分的基因序列。即，也可以使用合成的或部分优化的序列。变异核苷酸序列和蛋白质也包含来源于诱变和重组方法诸如DNA改组的序列和蛋白质。用这种方法，可以操作一个或多个不同的编码序列以产生具有期望特征的新的多肽。在这种方法中，从包含具有实质性序列同一性和可以体外或体内同源重组的序列区的相关序列多核苷酸群体产生重组多核苷酸文库。用于这种DNA改组的策略是本领域已知的。参见，例如Stammer，Nature，370389，1994；Crameri 等，Nature Biotech.，15436，1997；Moore等，J.Molec.Biol.，272336，1997；Zhang等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，944504，1997；Crameri等，Nature，391288，1998；和美国专利号5,605,793和5,837,458。
在一个实施方式中，设计抗体序列以避免折叠抗体表面上的游离巯基。在另一个实施方式中，抗体在互补决定区(CDRs)中缺少游离巯基。用游离巯基意指不参与抗体链中，例如轻链内部键，或者链间，例如轻链到重链或重链到轻链间二硫键的二硫键形成的巯基。因为它们位于抗体表面，游离巯基能与除了抗体轻链和重链以外的分子相互作用和形成二硫键。游离巯基的例子是在SEQ ID NO.18位置53的半胱氨酸残基中发现的游离巯基。
也包括在严格或非常严格的条件下与SEQ ID NOs.1-16任何一个或它们的互补序列杂交的多核苷酸。在核酸杂交试验诸如Southern和Northern杂交的范围中，“严格杂交条件”，“严格杂交洗涤条件”和“严格洗涤条件”是序列依赖性的，并且在不同的环境参数下是不同的。例如，较长的序列在较高的温度下特异性杂交。Tm是(在确定的离子强度和pH下)50％靶序列与完全匹配的探针杂交时的温度。特异性通常是杂交后洗涤的函数，主要因素是最终洗涤溶液的离子强度和温度。对于DNA-DNA杂合体，Tm可以大约从Meinkoth和Wahl的等式，Anal.Biochem.，138267，1984Tm＝81.5℃+16.6(log M)+0.41(％GC)-0.61(％-form)-500/L得出，其中M是一价阳离子的摩尔浓度，％GC是DNA中鸟苷和胞嘧啶核苷酸的百分数，％form是杂交溶液中甲酰胺的百分数，L是以碱基对表示的中杂合体的长度。在Sambrook等.(Molecular Cloning，第二版.，Cold Spring Harbor Press，1989)中可以发现计算Tm的可替代的等式，它是Tm＝81.5℃-16.6(log10[Na+])+0.41(％G+C)-0.63(％甲酰胺)-600/L其中，L是以碱基对表示的杂合体的长度，Na+的浓度范围是0.01M到0.4M，G+C的含量范围是30％到75％。在相同的参考文献中可以发现用于涉及RNA的杂合体的等式。
对于每1％的错配，减少Tm约1℃；因此，可以调整Tm，杂交，和/或洗涤条件以与期望同一性的序列杂交。例如，如果寻求同一性大于90％的序列，Tm可以减少10℃。一般地，选定比在确定的离子强度和pH下，特定序列和其互补序列的热熔解点(Tm)低约5℃的严格条件。然而，高严格性的条件可以利用比热熔解点(Tm)低1，2，3或4℃的杂交和/或洗涤；中等严格性条件可以利用比热熔解点(Tm)低6，7，8，9或10℃的杂交和/或洗涤；低严格性的条件可以利用比热熔解点(Tm)低11，12，13，14，15或20℃的杂交和/或洗涤。利用上述等式，杂交和洗涤组合物和期望的Tm，本领域的普通技术人员将理解杂交和/或洗涤溶液严格性的变化是固有被描述的。如果期望的错配度产生了小于45℃(水溶液)或32℃(甲酰胺溶液)的Tm，通常增加SSC浓度，这样可以利用更高的温度。在Tijssen，Laboratory Techniquesin Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization withNucleic Acid Probes，第一部分，第二章“核酸探针测定法的杂交和策略原理概述”Elsevier，New York，1993中可找到核酸杂交的大量指导。一般地，选定比在确定的离子强度和pH下，特定序列的热熔解点(Tm)低约5℃的严格杂交和洗涤条件。
非常严格的条件选定为等于特定探针Tm。在滤膜上，在Southern或Northern印迹中，具有100个以上互补残基的互补核酸杂交的严格条件的例子是在37℃，50％甲酰胺，例如在50％甲酰胺，1M NaCl，1％SDS中杂交，和在60到65℃，在0.1×SSC中洗涤。示例性低严格性的条件包括在37℃，用30到35％甲酰胺，1M NaCl，1％SDS(十二烷基硫酸钠)缓冲溶液杂交，和在50到55℃，在1×到2×SSC(20×SSC＝3.0M NaCl/0.3M柠檬酸三钠)中洗涤。示例性中等严格性条件包括在37℃，在40到45％甲酰胺，1.0NaCl，1％SDS中杂交，和在55到60℃，在0.5×到1×SSC中洗涤。
本发明也包括与SEQ ID NOs.1-16任何一个或它们的互补序列具有至少约50％，至少约60％，至少约70％，至少约80％，至少约90％，至少约95％，至少约99％同一性的多核苷酸。下面的术语用于描述两个或多个核酸或多核苷酸之间的序列关系(a)“参考序列”，(b)“比较视窗”，(c)序列同一性，(d)“序列同一性百分数”和(e)“实质的同一性”。
(a)这里所用的“参考序列”是用做序列比较基础的确定的序列。参考序列可以是特定序列的子集或整体；例如，做为全长cDNA或基因序列的片段，或完整的cDNA或基因序列。
(b)这里所用的“比较视窗”指多核苷酸序列的邻接和特定的区段，其中为了两个序列最佳对齐，与参考序列(其不包含添加或缺失)相比，比较视窗中的多核苷酸序列可以包含添加或缺失(即，空位)。
一般地，比较视窗是至少20个邻接核苷酸长度，并且可选地可以是30，40，50，100个或更长的长度。本领域技术人员理解为了避免由于多核苷酸序列中含有空位引起的与参考序列的高度相似性，通常引入空位罚值，并且从匹配数中减去该空位罚值。在一个实施方式中，比较视窗具有和参考序列相同的长度。
(c)在两个核酸或多肽序列情况下，这里所用的“序列同一性”或“同一性”指当对齐两个序列以在特定的比较视窗内获得最大对应时，两个序列中相同残基的特定百分数，通过序列比较算法或通过肉眼观察测定该百分数。当使用有关蛋白质的序列同一性百分数时，已知不相同的残基位置常常由于保守性氨基酸置换而不同，其中氨基酸残基被置换成具有相似化学特征(例如，电荷或疏水性)的其它氨基酸残基，因此不改变分子的功能特征。当序列因保守性置换而不同时，可以向上调整百分比序列同一性以修正置换的保守性性质。由于这种保守性置换而不同的序列称为具有“序列相似性”或“相似性”。进行这种调整的方法是本领域技术人员所熟知的。通常这种方法包括记分保守性置换做为部分而不是全部错配，因此增加百分数序列同一性。因此，例如，当给相同氨基酸记分为1，给非保守性置换记分是0时，给保守性置换的记分是0和1之间。例如，可如程序PC/GENE(Intelligenetics，Mountain View，California)中所实现的，计算保守性置换的记分。
(d)这里所用的“序列同一性百分数”意指通过在比较视窗上，比较两个最佳对齐的序列确定的数值，其中为了两个序列最佳对齐，与参考序列(其不包含添加或缺失)比较，比较视窗中的多核苷酸序列部分可以包含添加或缺失(即，空位)。如下计算百分数通过确定两个序列中出现的相同核酸碱基或氨基酸残基的位置的数量得出匹配位置的数量，匹配位置的数量除以比较视窗中总位置数量，结果乘以100以产生序列同一性百分数。
(e)(i)术语多核苷酸序列的“实质的同一性”意指利用所述一种对齐程序，利用标准参数，多核苷酸包含与参考序列相比具有至少50％，60％，70％，71％，72％，73％，74％，75％，76％，77％，78％或79％，优选地至少80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％或89％，更优选地至少90％，91％，92％，93％或94％，最优选地至少95％，96％，97％，98％或99％序列同一性的序列。本领域技术人员认识到通过考虑密码子简并性，氨基酸相似性，读框位置等，可以适合地调整这些值以确定两个核苷酸序列编码的蛋白质的相应同一性。
(e)(ii)在多肽情况下，术语“实质的同一性”指在特定的比较视窗上，肽包含与参考序列具有至少50％，60％，70％，71％，72％，73％，74％，75％，76％，77％，78％或79％，优选地80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％或89％，更优选地至少90％，91％，92％，93％或94％，或者甚至更优选地95％，96％，97％，98％或99％序列同一性的序列。优选地，利用Needleman和Wunsch，1970(上文)的同源性对齐算法进行最佳对齐。两个肽序列实质相同的一个指标是一个肽与抗第二个肽的抗体有免疫学反应性。因此，例如，当两个肽仅由于保守性置换而不同时一个肽实质上与第二个肽相同。
对于序列比较，通常一个序列做为被测序列所比较的参考序列。当使用序列比较算法时，将被测和参考序列输入到计算机中，如果必要，指定子序列的座标，并且指定序列算法程序参数。然后，序列比较算法基于指定的程序参数，计算相对于参考序列被测序列的百分比序列同一性。
用于比较的序列对齐的方法是本领域所熟知的。因此，利用数学算法可以完成任何两个序列之间的百分比同一性确定。这种数学算法的优选非限制性例子是Myers和Miller，CABIOS，411，1988的算法；Smith等，Adv.Appl.Math.，2482，1981的局部同源性算法；Needleman和Wunsch，J.Molec.Biol.，48443，1970的同源性对齐算法；Pearson和Lipman，Proc.Natl.Acad.Sci. USA，852444，1988的查询相似性方法；Karlin和Altschul，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，872264，1990，经Karlin和Altschul，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，905873，1993修改的算法。
可以利用这些算法的计算机实现用于序列比较以确定序列同一性。这种实现包括但不限于PC/Gene程序中的CLUSTAL(可从Intelligenetics，Mountain View，CA获得)；8版本的WisconsinGenetics软件包中的ALIGN程序(2.0版本)和GAP，BESTFIT，BLAST，FASTA和TFASTA(可从Genetics Computer Group(GCG)，575 ScienceDrive，Madison，WI获得)。可以利用缺省参数用这些程序进行对齐。Higgins等，Gene，73237，1988；Higgins等，CABIOS，5151，1989；Corpet等，Nucl.Acids Res.，1610881，1988；Huang等，CABIOS，8155，1992；和Pearson等，Meth. Mol.Biol.，24307，1994详尽地描述CLUSTAL程序。ALIGN程序基于上文Myers和Miller的算法。Altschul等.J.Molec.Biol.，215403，1990；Nucl.Acids Res.，253389，1990的BLAST程序基于上文Karlin和Altschul的算法。
通过国家生物技术信息中心(http//www.ncbi.nhn.nih.gov/)公众可获得执行BLAST分析的软件。该算法包括首先通过鉴定查询序列中短字符长度W，鉴定高记分序列对(HSPs)，当该高记分序列对(HSPs)与数据库序列中具有相同长度字符对齐时，其匹配或满足一些正值阈记分T。T称为邻域字符记分阈值(Altschul等，1990，上文)。这些最初邻域字符命中做为种子以起始检索发现含有它们的更长HSPs。然后，只要累积的对齐记分可以增加，就在两个方向沿着每个序列一直延伸字符命中。利用参数M(一对匹配残基的奖励记分；总是＞0)和N(错配残基的罚值记分；总是＜0)，计算核苷酸序列的累积记分。对于氨基酸序列，使用记分矩阵计算累积记分。由于一个或多个负记分残基对齐的累积累积记分回到0或0以下，累积对齐记分从其最大获得值下降数量X或两个序列中任一个序列到达了末端时，每个方向上的字符命中延伸停止。
除了计算百分比序列同一性，BLAST算法也执行两个序列之间相似性的统计学分析(参见，例如Karlin & Altschul，1993，上文)。BLAST算法提供的一个相似性测定是最小和概率(P(N))，其提供了两个核苷酸或氨基酸序列之间偶然出现匹配的概率指标。例如，如果被测核酸序列与参考核酸序列比较中，最小和概率小于例如约0.1，小于约0.01或小于约0.001，那么认为检测核酸序列与参考序列相似。
为了获得用于比较目的的空位对齐，如Altschul等，Nuc.AcidsRes.，253389，1997中所述，可以利用空位BLAST(BLAST 2.0版本中)。做为可替代的方案，PSI-BLAST(BLAST 2.0版本中)可以用于执行检测分子间远源关系的重复检索。参见Altschul等，上文。当使用BLAST，空位BLAST或PSI-BLAST时，可以使用每个程序的缺省参数(例如，核苷酸序列是BLASTN，蛋白质是BLASTX)。(对于核苷酸序列)BLASTN程序使用字长(W)11，期望值(E)10，截断值100，M＝5，N＝-4和两条链比较做为缺省值。对于氨基酸序列，BLASTP程序使用字长(W)3，期望值(E)10和BLOSUM62记分矩阵做为缺省值(参见，Henikoff & amp；Henikoff，Proc.Natl.Acad.Sci，89；10915，1989)。参见http//www.ncbi.nim.nih.gov。也可以通过观察人工进行对齐。
优选地，利用BlastN程序(版本1.4.7或以后版本)和它的缺省参数或任何等同的程序进行核苷酸序列比较以确定与这里所公开序列的百分比序列同一性。“等同的程序”指任何序列比较程序，对于任何两个所述序列，与优选的程序产生的相应对齐相比，其产生具有相同核苷酸或氨基酸残基匹配和相同百分比序列同一性的对齐。
也包括SEQ ID NO 1-16或它们互补序列任何一个的片段，该片段是至少15，至少20，至少30，至少50或至少100个核苷酸长度。在一个实施方式中，这些片段包含编码互补决定区(CDR)的序列，该互补决定区参与K88或K99抗原结合。互补决定区，也已知是高变区，是抗体可变区中短的区段，显示了异常可变性以产生抗原结合位点。如果将Kabat编号系统应用于轻和重链，就很容易鉴定轻链或重链中CDRs位置(Kabat等，1987，有免疫学意义的蛋白质序列，USDepartment of Health and Human Services，NIH，USA)。
本发明的发现也包括SEQ ID NO.1-16任何一个编码的多肽，特别是SEQ ID NO.17，18和67-72。如本领域所熟知和这里所讨论的，遗传密码是简并的，这样，一条以上的核苷酸序列可以编码相同的多肽。因此，本发明的范围内包括编码SEQ ID NOs.17，18和67-72任何一个的所有多核苷酸。也包括SEQ ID NOs.17，18和67-72的片段，该片段包含与ETEC的K88或K99抗原相互作用并与其结合的至少一个互补决定区或其片段，以及包括编码这种CDR s或片段的核苷酸序列。
本领域的普通技术人员意识到肽、多肽或蛋白质的氨基酸序列修饰可以导致等同的，或可能改进的第二代肽等，它们与原始氨基酸序列比较显示等同或优良的功能特征。因此，本发明包括这种修饰的氨基酸序列。只要通过这种修饰产生的肽序列与这里公开的天然出现的对应序列具有基本相同的功能特性(例如，结合特异性，至少相同或更大的结合亲和性，至少相同或更大的半衰期)，改变就可以包括氨基酸插入、缺失、置换、截短、融合、亚单位序列的改组等等。
进行这种改变可以考虑的一个因素是氨基酸的亲水性指数(hydropathic index)。Kyte和Doolittle(J Mol.Biol.，157105-132，1982)已经讨论了在赋予蛋白质以相互作用生物学功能方面亲水性氨基酸指数的重要性。已知氨基酸的相对亲水性特征有贡献于所获得的蛋白质的次级结构。接着，这影响蛋白质和分子诸如酶、底物、受体、DNA、抗体、抗原等的相互作用。
基于氨基酸的疏水性和电荷特征，每种氨基酸都分配有如下的亲水性指数异亮氨酸(+4.5)；缬氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)；甲硫氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；苏氨酸(-0.7)；丝氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；组氨酸(-3.2)；谷氨酸/谷氨酰胺/天冬氨酸/天冬酰胺(-3.5)；赖氨酸(-3.9)；和精氨酸(-4.5)。
如本领域所已知的，肽或蛋白质中的一些氨基酸可以被置换成具有相似亲水性指数和分值的其它氨基酸，并且产生具有相似生物学活性的所获得的肽或蛋白质，即，其仍旧保留了生物学功能。在进行这种改变时，优选具有±2以内的亲水性指数的氨基酸进行相互置换。
更优选的置换是其中氨基酸具有±1以内的亲水性指数的置换。最优选的置换是其中氨基酸具有±0.5以内的亲水性指数的置换。
基于亲水性(hydrophilicity)也可以置换相似氨基酸。美国专利号4,554,101公开了由蛋白质邻近氨基酸亲水性所控制的蛋白质最大的局部平均亲水性与蛋白质生物学特性相关。下面的亲水性值分配给氨基酸精氨酸/赖氨酸(+3.0)；天冬氨酸/谷氨酸(+3.0±1)；丝氨酸(+0.3)；天冬酰胺/谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；苏氨酸(-0.4)；脯氨酸(-0.5±1)；丙氨酸/组氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；甲硫氨酸(-1.3)；缬氨酸(-1.5)；亮氨酸/异亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)；和色氨酸(-3.4)。因此，肽、多肽或蛋白质中的一个氨基酸可以被具有相似亲水性分值的氨基酸置换，并且仍旧产生具有相似生物学活性的所得到的蛋白质，即其仍旧保留了正确的生物学活性。在进行这种改变时，优选具有±2以内，更优选地具有±1以内，最优选具有±0.5以内亲水性指数的氨基酸进行相互置换。
如上所概述，本发明肽中氨基酸的置换可以基于氨基酸侧链取代基的相对相似性，例如它们的疏水性、亲水性、电荷、大小等。考虑前述各种特性以产生在本发明肽中引起沉默改变的保守性氨基酸改变等的示例性置换可以选自天然存在的氨基酸所属类别的其它成员。氨基酸可以分为下面4组(1)酸性氨基酸；(2)碱性氨基酸；(3)中性极性氨基酸；(4)中性非极性氨基酸。这些各个组中代表性氨基酸包括但不限于(1)酸性(带负电荷)氨基酸诸如天冬氨酸和谷氨酸；(2)碱性(带正电荷)氨基酸诸如精氨酸、组氨酸和赖氨酸；(3)中性极性氨基酸诸如甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺；和(4)中性非极性氨基酸诸如丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸。应该注意到如果预期不是有利的改变引起功能性序列的产生，它也是有用的。
也包括含有SEQ ID NOs.1-16或其任何组合的载体。“载体”定义为尤其包含双或单链线形或环形形式的任何质粒、粘粒、噬菌体或双元载体，它们可以是或不是自我可传递的或可移动的，并且它们通过整合到细胞或质体基因组中可以转化原核生物或真核生物宿主或可以在染色体外存在(例如，具有复制起点的自主复制质粒)。具体包括是穿梭载体，它意指天然地或通过设计能在两种不同宿主生物体中复制的载体，所述宿主生物体可以选自细菌、植物、哺乳动物、酵母或真菌细胞。也包括克隆载体，其通常含有一个或少数量的限制性内切核酸酶识别位点及适于在克隆载体所转化的细胞鉴定和筛选中使用的标记基因，其中外源DNA序列可以通过可确定的方式插入所述的识别位点中而不损失载体的基本生物学功能。标记基因通常包括提供四环素抗性、潮霉素抗性或氨苄青霉素抗性的基因。术语“载体”也包括表达载体。表达载体是设计的克隆载体，其中插入在特定位点的编码序列将被转录，或被转录和翻译成蛋白质。
本发明还提供了包含SEQ ID NOs.1-16或其任何组合的表达盒。这里所用的“表达盒”意指能引导特定的核苷酸序列在适合的宿主细胞中表达的DNA序列，其包含可操作地连接目的核苷酸序列的启动子，该目的核苷酸序列可操作地连接终止信号。它通常也包含核苷酸序列正确翻译所需的序列。编码序列通常编码目的蛋白质，但是也可以编码功能性目的RNA，例如反义RNA或者有义或反义方向的非翻译的RNA。包含目的核苷酸序列的表达盒可以是嵌合的，意指它的至少一种成分相对于它的至少一种其它成分是异源的。表达盒也可以是天然存在的，但是以重组形式获得的用于异源表达的表达盒。表达盒中核苷酸序列的表达可以受组成型启动子或只有当宿主细胞暴露于一些特定的外部刺激物时才起始转录的诱导型启动子控制。在多细胞生物体情况下，启动子也可以对特定的组织或器官或发育阶段特异。
这种表达盒通常包含与目的核苷酸序列连接的转录起始区。这种表达盒提供有多个限制位点用于插入将处于调节区转录调节控制下的目的基因。表达盒还可以含有选择性标记基因。
表达盒通常将包含按转录5’-3’方向的转录和翻译起始区、目的DNA序列、及转录和翻译终止区。终止区可以是转录终止区或目的DNA序列天然的终止区，或者可以来源于另一个来源。为了在植物中表达，可以从根瘤农杆菌(A.tumefaciens)Ti质粒获得适宜的终止区，诸如章鱼氨酸合酶和胭脂氨酸合酶终止区。也参见，Guerineau等，Mol.Gen.Genetics，262141，1991；Proudfoot，Cell，64671，1991；Sanfacon等，Genes Dev.，5141，1991；Mogen等，Plant Cell，21261，1990；Munroe等，Gene，91151，1990；Ballas等，Nucl.AcidsRes.，177891，1989；Joshi等，Nucl.Acids Res.，159827，1987。
利用常规的重组DNA技术，可以将本发明分离的多核苷酸掺入到细胞中。一般地，这包括将DNA分子插入到DNA分子异源(即，不天然存在的)表达系统中。以正确的有义方向和正确的读框将异源DNA分子插入到表达系统或载体中。当期望将重链和轻链(或其片段，例如可变或恒定区)都引入表达系统时，编码所述重链和轻链成分的核苷酸序列可以克隆到相同载体中，或者做为可替代的方案，轻链(或其片段)可以克隆到第一载体中，重链成分(或其片段)可以克隆到第二载体中。载体含有插入的蛋白质编码序列转录和翻译必需的元件。美国专利号4,237,224描述了利用限制酶切割和用DNA连接酶连接，产生重组质粒形式的表达系统。然后，通过转化的方法引入这些重组质粒，并且在单细胞培养物中复制，该单细胞培养物包含培养中生长的原核生物体和真核生物细胞。重组基因也可以引入到病毒，诸如痘苗病毒中。通过将质粒转染到病毒感染的细胞中可以产生重组病毒。
适合的载体包括，但不限于下面的病毒载体诸如λ载体系统gt11，gtWEST.B，，Charon 4，和质粒载体诸如pBR322，pBR325，pACYC177，pACYC184，pUC8，pUC9，pUC18，pUC19，pLG339，pR290，pKC37，pKC101，SV40，pBluescript Il SK+/-或KS+/-(参见Stratagene，LaJolla，Calif，“Stratagene克隆系统”目录(1993))，pQE，pIH821，pGEX，pET系列(参见，studier等，“基因表达技术”，Methods inEnzymology，18560-89，1990)，和其任何衍生物。正在继续开发和鉴定适合的载体。重组分子可以通过转化、转染、接合、转移或电穿孔引入到细胞中。利用本领域的标准克隆方法，如Maniatis等或Sambrook等，Molecular Cloning.A Laboratory Manual，ColdSprings Laboratory，Cold Springs Harbor，New York(分别是1982或1989)所述的方法将DNA序列克隆到载体中。可以使用各种宿主-载体系统以表达这里所提供的多核苷酸编码的抗体或抗体片段。主要的是，载体系统必须与所用的宿主细胞相容。宿主-载体系统包括但不限于下面的用噬菌体DNA，质粒DNA或粘粒DNA转化的细菌；微生物诸如含有酵母载体的酵母；病毒(例如，痘苗病毒、腺病毒等)感染的哺乳动物细胞系统；病毒(例如，杆状病毒)感染的昆虫系统；和细菌病毒感染或通过粒子轰击(例如，生物弹击法)转化的植物细胞。特别优选植物和植物细胞联合适合的载体做为适合的表达系统使用。
上述系统中所用的载体表达元件的强度和特异性可以变化。根据所用的宿主-载体系统，可以使用大量适合的转录和翻译元件中的任何一种元件。不同的遗传信号和加工事件控制许多水平的基因表达(例如，DNA转录和信使RNA，“mRNA”翻译)。DNA的转录依赖于启动子的存在。因此，在一些实施方式中，本发明核苷酸序列，特别是SEQ IDNOs.1-16可操作地连接启动子。真核生物启动子的DNA序列不同于原核生物启动子的DNA序列。而且，真核生物的启动子和伴随的基因信号在原核生物系统中可能不被识别或不起作用，而且，原核生物的启动子在真核生物的细胞中不被识别和不起作用。相似地，原核生物中DNA的翻译依赖于不同于真核生物信号的正确原核生物信号的存在。原核生物中DNA的有效翻译需要mRNA上称为SD序列的核糖体结合位点。该序列是位于起始密码子，通常是AUG前的短mRNA核苷酸序列，该起始密码子编码蛋白质氨基末端甲硫氨酸。SD序列与165，rRNA(核糖体RNA)3’-末端互补，并且通过与rRNA形成双螺旋以允许核糖体的正确定位可能促进mRNA与核糖体的结合。对于最大化基因表达的综述，参见Koberts和Lauer，Methods in Enzymology 68473，1979。
启动子的选择将根据表达的时间和空间需要、靶物种和期望的表达水平而变化。在一个实施方式中，由证明在植物中起作用的启动子驱动核苷酸序列的表达。可能期望受一种以上类型条件控制的表达，因此可能期望在多个组织和/或在多个发育阶段的表达。已证明来源于双子叶植物的启动子可以在单子叶植物中起作用，并且反之亦然。对启动子的选择没有限制，因为主要选择标准是它们起作用驱动期望细胞中核苷酸序列的表达。
组成型表达的适合启动子包括CaMV 35S和19S启动子及来源于编码肌动蛋白或遍在蛋白的基因的启动子。遍在蛋白的基因启动子特别适合。典型的植物来源组成型启动子是豇豆胰蛋白酶抑制剂基因的启动子。然而，植物启动子不必须是植物来源的。例如，来源于植物病毒的启动子，诸如CaMV 35S启动子和来源于夜香树属黄叶卷曲病毒的夜香树属启动子(这里称为CMPS启动子)或来源于根瘤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的启动子诸如T-DNA启动子可以是植物启动子，它们适于在本发明中使用。CMPS启动子特别适合(参见，公开的国际专利公开号WO 01/73087)。
应该注意编码轻链和重链(或其片段)的本发明序列可以分别置于不同强度的启动子控制之下。在一个实施方式中，相对于与编码重链的序列可操作地连接的启动子，编码轻链的序列可操作地连接更强的启动子，因此促进了比重链水平更高水平的轻链表达。做为可替代的方案，编码轻链和重链(或其片段)的本发明序列可以置于相同启动子或相似强度的不同启动子控制之下。可以在表1中发现含有驱动编码轻链和重链序列表达的不同强度启动子的构建体例子。
在一个实施方式中，使用特异性启动子。用“特异性启动子”意指对于驱动特定组织中和/或相关组织或器官发育期望的特定时间下的基因表达具有高度偏爱的启动子。用“高度偏爱”意指在期望组织中的表达比任何不期望的组织中表达增加至少3倍、至少5倍、至少10倍、至少20倍、至少50倍或至少100倍。
本发明的核苷酸序列也可以在化学调节的启动子调节下表达。这使得只有用诱导性化学试剂处理植物时，才可以合成本发明的序列。在公开的申请EP 0 332 104和美国专利号5,614,395中详细描述了用于基因表达化学诱导的优选技术。可以与本发明多核苷酸一起使用的诱导型启动子的典型例子是来源于编码丝氨酸-苏氨酸激酶的拟南介(Arabidopsis)基因的启动子PARSKI，并且由脱水、脱落酸和氯化钠可诱导该启动子(Wang和Goodman，Plant J 837，1995)。用于化学诱导的另一种适合的启动子是烟草PR-1a启动子。还有另一种化学诱导的启动子是由植物中天然不存在的糖皮质激素诱导的启动子，美国专利号6,063,985中Chua公开了该启动子。
另一类适合的启动子是组织特异性启动子。组织特异性启动子的非限制性例子包括绿色组织特异性、根特异性、茎特异性和花特异性。适于在绿色组织中表达的启动子包括调节参与光合作用的基因表达的许多启动子，其中已经从单子叶植物和双子叶植物克隆了许多这种基因。适合的启动子是来源于磷酸烯醇羧化酶基因的玉米PEPC启动子(Hudspeth & Grula，Plant Molec Biol 12579，1989)。根特异性表达的适合启动子是de Framond(FEBS 290103，1991)和EP 0 452269中所述启动子。示例性的茎特异性启动子是美国专利号5,625,136中所述的启动子，其驱动玉米trpA基因的表达。如果选定适合的组织特异性表达启动子，并且利用本领域已知的方法产生表达构建体，可以在本发明转化的植物表皮、根、维管组织、分生组织、形成层、皮层、木髓、叶和花中发现组织特异性表达。
本发明的一个实施方式包括以种子偏爱或种子特异的方式，组成型或诱导型地表达至少一种本发明核苷酸序列的转基因植物。特别优选的实施方式提供了至少一种本发明序列的种子特异性表达，其中每个多核苷酸可操作地连接用于最佳表达和期望定位的信号肽及液泡和/或内质网靶向信号。进一步的实施方式包括在绿色组织中组成型地或在诱导下表达核苷酸序列的转基因植物。
有用的组织特异性，发育调节的启动子例子包括果实特异性启动子诸如E4启动子(Cordes等，Plant Cell 11025，1989)，E8启动子(Deikman等，EMBO J，73315，1988)，猕猴桃的猕猴桃碱(actinidin)启动子(Lin等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，905939，1993)，2A11启动子(Houck等，美国专利4,943,674)，和番茄pZ130启动子(美国专利5,175,095和5,530,185)；和β-伴大豆球蛋白(conglycinin)7S启动子(Doyle等，J.Biol.Chem.，2619228，1986；Slighton和Beachy，Planta 172356，1987)，和种子特异性启动子(Knutzon等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 892624，1992；Bustos等，EMBO J.101469，1991；Lam和Chua，J.BioL Clzem.26617131，1991；stayton等，Aust.J.Plant.Physiol.18507，1991)。美国专利5,753,475中公开了果实特异性基因调节。其它有用的种子特异性启动子包括，但不限于napin，云扁豆蛋白，玉米醇溶蛋白，大豆胰蛋白酶抑制剂，7S，ADR12，ACP，硬脂酰-ACP脱饱和酶，油质蛋白，Lasquerella羟化酶和大麦醛糖还原酶启动子(Bartels，Plant J.7809，1995)，EA9启动子(美国专利5,420,034)，和Bce4启动子(美国专利5,530,194)。有用的胚特异性启动子包括玉米球蛋白1和油质蛋白启动子。有用的胚乳特异性启动子包括水稻谷蛋白-1启动子，低pIα-淀粉酶基因的启动子(Amy32b)(Rogers等，J BioL Chem.25912234，1984)，高pIα-淀粉酶基因的启动子(Amy 64)(Khurseed等，J.Biol.Chem.26318953，1988)，和大麦巯基蛋白酶基因的启动子(″Aleurain″)(Whittier等，Nucleic Acids Res.152515，1987)。可用于在种子质体中偏爱表达的植物功能性启动子包括来源于植物贮藏蛋白质基因和来源于参与含油种子中脂肪酸生物合成的基因的启动子。这种启动子的例子包括来源于这种基因诸如napin(Kridl等，Seed Sci.Res.1209，1991)，云扁豆蛋白，玉米醇溶蛋白，大豆胰蛋白酶抑制剂，ACP，硬脂酰-ACP脱饱和酶和油质蛋白的5’调节区。在EP 0 255 378 B1和美国专利5,420,034和5,608,152中讨论了种子特异性基因的调节。也可以构建启动子杂合体以增加转录活性(Hoffinan，美国专利号5,106,739)，或以联合期望的转录活性和组织特异性。
除了选择适合的启动子外，用于植物中表达本发明序列的构建体也可以包含连接在异源核苷酸序列下游的适合转录终止子。本领域可以获得和已知几种这样的终止子，诸如来源于CaMV的tml，来源于rbcS的E9。已知在植物中起作用的任何可获得的启动子都可以用在本发明的范围中。
大量其它的序列可以掺入到本发明中所述的表达盒中。这些序列包括已经被证明与本发明一起使用可以增强表达的序列诸如来源于Adhl和bronzel的内含子序列，和病毒的前导序列诸如来源于TMV，MCMV和AMV的前导序列。本发明的表达载体可以进一步包含PATl基因的内含子部分，如Rose和Last的美国专利号5,681,277中所述，该专利公开了PAT1基因中头两个内含子中至少一个内含子的包含引起了目的多肽增加的表达。
可以期望向植物中不同细胞位置靶向本发明核苷酸序列的表达。在一些情况下，可以期望在胞质溶胶中定位，而在其它情况下，可以优选在亚细胞的细胞器中定位。利用本领域熟知的技术进行表达的亚细胞定位。通常，对编码靶肽的DNA进行操作并且将其融合到核苷酸序列的上游，该靶肽来源于已知的靶向细胞器基因产物。例如，由于导向肽，线粒体前导肽的存在，大多数核编码的线粒体蛋白质被输入到线粒体中(Neupert，Ann Rev Biochem，66863，1997)。通常，在前导肽所连接的蛋白质被输入到线粒体中以后，蛋白酶解该前导肽。线粒体前导肽可以连接非线粒体蛋白质以将所得到的重组过客蛋白质(passenger protein)导向线粒体。可以通过基因工程从现存的线粒体靶向蛋白质，例如蓝茉莉叶烟草(N.plumbaginifolia)ATPase-β获得编码线粒体前导肽的核酸序列。做为可替代的方案，可以在实验室中，例如通过寡核苷酸合成改造线粒体前导肽的编码序列。此外，已经证明线粒体前导肽的串连重复可以增强一些蛋白质靶向线粒体(Galanis等，FEBS Lett 282425 1991)。因此，在本发明一些实施方式中，在制备转化构建体时使用多个串连拷贝的选定的线粒体前导序列可能是有用的。对于本发明的目的而言，线粒体前导肽定量表征为靶向至少25％的稳定重组蛋白质到线粒体中的能力。更优选地，这种线粒体前导肽将靶向至少50％，并且更优选地至少75％的稳定重组蛋白质到线粒体中。通过细胞分级分离，接着例如利用对重组蛋白质特异的抗血清进行定量免疫印迹分析，可以测定线粒体靶向的重组蛋白质的数量。
也已知叶绿体的许多这种靶序列，并且已经证明了它们在异源构建体中的功能(参见，例如美国专利号6,388,168 B1；Ruf等，NatureBiotech.，19870，2001；Heifetz，Biochimie，82655，2000；Heifetz和Tuttle，Curr.Opin.Plant Biol.，4157，2001)。在各种实施方式中，本发明序列的表达被靶向宿主细胞的线粒体、叶绿体、色质体(chromoplast)、造粉体、内质网或靶向液泡。在一个实施方式中，表达被靶向种子或贮藏组织中的蛋白质体。达到这些目的的技术是本领域所熟知的。
本发明的序列可用于在植物中产生针对肠病原体，特别是ETEC的抗体或抗体片段。因此，在本发明的一个方面，利用适合的方法将本发明的核苷酸序列或载体引入到植物细胞中。然后，从这种转化细胞再生整个植物，该植物能表达本发明的抗体或抗体片段，并且所述的抗体或抗体片段被表达。可选地，利用标准纯化方法，从表达抗体或抗体片段的植物/植物材料纯化所述的抗体或抗体片段。本领域的技术人员将理解，如果期望重链和轻链(或其片段)在相同的植物中共表达，可以用大量方法实现这种共表达。例如(i)通过向植物细胞中引入编码重链和轻链(或其片段)两者的单一载体；(ii)通过向相同的植物细胞中引入在不同载体上的不同链(或其片段)；或(iii)将编码轻链(或其片段)的载体转化到第一植物细胞中，将编码重链(或其片段)的载体转化到第二植物细胞中，从所述的转化细胞再生植物，并且杂交所述植物以获得表达轻链和重链(或其片段)的子代。
在植物中产生的抗体/抗体片段可以是任何已知类别的抗体诸如IgG，IgA，IgM和IgE。
本发明也包括编码中和性单克隆抗体的序列的用途。单克隆抗体的产生在本领域是常规的。可以在标准课本诸如Ausubel等，ShortProtocols in Molecular Biology，第二版，Wiley & Sons，1992；King，Applications and Engineering of Monoclonal Antibodies，Taylor& Francis，1999；Zola，Monoclonal Antibodies，Springer Verlag，2000中发现单克隆抗体产生的方法。例如在美国专利号4,443,549中可以发现抗ETEC的单克隆抗体的产生。
简而言之，利用本领域熟知的标准方法给动物施用来源于ETEC的目的抗原。一旦动物已经发生了免疫应答，就典型地从脾脏细胞分离抗体分泌细胞，但是可以使用抗体分泌B细胞的其它来源诸如血液。一旦获得了细胞，通过融合骨髓瘤细胞系或通过病毒转化诸如EB病毒转化常规地无限增殖化该细胞。然后筛选无限增殖化的(杂交瘤)细胞，培养和检测抗目的抗原的抗体分泌。一旦鉴定了适合的细胞，就克隆扩充它们，并且检测克隆细胞的抗体产生。本发明实践中所用的单克隆抗体可以是同源或异源的，其中同源单克隆抗体来源于与它们所施用给的动物相同物种的动物的抗体分泌细胞，而异源单克隆抗体来源于不同物种的细胞。在一个实施方式中，所用的单克隆抗体来源于小鼠单克隆细胞系。在另一个实施方式中，所用的单克隆抗体来源于牛抗体分泌性B细胞。一旦鉴定了适合的抗体分泌细胞，就可以利用本领域已知和这里所述的标准分子生物学技术分离编码抗体的多核苷酸序列，而不需要过多的试验。
本发明也包括重组抗体的用途。产生重组抗体的一种方法是使用噬菌体展示方法。利用噬菌体展示产生和筛选抗体的方法是本领域所熟知的，并且可以在例如Vaughan等，Nature Biotech.16535-539，1998；Watkins和Ouwehand，Vox Sanguinis 7872-79，2000；和其中所引用的参考文献中发现这些方法。
通过噬菌体展示的抗体产生包括免疫球蛋白可变重链(VH)和可变轻链(VL)序列联合文库的产生。这些序列被插入到编码外被蛋白的噬菌体基因中，这样VH和VL序列在丝状噬菌体外被上表达(展示)。用通常称为淘选的亲和性筛选方法筛选表达目的VH和VL区的噬菌体。
通过从抗体分泌B细胞分离mRNA，并且利用免疫球蛋白基因保守区的引物，通过RT-PCR扩增mRNA，产生VH和VL序列。可以从直接从动物，优选地用目的抗原免疫的动物获得的B细胞获得mRNA，，或者从产生抗目的抗原抗体的杂交瘤细胞获得mRNA。一旦获得VH和VLcDNA，就可以通过将VH和VL序列顺序克隆到相同载体中(Huse等，Science，2461275-1281，1989)，通过利用噬菌体P1的loxCre位点特异性重组系统进行组合感染(Waterhouse等，Nuc.Acids Res.，212265-2266，1993)，或者通过PCR装配(Clackson等，Nature，352624-628，1991；Marks等，J.Molec.Biol.，222581-597，1991)重组它们。做为可替代的方案，例如，如Griffiths等.(EMBO J，133245-3260，1994)中所述，可以使用可变区序列的合成库。
一旦已经构建了噬菌体展示文库，就可以通过淘选筛选展示活性抗体的噬菌体。通常，纯化的抗原附着在固体基质诸如塑料表面或亲和层析柱上。抗原可以直接地或者通过媒介物诸如链霉抗生物素蛋白/生物素系统附着于表面上。待要筛选的噬菌体与抗原温育，并且洗掉未结合的噬菌体。单轮筛选可以富集特异性噬菌体达到20到1000倍。通常，进行几轮筛选以增加特异性和亲和性。一旦鉴定了展示具有期望特征的抗体的噬菌体，就在适合的细菌宿主中培养它们，分离编码抗体的DNA，然后测序DNA。然后，利用任何的标准技术，包括这里所述的标准技术，多核苷酸可以用于转化植物。
做为可替代的方案，可以使用嵌合抗体。嵌合抗体是其中免疫球蛋白分子的不同区来自于不同来源的抗体。典型地，嵌合抗体包含小鼠可变区和来源于抗体将要施用给的物种的恒定区，例如小鼠可变区和牛恒定区。嵌合抗体的产生已经变成本领域的常规技术，不需要任何抗体-抗原相互作用的详尽结构知识(Watkins和Ouwehand，VoxSanguinis，7872-79，2000)。可以通过称为“CDR嫁接”的方法产生另一种形式的抗体(Jones等，Nature，321522-525，1986)。CDRs(互补决定区)是称为免疫球蛋白折叠的结构的反平行β-折叠片之间的顶部环。β-折叠片形成了正确定向CDRs与抗原相互作用的框架。在CDR嫁接中，来源于一种物种的特异性抗体CDRs(通常是鼠科的，但是也可以是鸡、山羊、绵羊、牛的，CDRs)可以嫁接到适合的β-折叠片框架上(通常是人类框架)。
此外，可以从转基因动物，特别是转基因小鼠获得抗体(Bruggemann和Taussig，Curr.Opina.Biotechnol.，8455-458，1997)。在这种方法中，内源小鼠免疫球蛋白基因被失活，并且用来源于目的物种的未重排的免疫球蛋白序列置换它。然后，利用上述方法，从转基因小鼠产生目的物种的单克隆抗体。一旦鉴定了产生适合单克隆抗体的杂交瘤系，就可以分离编码抗体的多核苷酸，并且将起转化到植物中。
本发明的序列也可以用于产生单链Fv抗体(scFv)，特别是抗ETEC抗原的scFv抗体。scFv抗体典型地包含由接头连接在一起的重链可变区和轻链可变区。因此，scFv抗体缺少天然存在抗体中发现的恒定区。接头通常是多肽，但是可以使用其它的接头诸如化学接头。接头通常具有允许scFv正确定向，使得轻链和重链可变区可与抗原相互作用的长度。在一些例子中，接头是可切割的接头。scFv抗体的产生和应用方法是本领域所熟知的，并且可以在例如美国专利号4,947,778；5,260,203和5,863,765中发现该方法。
做为可替代的方案，这里公开的序列可以用于产生缺少轻链的抗体，尤其是抗ETEC的抗体，特别是缺少轻链，并且适于在植物中产生的抗ETEC的抗体。由骆驼科(Camelidae)动物天然产生缺少轻链的抗体。这些抗体包含2个重链的二聚体，但是缺少与大多数哺乳动物中抗体相关的轻链。此外，重链的恒定区通常缺少CH1结构域。可以在大量参考文献，例如美国专利号5,759,808；5,800,988；5,840,526；5,874,541；6,005,079；6,015,695和欧洲专利局公布EP 1118669A2中发现有关这些抗体的详细信息。也包括这种抗体的抗体片段，其仅包含本领域已知的可变区，称为VHH抗体，及包含骆驼科动物可变区和异源恒定区，例如牛恒定区的嵌合抗体。嵌合抗体的产生方法是本领域所熟知的。例如，可以产生载体，在该载体中编码骆驼科动物类型重链可变区的核苷酸序列在框内与编码来源于非骆驼科动物物种恒定区的序列拼接。
此外，可以联合编码不同可变区的序列，以产生具有针对不同抗原或表位的可变区的单一抗体。例如，可以产生带有针对K88抗原的第一可变区和针对K99抗原的第二可变区的嵌合IgG抗体。做为可替代的方案，可以用编码抗体的构建体转化植物，当装配该抗体时，其具有针对相同抗原不同表位的可变区。
抗体也可以掺入纯化部分。在纯化期间或纯化后，可以从抗体切割或可以不从抗体切割该纯化部分。纯化部分的非限制性例子是美国专利号5,594,115中描述的聚组氨酸镍螯合氨基酸序列。另一个例子是用于纯化的表位，诸如美国专利号6,379,903中所述的表位。
在一个实施方式中，至少一种这里所述的序列被引入到植物或植物细胞中进行表达。可以用本领域普通技术人员已知的大量方法，将这里所述的多核苷酸序列引入到植物细胞中。本领域的技术人员将理解，方法的选择可能依赖于靶向转化的植物类型。转化植物细胞的适合方法包括，但不限于微注射(Crossway等，BioTechniques 4320，1986)，电穿孔(Riggs等，Proc Natl Acad Sci USA 835602，1986)，农杆菌属(Agrobacterium)介导的转化(Hinchee等，Biotechnology 6915，1988；Ishida等.Nature Biotechnology 14745，1996)，直接基因转移(Paszkowski等，EMBO J.，32717，1984；Hayashimoto等，Plant Physiol.，93857，1990(水稻)，和利用装置的弹道粒子加速。在Sanford等，美国专利号4,945,050；和McCabe等，Biotechnology 6923，1988；Weissinger等，Annual Rev Genet.，22421，1988；Sanford等，Particulate Science and Technology527，1987(洋葱)；Svab等，Proc Natl Acad Sci US，878526，1990(烟草叶绿体)；Christou等.Plant Physiol，87671，1988(大豆)；McCabe等，Bio/Technology 6923，1988(大豆)；Klein等，Proc Natl Acad Sci USA，854305，1988(玉米)；Klein等，Bio/Technology，6559，1988(玉米)；Klein等，Plant Physiol.91440，1988(玉米)；Fromm等，Bio/Technology 8833，1990；Gordon-Kamm等，Plant Cell 2603，1990(玉米)；Koziel等，Biotechnology 11194，1993(玉米))；Shimamoto等，Nature 338274，1989(水稻)；Christou等，Biotechnology 9957，1991(水稻)；Datta等，Bio/Technology 8736，1990(水稻)；欧洲专利申请EP 0332 581(鸭茅(orchard grass)和其它早熟禾亚科(Pooideae))；Vasil等，Biotechnology 111553，1993(小麦)；Weeks等，PlantPhysio.，1021077，1993(小麦)；Wan等，Plant Physiol.，10437，1994(大麦)；Jahne等，Theor.Appl.Genet.，89525，1994(大麦)；Umbeck等，Bio/Technology 5263，1987(棉花)；Casas等，Proc.Natl.Aca d.Sci.USA 9011212，1993(高粱)；Somers等.Bio/Technology 101589，1992(燕麦)；Torbert等，Plant CellReports 14635，1995(燕麦)；Weeks等，Plant Physiol 1021077，1993(小麦)；Chang等，WO 94/13822(小麦)和Nehra等，ThePlant Journal 5285，1994(小麦)中可以发现具体的例子。.
可以在Koziel等，Biotechnology 11194，1993)；Hill等，Euphytica 85119，1995)；和Koziel等.(Annals New YorkAcad.Sci.，792164，1996)中发现通过微粒轰击向玉米中引入重组DNA分子的适合的示例性方法。另外的实施方式使用了EP 0292 435中所述的玉米的原生质体转化方法。可以用本发明的单一多核苷酸或多个多核苷酸，例如通过共转化进行植物的转化，并且这些技术适合与这里所述的序列一起使用。
在另一个实施方式中，至少一种本发明的核苷酸序列被直接转化到质体基因组中。在美国专利号5,451,513、5,545,817、5,545,818和6,388,168 B1中，PCT公布号.WO 95/16783，和McBride等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，917301，1994)中详尽地描述了质体转化的技术。叶绿体转化的基本技术包括利用生物弹击法或原生质体转化，包括氯化钙或PEG介导的转化，向适合的靶组织中引入位于选择性标记及目的基因侧翼的克隆质体DNA区。1到1.5kb的侧翼区，称为导向序列，有利于与质体基因组的同源重组，因此可以置换或修饰原质体系的特定区。通常，赋予对壮观霉素和/或链霉素抗性的叶绿体16SrRNA和rps12基因中的点突变被用做转化的选择性标记(Svab等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，878526，1990；Staub和Maliga，Plant Cell，439，1992)。这以每100次靶叶片轰击大约1次的频率产生了稳定的同质转化体。这些标记之间克隆位点的存在可以产生质体靶向的载体以引入外源基因(Staub和Maliga，EMBO J.12601，1993)。通过用显性选择性标记，编码壮观霉素-解毒酶氨基糖苷类-3′-腺苷酰基转移酶的细菌aadA基因置换隐性rRNA或r-蛋白质抗生素抗性基因获得显著增加的转化频率(Svab和Maliga，Proc NatlAcad Sci USA，90913，1993)。以前，这种标记成功地用于绿藻莱因哈德衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)质体基因组的高频率转化(Goldschmidt-Clermont，Nucl.Acids Res.，194083，1991)。用于质体转化的其它选择性标记是本领域已知的，并且包括在本发明范围内。
通常，转化后需要大约15-20个细胞分裂周期以达到同质体状态。其中基因通过同源重组插入到每个植物细胞中存在的所有几千个拷贝的环形质体基因组中的质体表达利用了优于核表达基因的巨大拷贝数优势，使得表达水平可以容易地超过总可溶植物蛋白质的10％。在一个实施方式中，本发明的多核苷酸序列被插入到质体靶向载体中，并且转化到期望的植物宿主的质体基因组中。获得含有本发明核苷酸序列的质体基因组同型的植物，并且优选地该植物能高表达核苷酸序列。
一旦本发明的多核苷酸被转化到特定植物物种或品种中，利用常规的育种技术，它就可以在该物种中繁殖，或者转移到相同物种的其它品种，特别地包括商业品种中。例如，为了最大化抗体的生产，多核苷酸可以被转移到高蛋白质品种中，例如在它们的种子或其它优选地可食用的部分中具有高水平蛋白质产生的品种中。做为可替代的方案，可以使用已经被证明显示了增加的装配复合蛋白质能力的植物系。特别有用的植物包括农艺学上重要的作物，例如玉米、水稻、苜蓿和大豆。可以通过有性繁殖传递所述引入到转基因种子和植物中的遗传特性，并且可以在子代植物中维持和繁殖这种遗传特性。因此，本发明的范围包括利用本发明的任何植物产生的杂交植物或种子。
做为可替代的方案，通过无融合生殖育种程序传递如上所述引入到转基因植物中的遗传特性。无融合生殖是一些植物物种天然出现的通过种子无性生殖的能力，结果是无融合生殖产生的种子唯一地从母亲遗传了它们的基因。在无融合生殖期间，用于产生单倍体配子的染色体数量的减少被绕过，这样在称为孤雌生殖的过程中就产生了具有未改变的染色体组成的未减数的生殖细胞(未减数的卵)，其最终发育成没有受精的胚。无融合生殖出现在各种植物科中400多个植物物种中，并且其受遗传控制。摩擦禾属(Tripsacum)，优选地鸭茅状摩擦禾(Tripsacum dactyloides)，小麦一种无融合生殖野生亲缘植物，其是向栽培作物诸如小麦中渐渗无融合生殖的遗传资源的来源(Hoisington等，Proc.Natl.Acad.Sci.，965937，1999)。
本发明的实施方式也涉及从转基因植物获得的转基因植物细胞，组织、器官、种子或植物部分。本发明也包括植物的转基因后代及从后代获得的转基因植物细胞、组织、器官、种子和植物部分。
在一个实施方式中，已经优化了本发明的多核苷酸以在植物中表达，但是它们编码与SEQ ID NOs 1-16或SEQ ID NOs 17，18和67-72中任何一个序列相同的氨基酸序列。尽管在许多情况下，异源基因可以没有修饰而在植物中高水平表达，但是转基因植物中的低表达可能是由核苷酸序列具有在转基因植物中不偏爱的密码子所引起的。本领域已知所有的生物体都具有对密码子使用的特异性偏爱，并且本发明中所述的核苷酸序列密码子可以被改变以符合特定的植物偏爱，同时维持由此所编码的氨基酸。而且，从具有至少约35％GC含量，常常超过约45％，典型地超过约50％，更典型地地超过约60％GC含量的编码序列可最好地获得植物中的高表达。具有低GC含量的核苷酸序列，由于可以使信息不稳定的ATTTA基序和可以引起不适合的聚腺苷酸化的AATAAA基序的存在，可以在植物中很低的表达。尽管优选的基因序列可以在单子叶植物和双子叶植物物种中充分地表达，但是可以修饰序列以满足单子叶植物或双子叶植物的特异性密码子偏爱和GC含量偏爱，因为已经证明了这些偏爱的差异(Murray等，Nucl.Acids Res.，17477，1989)。此外，可以筛选核苷酸序列中可以引起信息截短的非常规剪接位点的存在。可以利用公开的专利申请EP 0 385 962，EP 0359 472和WO 93/07278中所述的方法及位点定向诱变，PCR和合成基因构建进行诸如上述核苷酸序列中所需要进行的改变。
利用这里所述的方法，本领域的技术人员可以在各种植物中表达本发明的多核苷酸。植物的具体选择随着个体而变化。在一个实施方式中，表达这里所述多核苷酸的植物是单子叶植物或双子叶植物。本发明实践中可以使用的植物的非限制性例子包括金合欢、苜蓿、小茴香(aneth)、苹果树、杏树、洋蓟、芝麻菜、芦笋、鳄梨树、香蕉树、大麦、豆、甜菜、黑莓、蓝莓、嫩茎花椰菜、抱子甘蓝、甘蓝、canola、罗马甜瓜、胡萝卜、木薯、花椰菜、芹菜、樱桃树、菊苣、芫荽、柑桔、克莱门小柑桔、咖啡树、玉米、棉花、黄瓜、花旗松、茄子、苣荬菜、宽叶莴苣、桉树、茴香、无花果、大蒜、葫芦、葡萄树、柚子树、蜜露(honey dew)、豆薯、猕猴桃、莴苣、韭葱、柠檬、酸橙树、火炬松、芒果、瓜、蘑菇、油桃、坚果、燕麦、油棕、油籽油菜、黄秋葵、洋葱、桔树、观赏植物、番木瓜树、欧芹、豌豆、桃树、花生、梨树、胡椒、柿子树、松树、菠萝、车前草、李子树、石榴树、白杨树、马铃薯、南瓜、温柏、radiata pine、菊苣(radicchio)、小萝卜、覆盆子、水稻、黑麦、高梁、美国长叶松、大豆、菠菜、西葫芦、草莓、糖甜菜、甘蔗、向日葵、甘薯、香枫、红桔、茶、烟草、蕃茄、黑小麦、草皮草、芜菁、西瓜、小麦、山药和夏南瓜。在一个实施方式中，植物选自玉米、小麦、黑麦、大麦、水稻、燕麦、大豆和烟草。在进一步的实施方式中，植物选自玉米、水稻、大豆、小麦和糖甜菜。认为红花是双子叶植物，其特别适于与本发明一起使用。
可以使用表达这里所述序列的植物，除了标准的收获和贮藏技术，不需要进一步加工。如果期望，例如通过干燥、切碎、碾磨、压碎、碾压、挤压、粒化、脱脂或本领域已知的其它方法，可以进一步加工植物和/或来源于植物的组织诸如绿色组织、果实或种子。
可以使用未纯化、部分纯化或基本纯化形式的这里所述的多核苷酸编码，并且在宿主细胞，例如植物中表达的多肽。蛋白质纯化的方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法包括沉淀，例如硫酸铵或乙醇沉淀，酸提取，阴离子或阳离子交换层析，磷酸纤维素层析，疏水相互作用层析，亲和性层析、羟磷灰石层析、凝集素层析、高效液相层析(HPLC)、在天然或变性条件下电泳、等电聚焦和免疫沉淀。可以在美国专利号3,984,539；4,623,541；和4,816,252中发现抗体纯化的具体例子。
在一个实施方式中，给动物喂食表达这里所述多核苷酸和多肽的植物以治疗和/或预防肠疾病诸如ETEC引起的colliobacillosis。预防意指避免与肠疾病诸如colliobacillosis有关的临床症状。治疗意指与患有相同肠疾病，但是没有接受所述多肽、植物或植物材料的动物比较，在接受本发明多肽、植物或植物材料的动物中与肠疾病有关的临床症状的减轻。临床症状不限于这样的事件诸如腹泻和发烧，而是也包括增重速率和/或饲料转化率的改变。
在一个实施方式中，向动物经肠施用本发明的植物或植物材料。对于口服施用，可以施用植物或植物部分，例如叶、种子或果实，而不需要进一步加工。在其它实施方式中，利用本领域或这里所述的任何已知方法，可以对植物或植物材料进行一些加工，例如增加适口性和/或可消化性。例如，植物材料可以被脱水(例如，干燥)、切碎或碾磨。植物材料可以掺入到丸粒或压缩的立方料中。在另外的实施方式中，植物或植物材料可以与其它材料混合为例如总的混合定量。在另一个实施方式中，本发明的植物或植物材料可以掺入到人工代乳品中以施用给新生儿。用于产生和喂食代乳品的方法是本领域所熟知的，并且例如可以在美国专利号6,348,223；6,348,222；5,756,132；4,961,934；4,614,653；和4,269,846中发现所述的方法。植物或植物材料可以与液体混合以形成例如口服施用诸如灌服的悬浮液。在一个实施方式中，液体是奶。在另一个实施方式中，液体是水，而还是在另一个实施方式中，液体是电解质溶液，典型地是等渗的电解质溶液，诸如等渗盐水。
本发明的植物或植物材料也可以是待要添加到饲料或食品中的预混合料的一部分。预混合料是随后添加到饲料或食品中的各种组分，通常是维生素、矿物质和抗微生物剂的混合物。在一个实施方式中，预混合料可以包含本发明的植物或植物材料及缓冲剂。同样，本发明的植物或植物材料可以用做食物或饲料添加剂。这样，制成食品或饲料时，植物或植物材料可以添加到食品或饲料的组分中，或者植物或植物材料可以添加到已经存在的饲料食品中诸如敷料中。
在一些实施方式中，特别是其中本发明的多肽已经被部分或基本上纯化的一些实施方式中，口服施用的固体剂量形式可以包括胶囊、片剂、丸剂、粉末和颗粒。在这种固体剂量形式中，常规地联合使用本发明的化合物与适合标示施用途径的一种或多种助剂。如果口服施用，化合物可以与乳糖、蔗糖、淀粉、链烷酸的纤维素酯、纤维素烷基酯、滑石、硬脂酸、硬脂酸镁、氧化镁、磷酸和硫酸的钠和钙盐、明胶、阿拉伯树胶、藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮和/或聚乙烯醇混合，然后制成片剂或胶囊以方便施用。这种胶囊或片剂可以含有控制释放的成分，如同羟丙基甲基纤维素中活性化合物的分散体中可以提供的该控制释放的成分。在胶囊、片剂和小丸的情况下，剂量形式也可以包含缓冲剂诸如柠檬酸钠、碳酸氢钠，或者碳酸镁或钙，或者碳酸氢镁或钙。片剂和小丸还可以制备成带肠溶衣的形式。
通过混合本发明的材料和适合的非刺激性赋形剂诸如可可油、合成的单、双或三甘油酯、脂肪酸或聚乙二醇可以制备用于直肠施用的栓剂，所述的这些赋形剂在常温下是固体，但是在直肠温度下是液体，因此将在直肠中融化和释放物质。
在一个实施方式中，在向新生动物的母亲进行接种程序的同时，向新生动物施用本发明的植物或植物材料。在该实施方式中，通常在妊娠中期(midgestation)或以后，用制备的抗ETEC的疫苗接种母亲至少一次。初生后，向接种母亲生出的后代施用本发明的组合物。给怀孕雌性接种抗ETEC的方法是本领域已知的，并且例如在Barman和Sarma，Indian J.Expt.Biol.，371132，1999；Cooper，Vet.Clin.N.Amer.Food Anim.Prac.，16117，2000中可以发现所述的方法。
本领域的技术人员公认所施用的植物材料的量将随着熟知的因素而变化，所述因素是诸如动物大小、疾病的严重性，是用于预防还是治疗用途，动物的物种，施用的方式，植物材料的形式，例如是否植物材料经过了加工，和是否植物或植物材料与另外的材料联合施用以增加可利用性或防止活性组分的降解。一般地，给动物施用足够的植物材料以每天提供至少5mg，至少10mg，至少25mg，至少50mg，至少75mg或至少100mg的抗ETEC抗体。可以单剂量，多剂量或连续地诸如在可以随意获得的饲料中施用植物或植物材料。
可以设计表达盒以在各种作物中稳定和最佳地表达抗体分子。可以修剪表达盒用于特定的应用，并且这种表达盒含有各种启动子和信号序列，它们将决定抗体分子加工能力，产物的稳定性和可以回收抗体分子的容易程度。适当的启动子和信号序列的确定在分子生物学领域是常规的，并且本领域的技术人员不需要过多试验就可以完成。除了影响转录和翻译效率的因素，重组蛋白质的累积和稳定性可以取决于选定用于表达的植物细胞区室。通过给蛋白质连接特异性引导信号或通过在组织特异性启动子后克隆基因，可以获得特定细胞区室中的累积。抗体分子可以靶向和维持在蛋白质合成的任何一种主要位点中。在一个实施方式中，通过向分子添加ER保留信号，抗体分子被靶向内质网(ER)。可以向轻链和重链都添加信号。做为可替代的方案，可以只向轻链添加信号以有利于轻链和重链的结合，并且将分泌限制于结构成熟的装配的抗体分子。也可以只向重链添加信号以有利于ER中抗体分子的积累。与ER保留信号联合使用，不同启动子下重链和轻链的克隆可以允许更高地积累抗体。特别优选ER保留信号“SEKDEL”。
表1

实施例下面的实施例用于提供本发明应用的示例。下面的实施例的目的不在于完整地定义或以其它方式限制本发明的范围。
实施例1抗K99抗体1.1用PCR克隆抗体基因聚合酶链式反应技术和特异性寡聚引物用于从杂交瘤cDNA克隆免疫球蛋白基因或区域。从在http//immuno.bme.nwu.edu可以获得的含有小鼠重链和轻链序列汇集的Kabat数据库选择对IgG重链和轻链特异性的PCR引物。设计编码成熟可变区NH2-末端的区域的引物以在信号序列起始，并且使引物带有一些简并性以使得这些引物可以用做“通用引物”(Coloma MJ等，J Immunol Methods，15289，1992)。从轻链和重链第一恒定区(CH1)的保守性序列设计用于可变区特异性PCR扩增的3’引物(Dattama jumdar等，Immunogenetics，43141，1996)。表2表示用于小鼠免疫球蛋白轻链和重链可变区PCR克隆的引物序列和杂交位置。
利用基于RNeasy小量制备试剂盒(Qiagen，Hilden Germany)的方法，从107个杂交瘤细胞2BD4E4(ATCC HB-8178；K99 F5菌毛)分离总的RNA。通过让细胞通过18号规格的针至少5次裂解细胞。利用Oligotex mRNA小量制备试剂盒(Qiagen)，从RNA纯化聚-A+RNA。利用Clontech cDNA合成试剂盒(Clontech Laboratories，Inc.，PaloAlto，CA)，大约20ng用于产生第一链cDNA。在70℃，mRNA与寡(dT30)预温育2分钟，然后在冰上冷却2分钟。在10μl的反应体积中添加缓冲液(50mM，Tris-HCI，pH 8.3；75mM，KCl；6mM，MgCl2；2mMDTT；1mM dNTPs，终浓度)和Moloney鼠白血病病毒逆转录酶(200单位，Superscript，BRL SuperScript II Rnase H，Rockville，MD，USA)，在42℃温育溶液1小时。反应后，添加10μl TE缓冲液(10mM Tris-HCl1mM EDTA)。
接着，向含有免疫球蛋白特异性引物的20μl PCR反应混合物添加二十分之一(或1μl)第一链cDNA反应物。表2中列出了所使用的引物。利用Taq聚合酶(0.025U)，每种引物各0.25μM和每种dNTP各0.2μM扩增混合物28个循环。用于PCR的温度和时间如下94℃变性15秒；50℃退火15秒；68℃延伸1分钟。引物对应于有义和反义引物分别对小鼠免疫球蛋白信号序列和恒定区特异的通用重链和轻链引物。
分开的试管用于轻链和重链扩增。纯化等份的PCR产物(Qiagen)，测序，然后对这两种链的有义引物(基于FR1区)和反义引物(基于恒定区的5’末端)设计引物。PCR产物克隆到pTOPO(Invitrogen，Carlsbad，CA)中。利用M13正向和反向引物(New England Biolabs，Beverly，MA)证实序列后，用SpeI/XhoI消化轻链的可变区，用SpeI/AccI消化重链的可变区，并且将所得到的片段克隆到期望的表达载体中。
表8包含可变区序列的序列ID号列表。这些序列是完整的可变区，其开始于第一构架区域的第一个密码子，结束于可变区第四构架区的最后一个密码子。
表2从杂交瘤PCR扩增抗体mRNA的引物

VL＝可变轻链VH＝可变重链
1.2抗体基因克隆到表达载体中根据标准的方法进行所有质粒的操作(Sambrook等，MolecularCloning，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)。所有的植物表达用载体在植物启动子后都含有来源于玉米γ玉米醇溶蛋白基因的19个氨基酸内质网转运肽(SS)[MRVLLVALALLALAASATS](SEQ ID NO.28)及紧邻CaMV 35S终止子序列前的玉米磷酸烯醇丙酮酸羧化酶内含子#9(Hudspeth和Grula，Plant Mol.Biol.，12579-592，1989)。在5’非翻译前导区中，所有的构建体都含有植物共有翻译序列ACC ATC AG。
1.3农杆菌属(Agrobacterium)双元载体为了进行农杆菌属(Agrobacterium)接种，在双元载体pNOV2117的T-DNA边界之间克隆重链和轻链盒子。pNOV2117含有玉米遍在蛋白启动子驱动的植物可表达的pmi基因用于在甘露糖上筛选(Negrotto等，Plant Cell Rpts.，19798-803，2000)。
在与来源于pNOV2117的9，172bp HindIII/Acc65I片段的三方连接中构建所有的双元表达克隆。质粒pTMR108含有受γ玉米醇溶蛋白启动子控制的带有内质网保留信号的重链和轻链。通过连接来源于pTMR110的1613bp HindIII/MluI片段和来源于pTMR142的2281bpMluI/Acc65I片段与上述pNOV2117载体制备pTMR108。质粒pTMR110与pTMR108的差异只在于其不存在内质网保留信号。由来源于pTMR104的1597bp HindIII/MluI片段和来源于pTMR114的2263bpMluI/Acc65I片段与pNOV2117载体连接获得pTMR110。克隆pTMR109含有受遍在蛋白启动子控制的带有内质网保留信号的重链和轻链。通过连接来源于pTMR101的2958bp HindIII/MluI片段和来源于pTMR143的3608bp MluI/Acc65I片段与pNOV2117载体制备pTMR109。克隆pTMR111与pTMR109的差异只在于其不存在内质网保留信号。由来源于pTMR105的2940bp HindIII/MluI片段和来源于pTMR145的3590bp MluI/Acc65I片段与pNOV2117载体连接获得pTMR111。
1.4植物表达盒的植物启动子和终止子序列的克隆PCR扩增的起始质粒是pNOV4097，其含有γ玉米醇溶蛋白启动子，γ玉米醇溶蛋白转运肽，遍在蛋白启动子和终止子序列(PEPCTerm)。用下面的引物5′-acgcgtcgatcatccaggtgcaac-3′(SEQ ID NO.29)和5′-actagtggcgctcgcagcgaga-3′(SEQ ID NO.30)PCR扩增γ玉米醇溶蛋白启动子及γ玉米醇溶蛋白转运肽序列以分别在5’和3’末端引入MluI和SpeI限制位点。746bp PCR产物克隆到pCR2.1TOPO载体中(Invitrogen，Carlsbad，CA)，产生pTA gZpromSS。
相似地，用下面的引物5′-accggttctgttctgcacaaagtgt-3′(SEQID NO.31)和5′-acgcgtttgtacccctggatt-3′(SEQ ID NO.32)PCR扩增PEPCintron 35Sterm以分别在5’和3’末端引入AgeI和MluI限制位点。206bp PCR产物克隆到pCR2.1TOPO载体中产生pTApepc35Sterm。
PCR扩增遍在蛋白启动子的部分片段以引入5’MluI限制位点。保存内部XhoI限制位点。利用下面的引物5′-acgcgtttgcatgcctgcagtg-3′(SEQ ID NO.33)和5′-agtccaacggtggagcggaact-3′(SEQ ID NO.34)扩增741bp的片段。
PCR产物克隆到pCR2.1TOPO载体中产生pTA MluI zmUbi。
1.5轻链表达盒的克隆化学合成编码抗K99抗体的轻链可变和恒定区的序列，该序列具有在玉米中表达的最佳化密码子使用。在FR4的高度保守性KLEIK(sEQID NO.56)基序中，在可变区的5’末端引入SpeI限制位点，在可变区的3’末端引入XhoI限制位点。在恒定区的3’末端添加AgeI限制位点。向恒定区的3’末端添加内质网保留信号(SEKDEL，SEQ ID NO.35)。这个克隆命名为pK99LC。
开发利用了下面的克隆策略植物启动子做为HindIII/BamHI片段引入，γ玉米醇溶蛋白转运肽序列做为BamHI/SpeI片段，可变区做为SpeI/XhoI片段，终止子做为AgeI/MluI片段引入，并且如果期望，通过寡核苷酸置换为PciI/AgeI片段可以移除内质网保留信号。
在第一步中，pUC19的多克隆位点被改变为HindIII-BamHI-SpeI-AgeI-MluI-EcoRI以方便轻链的克隆。带有HindIII/EcoRI交错末端下面退火的寡核苷酸被克隆到pUC19的HindIII/EcoRI位点中以产生克隆pKappa载体5′-agcttggatccactagtaccggtacgcgtg-3′(SEQ ID NO.36)和5′-aattcacgcgtaccggtactagtggatcca-3′(SEQ ID NO.37)。
在下面的三方连接中SpeI/AgeI pK99LC片段，SpeI/MluIpKappa载体和AgeI/MluI pTA pepc35Sterm，向pK99LC添加终止子以构建pK99LC-term。通过连接来源于pK99LC-term的597bpHindIII/PciI片段，72bp PciI/AgeI退火寡核苷酸和来源于pK99LC-term的2841bp AgeI/HindIII片段，从pK99LC-term载体移除内质网保留信号。所获得的质粒命名为pK99LCw/oSEKDEL-term。退火下面的寡核苷酸以制备72bp PciI/AgeI片段5′-catgtgaggccacccacaagacctccacctccccaatcgtgaagagcttcaaccgcaacgagtgctgataga-3′(SEQ ID NO.38)5′-ccggtctatcagcactcgttgcggttgaagctcttcacgattggggaggtggaggtcttgtgggtggcctca-3′(SEQ ID NO.39)。
1.6重链表达盒的克隆化学合成编码来源于抗K99抗体的重链可变区和来源于小鼠IgG1共有序列的重链恒定区的序列(Kabat等，U.S.Dept Health andHuman Services，U.S.Government Printing Offices 1987)，该序列具有在玉米中表达的最佳化密码子使用。在可变区的5’末端引入SpeI限制位点，在对应于氨基酸9的CH1结构域中引入AccI限制位点。该序列不包含内质网保留信号。该克隆命名为pK99HC。
开发利用了下面的克隆策略植物启动子做为MluI/BamHI片段克隆，γ玉米醇溶蛋白转运肽序列做为BamHI/SpeI片段，可变区做为SpeI/AccI片段，终止子做为SacI/Acc65I片段克隆，内质网信号序列做为XmaI/SacI寡核苷酸添加。
在第一步中，pUC19的多克隆位点被改变为HindIII-MluI-BamHI-SpeI-SacI-Acc65I-EcoRI以方便重链的克隆。
利用下面退火的寡核苷酸5′-agcttacgcgtggatccactagtgagctcggtaccg-3′(SEQ ID NO.40)和5′-aattcggtaccgagctcactagtggatccacgcgta-3′(SEQ ID NO.41)，带有HindIII/EcoRI交错末端的该退火的寡核苷酸被克隆到pUC19载体的HindIII/EcoRI位点中以产生克隆pIgG1载体。
然后，通过来源于pK99HC的SpeI/XmaI片段，XmaI/HindIII退火的寡核苷酸和SpeI/HindIII pIgG1载体的三方连接，在恒定区的3’末端引入内质网保留信号。该克隆命名为具有SEKDEL(SEQ ID NO.35)的pK99HC。退火下面的引物以形成5′XmaI-3′HindIII片段，其在3’-末端含有内部SacI限制位点5′-ccgggcaagtccgagaaggacgagctgtgataggagctcaaggtaccgaattca-3′(SEQ ID NO.42)和5′-agcttgaattcggtaccttgagctcctatcacagctcgtccttctcggacttgc-3′(SEQ ID NO.43)。在如下的三方连接中SpeI/SacI pK99HC，SacI/Acc65I pNOV3402(term)+SpeI/Acc65I pIgG1载体，向pK99HC添加终止子。该克隆命名为pK99HC-term。
1.7轻链植物表达载体质粒pTMR100含有受γ玉米醇溶蛋白启动子控制的具有内质网保留信号的轻链。来源于克隆pTA-γ玉米醇溶蛋白SS的777bpHindIII/SpeI片段含有γ玉米醇溶蛋白启动子和γ玉米醇溶蛋白信号序列，将该片段克隆到来源于pK99LCterm的3516bp HindIII/SpeI片段的相应位点中。克隆pTMR104由于缺少内质网保留信号而不同于pTMR100。由来源于pTA-γ玉米醇溶蛋白SS的777bp HindIII/SpeI片段连接到来源于pK99LCw/oSEKDELterm的3498bp片段的相应位点中产生pTMR104。
质粒pTMR101含有受遍在蛋白启动子控制的具有内质网保留信号的轻链。pNOV2117的2004bp HindIII/BamHI片段含有玉米遍在蛋白启动子，将该片段与来源于克隆pTMR100的3576bp HindIII/BamHI片段连接。质粒pTMR105由于缺少内质网保留信号不同于pTMR101。由来源于克隆pTMR101的4706bp SpeI/MluI片段与来源于pK99HCw/oSEKDELterm的857bp SpeI/MluI片段的连接产生pTMR105。
1.8重链植物表达载体质粒pTMR142和pTMR144含有受玉米γ玉米醇溶蛋白启动子控制的抗K99的可变区和重链恒定区，而克隆pTMR143和pTMR145含有受遍在蛋白启动子控制的抗K99的可变区和恒定区。此外，pTMR143和pTMR145都包含内质网保留信号。
通过将包含γ玉米醇溶蛋白启动子和γ玉米醇溶蛋白信号序列、来源于质粒pTA-γ玉米醇溶蛋白SS的740bp MluI/SpeI片段连接到4174bp pK99HC-term载体的相应位点中制备质粒pTMR144。质粒pTMR142只是在含有另外内质网保留信号的恒定区3’末端不同于pTMR144。通过连接来源于pTMR144的3581bp SpeI/SacI片段和来源于pK99HC的1348bp SpeI/SacI片段制备该克隆。
通过连接来源于pTMR144的4230bp MluI/BamHI片段，来源于pTA-MluI zmUbi、含有遍在蛋白启动子5’区的709bp MluI/XhoI片段和来源于pNOV2115、含有启动子3’区的1298bp XhoI/BamHI片段制备质粒pTMR145。克隆pTMR143只是在含有另外内质网保留信号的恒定区3’末端不同于pTMR145。通过将pTMR145的4908bp SpeI/SacI片段装配到来源于具有SEKDEL的pK99HC的1348bp SpeI/SacI片段的相应位点中构建该克隆。在表3中给出了各种载体的概述。
表3表达构建体

1.9植物中的转化和表达利用正常的细胞加工，在植物中表达和装配两种独立的抗体链或抗体结构域。抗体蛋白质或者靶向植物质外体，或者在构建体具有ER保留信号的情况下，靶向植物细胞内的细胞器。以前描述了羧基末端前肽形式的液泡导向序列(Muntz，Plant Mol.Biol.，3877-99，1998；Neuhaus等，Plant Mol.Biol.，38127-144，1998)。
1.10农杆菌属(Agrobacterium)介导的玉米转化基本如Negrotto等，Plant Cell Reports 19798，2000中所述，进行未成熟玉米胚的转化。对于这个实施例，所有培养基组分都如上文Negrotto等所述。然而，可以置换该文献中所述各种培养基组分。
1.10.1转化质粒和选择性标记用于转化的基因被克隆到适于玉米转化的载体中。在该实施例中所用的载体含有用于转基因系筛选的磷酸甘露糖异构酶(PMI)基因(Negrotto等，见上文)。可以在图2中发现用于农杆菌属(Agrovacterium)转化的载体的说明。
1.10.2根瘤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的制备在28℃，在YEP(酵母提取物(5g/L)，胨(10g/L)，NaCl(5g/L)，15g/l琼脂，pH 6.8)固体培养基上培养含有植物转化质粒的农杆菌属(Agrobacterium)株系LBA4404(pSB1)2-4天。在补加有100μM As的LS-inf培养基中悬浮约0.8×109个农杆菌(Negrotto等，上文)。在该培养基中预先诱导细菌30-60分钟。
1.10.3接种从8-12天龄穗切下来源于A188或其它适合的基因型的未成熟胚，放入液体LS-inf+100μM As中。用新鲜的感染培养基漂洗胚一次。然后添加农杆菌溶液，并且涡旋胚30秒，使得其与细菌共同放置5分钟。然后将小盾片侧向上，将胚转移到LS-inf+100μM As培养基中，并且在黑暗下培养2到3天。随后，每个培养皿中20和25个之间的胚被转移到补加有头孢噻肟(250mg/l)和硝酸银(1.6mg/l)的LSDc培养基上(Negrotto等，上文)，并且在28℃，在黑暗中培养10天。
1.10.4转化细胞的筛选和转化植物的再生产生胚发生愈伤组织的未成熟胚被转移到LSD1M0.5S培养基上(Negrotto等，上文)。在该培养基上筛选培养物6周，同时在3周进行继代培养步骤。存活的愈伤组织被转移到补加有甘露糖的Reg1培养基上(Negrotto等，上文)。在光下(16小时光/8小时黑暗的方案)培养后，然后将绿色组织转移到没有生长调节剂的Reg2培养基上(Negrotto等，上文)，并且温育1-2周。将小植物转移到含有Reg3培养基(Negrotto等，上文)的Magenta GA-7盒子(Magenta Corp，Chicago IL.)中，并且在光下生长。2-3周后，通过PCR检测植物中PMI基因和其它目的基因的存在。将PCR检测的阳性植物转移到温室。
1.11水稻转化水稻Oryza sativa L.japonica cv.Taipei 309用于转基因植物的产生。愈伤组织诱导，细胞悬浮液的起始和维持按照Zhang，PlantCell Rpt.，1568，1995先前描述的方法。在以前继代培养后3-5天对愈伤组织或悬浮细胞进行粒子轰击，或进行农杆菌属(Agrobacterium)介导的转化。在轰击前，将直径在1mm和3mm之间的愈伤组织或悬浮细胞簇放置在NBO渗透培养基上4小时。轰击后16到20小时，将组织从NBO培养基转移到含有25g/l甘露糖和5g/l蔗糖的改进的NB选择培养基上。另外的30-40天后，然后将新形成的愈伤组织转移到PR预先再生培养基，黑暗下培养7天。然后在16小时光周期下，将生长中的愈伤组织在RN再生培养基上继代培养14-21天的期间。先前已经描述了培养基的组成(Chen等，Plant Cell Rpt.，1825，1998)。
用其上沉淀有质粒混合物的金微粒轰击组织。玉米遍在蛋白启动子控制下的磷酸甘露糖异构酶基因用做选择性标记。如Chen等，Nature Biotech.，161060，1998所述，用摩尔比率1∶6∶6的选择性标记质粒DNA与pTMR101和pTMR143或者与pTMR105和pTMR145质粒DNAs一起进行共转化试验。1μg总的混合DNA用于靶平板。根据Zhang等，Molec.Breeding，4551，1998和Chen等，Plant Cell Rpt.，1825，1998，利用Biolistic PDS-1000系统(Bio-Rad.Hercules，CA)获得基因的包被和转移。每组构建体获得总的50个转化的愈伤组织。
1.12水稻愈伤组织的蛋白质提取和表达分析在液氮中冷冻水稻细胞，用Teflon手工研磨器，在1.5mlmicrofuge管中将其研磨成细粉，在植物蛋白酶抑制剂混合物(Sigma，St.Louis，MO，Cat#P9599)存在的情况下，用提取缓冲液(EB10mMTris 7.5，100mM NaCl，5mM EDTA)涡旋，并且放置在冰上。每毫克水稻愈伤组织使用1.8μl EB缓冲液，并且每100μl EB缓冲液使用2μl蛋白酶抑制剂。
根据制造商的用于蛋白质测定的说明书使用Bradford方法(Bio-Rad，Hercules，CA)。利用预制4-12％(w/v)凝胶(NuPage，Invitrogen)，对等量的蛋白质(40μg/条带)及Mr标准(BenchMark，Invitrogen，Carlsbad，CA)进行SDS-PAGE。小鼠IgG1(LampireBiological Laboratories，Pipersville，PA)用做标准。将凝胶电印迹到硝酸纤维素膜(Invitrogen)上，并且用Ponceau S染色以观察转移。在室温1小时或在4℃过夜，在包含TTBS(20mM Tris 7.5；100mMNaCl；0.1％TWEEN-20)中10％(w/v)脱脂奶粉的封闭溶液中温育印迹。用TTBS缓冲液漂洗后，添加浓度为1μg/ml的兔抗小鼠抗体(ZymedLaboratories，South San Francisco，CA，Cat&#；61-6500)，并且温育1小时。在TTBS中进行3次，10分钟的洗涤后，膜与0.2μg/ml碱性磷酸酶缀合的山羊抗兔抗体(Zymed Laboratories，Cat#656122)温育。如上所述进一步洗涤印迹，并且利用碱性底物(Promega，Madison，WI)检测免疫标记的蛋白质。
变性条件下的分离表明植物来源的抗K99抗体的亚基大小与杂交瘤上清液中存在的抗体亚基大小相同。还原条件下获得的结果(图3)表明对应于轻链和重链之间装配的中间体的各种大小条带的累积。
1.13抗原结合测定法用ELISA测定法检测装配的抗体对K99抗原的结合能力(参见实施例2.13)。在表4a中给出了结果，并且表明来源于表达重链和轻链的植物的提取物与抗原反应。
表4a转基因水稻愈伤组织上抗原结合的ELISA测定。在PBS缓冲液中2％牛奶中以1∶2稀释样品。用K99抗原敏化平板，并且牛奶用做封闭剂。

1.14水稻愈伤组织的表达用含有4种不同构建体pTMR147，pTMR149，pTMR156和pTMR160的农杆菌转化水稻愈伤组织。在几种独立的转基因株系中回收转基因愈伤组织，并且用酶联免疫吸附测定法(ELISA)和使用免疫印迹分析抗体表达。ELISA分析表明转基因水稻愈伤组织表达功能性抗体，并且表达范围在大约200到1200ng/mg TSP之间(表4b)。
在图26中示出了来源于水稻愈伤组织Western印迹的典型结果。在非还原和还原条件下，在非转基因水稻愈伤组织的Western印迹上没有条带出现。在图26A中示出了还原条件下的结果。在约50和25kDa出现了两条主要的条带，并且该条带显示了与从杂交瘤细胞纯化的相应抗体条带相似的大小。上方的的条带鉴定为重链；下方的表达鉴定为轻链。
表4b在用4种不同构建体转化的水稻愈伤组织中，通过ELISA测定的抗K99的表达水平。用兔抗小鼠IgG-κ(L+Fc)或用兔抗小鼠IgG1(HL+Fc)包被微量培养板。在所有情况下，用碱性磷酸酶缀合的兔抗小鼠IgG(Fc特异的)展示结合。对于定量ELISA，每个孔加样2μg愈伤组织提取物。TSP总的可溶蛋白。

实施例2K88抗体2.1杂交瘤细胞系的表征从Rural Technologies(University of South Dakota，Vermillion，SD)获得所有含有抗K88抗体的杂交瘤细胞系。杂交瘤17/44，7/46和36/41分别具有抗K88(F4)C结构域，K88(F4)Va结构域和K88(F4)Va结构域的特异性(Sun等，Infection andImmunity，683509-3515，2000)。
2.1.1杂交瘤培养在补加有1％L-谷氨酰胺，1％青霉素/链霉素(10,000U/ml)和15％胎儿牛血清(FBS)的RPMI-1640培养基中培养杂交瘤细胞系，其中从Invitrogen，Carlsbad，CA获得所有这些材料。在37℃，在95％空气和5％CO2的湿润环境中培养细胞。对于通过有限稀释的亚克隆，用台盼蓝排除法测定生存的细胞浓度，并且在培养基中将细胞稀释到0.5-1.0×106细胞/ml的浓度。从此，进行两次另外的10倍稀释，并且每次稀释都被分配到含有巨噬细胞饲养层的2个96孔板上(100μl/孔)。通过进行两只BALB/c小鼠的腹腔灌洗和向6个96孔板的每个孔添加100μl收集的液体提前一天制备饲养层。约10天后，从每孔只含有一个集落的孔收集上清液，并且检测与适合抗原的反应性。
2.1.2 ELISA利用ELISA鉴定由杂交瘤产生的抗体。在96孔微量滴定板(Immunol IV；Dynex，Franklin，MA)中进行ELISA测定。用在碳酸盐包被缓冲液(0.15M碳酸钠，0.35M碳酸氢钠，0.03M叠氮化钠，pH9.6)中1∶50稀释的抗原包被孔，并且在4℃温度过夜温育。洗涤包被的板，并且在添加单克隆抗体前，用1％聚乙烯醇(PVA)在37℃封闭该板1小时。该测定中使用的所有试剂都在PBS+0.1％Tween 20(PBST)中稀释，并且每次温育步骤后，都用该缓冲液洗涤孔。封闭和洗涤后，以1∶1000的稀释度添加抗体，并且允许在37℃温育1小时。通过3次洗涤步骤移除过量的抗体，并且在添加次级抗体前封闭孔。在37℃，添加1∶10,000稀释度的辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗小鼠免疫球蛋白(Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.，West Grove，PA)1小时。洗涤后，添加酶底物3，3′，5，5′-四甲基联苯胺。通过添加1M硫酸终止反应，并且利用BioRad Microplate reader，Model3550，在450nm波长阅读光密度。
做为可替代的方案，用50μl带有质粒987P，K99或F41的大肠杆菌(E.coli)加样96孔板。在基本培养基中培养细菌，达到0.7OD600的浓度。在4℃过夜温育该板。第二天，用PBS洗涤板3次。然后，在37℃，用300μl PBS中10％脱脂奶封闭该板1小时。用PBS/Tween20(0.05％)洗涤该板3次，用PBS洗涤3次。向该板添加50μl PBS中2％脱脂奶。向ELISA板每个孔添加来源于每种杂交瘤的50μl上清液。在振荡器中，在室温下温育抗原-抗体反应1小时。用PBS/Tween20(0.05％)洗涤该板3次，用PBS洗涤3次。向每个孔添加在PBS中2％脱脂奶中稀释的50μl 1∶1000稀释度的缀合HRPO的抗小鼠IgG，并且在振荡器中，在室温下温育1小时。用PBS/Tween20(0.05％)洗涤该板3次，用PBS洗涤3次。向每个孔添加50μl ABTS。当显现颜色时，利用50μl 1％SDS终止反应。在405nm读取OD。
2.1.3Western印迹在12％聚丙烯酰胺凝胶(Gibco，Invitrogen，Carlsbad，CA)上检测提取的菌毛(伞毛)纯度。简而言之，在SDS样品缓冲液中煮沸抗原制备物，并且加样到积层凝胶中。通过在100V下电泳1.5hr分离蛋白条带。利用考马斯亮蓝染色观察凝胶上的条带。对于Western印迹，利用湿转移方法(BioRad，Hercules，CA)，将聚丙烯酰胺凝胶中的蛋白质转移到PVDF膜上。在4℃，60V下进行转移2小时。转移完成后，在PBS中洗涤硝酸纤维素膜，并且在4℃，在1％PVA中过夜封闭该膜。封闭后，在室温温度下，膜与抗体温育1小时。在PBST中制备抗体的稀释物。然后封闭和再次洗涤膜，然后在室温下，以1∶10,000稀释度添加HRP缀合的山羊抗小鼠检测抗体1小时。利用ECL Western印迹检测试剂(Amersham Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ)，在X射线胶片上观察膜中抗体-抗原反应。
2.1.4结果已报道杂交瘤17/44结合来源于K88的菌毛保守性结构域，报道7/46和36/41结合可变结构域“c”。扩大了这些杂交瘤细胞系，并且在ELISA和Western印迹中检测了上清液抗K88的反应性。这些测定的结果表明来源于杂交瘤17/44和7/46的上清液与K88反应。亚克隆这些细胞系以制备mRNA提取物和随后PCR克隆编码VH和VL区的基因。来源于杂交瘤细胞系36/41的上清液在ELISA测定中显示了最好的阳性反应性，并且选定该细胞系用于进一步亚克隆。利用ELISA筛选每种杂交瘤细胞系的约20-30个亚克隆的K88反应性。在这些克隆中，基于高OD和生存力/生长特性，选定来源于每种细胞系的3个克隆。如下进行这些亚克隆的扩增从96孔板取出来源于每个孔的细胞，并且转移到24孔板的孔中。在补加有L-谷氨酰胺和1％青霉素/链霉素的RPMI-1640+15％FCS中培养亚克隆3到6天。进行新的ELISA，并且证实所有的亚克隆都是阳性的。利用25cc烧瓶，接着用75cc烧瓶进一步扩充亚克隆K88-7/463和9；K88-17/446和33；K88-36/411和23。当细胞生长足够时，收集杂交瘤细胞，并且在含有8％DMSO的培养基中重悬浮，并且在液氮中冷冻。
2.2通过PCR克隆抗体基因所用的方法与实施例1.1中的方法相同，但是有下面的改变。所用的杂交瘤细胞系是36/41，7/46，17/44。为了从杂交瘤36/41克隆K88，使用下面的引物用于轻链的是MLALT2(SEQ ID NO.19)和33615(SEQ ID NO.25)，用于重链的是MVG1R(SEQ ID NO.26)和MH1(SEQID NO.23)。为了从杂交瘤7/46克隆K88，使用下面的引物用于轻链的是MLALT2(SEQ ID NO.19)和33615(SEQ ID NO.25)，用于重链的是MH2(SEQ ID NO.24)和MVG1R(SEQ ID NO.26)或MVG2R(SEQID NO.27)。为了从杂交瘤17/44克隆K88抗体，使用引物MH2(SEQID NO.24)和MVG1R(SEQ ID NO.26)克隆重链。通过利用5′RACE试剂盒(Clonetech)，利用下面引物33615(SEQ ID NO.25)和5′PCR引物IIA(5′-aagcagtggtatcaacgcagagt-3′，SEQ ID NO.44)克隆轻链，该引物IIA可与SMART IIA 引物(5′-aagcagtggtatcaacgcagagtacgcggg-3′，SEQ ID NO.45)退火。在cDNA合成反应期间，后一引物连接到cDNA的5’末端。使用下面的参数进行5’RACE反应利用添加到2μl 5×第一链缓冲液中的3μl来源于杂交瘤细胞17/44的总RNA和1μl 33615引物(SEQ ID NO.25)(10μM)，1μl Smart IIA引物(SEQ ID NO.45)(10μM)，1μl DTT(20mM)，1μl dNTP(10μM)，1μl SuperscriptII(200u/μl)和10μl TE缓冲液(10mM TrisCl，1mM EDTA，pH 7.4)进行第一链合成反应。在72℃温育2分钟后，短时放置在冰上，在42℃进行反应1小时。对于PCR反应，反应混合物含有1μl第一链DNA，5μl 10X Taq缓冲液，1.5μlMgCl2(50mM)，1μl dNTPs(10μM)，1μl 5′PCR引物IIA(SEQ ID NO.44)(10μM)，1μl引物33615(SEQ ID NO.25)(10μM)，37.5μl dH2O，和1μl Taq聚合酶(5U/μl)。在94℃保持PCR反应混合物5分钟，接着在94℃，30秒；45℃，30秒；72℃，1分钟进行28轮循环。
2.3K88抗体基因的克隆克隆3种抗K88的抗体，抗体7/46，17/44和36/41。用下面的反向引物(K99HC-3′aagtagacagatgggggtgtcg SEQ ID NO.46)克隆重链可变区。对于每种抗体，正向引物是变化的，并且如下抗体7/46K88_746_VAR H5′gccactagtgaagtgaagcttgaggag(SEQ ID NO.47)；抗体17/44K88_1744_VAR_H5′gccactagtgatgtgcagctggtgga(SEQID NO.48)；抗体36/41K88_3641_VAR_H5′gccactagtgaggtccagctgcagcag(SEQ ID NO.49)。
用下面的成套引物进行轻链可变区的扩增抗体7/46K88_746_VAR_L5 ccactagtgaaattgtgctcacccag(SEQ ID NO.50)和K88_746_VAR_L3 ttatctcgagctttgtccccgagccgaa(SEQ ID NO.51)。对于抗体36/41K88_3641_VAR_L5 gccactagtgaaaatgtgctcacccag(SEQ ID NO.52)和K88_3641_VAR_L3 ttatctcgagcttggtgcctccaccgaa(SEQ ID NO.53)。对于抗体17/44K88_1744_VAR_L5gccactagtgacattgtgatgtcacag(SEQ ID NO.54)和K88_1744_VAR_L3ttatctcgagcttggtcccagcaccgaacg(SEQ ID NO.55)。
来源于抗体36/41的轻链和重链可变区克隆到载体pCR2.1-TOPO中分别产生了pTMR524和pTMR525。来源于抗体7/46的轻链和重链可变区克隆到载体pCR2.1-TOPO中分别产生了pTMR526和pTMR527。来源于抗体17/44的轻链和重链可变区克隆到载体pCR2.1-TOPO分别产生了pTMR528和pTMR529。
2.4抗体基因克隆到表达载体中所用的方法与实施例1.2中所述的方法相同。
2.5农杆菌属(Agrobacterium)双元载体为了进行农杆菌(Agrobacterium)接种，在双元载体pNOV2117的T-DNA边界之间克隆重链和轻链盒子。pNOV2117含有玉米遍在蛋白启动子驱动的植物可表达的pmi基因用于在甘露糖上筛选(Negrotto等，Plant Cell Rpts.，19798-803，2000)。在表5中所报道的与来源于pNOV2117的9，172bp HindIII/Acc65I的三方连接中构建含有遍在蛋白和/或γ玉米醇溶蛋白启动子的双元表达克隆。在表5中所详述的与来源于pNOV2117的9，172bp HindIII/Acc65I的三方或四方连接中克隆含有CMPS启动子和CMPS/遍在蛋白启动子组合的构建体。
2.6植物表达盒的植物启动子和终止子序列的克隆如1.4部分所述克隆所有的元件。从质粒pNOV4211分离做为404bpBamHI片段的CMPS启动子(参见公开的国际专利申请号WO01/73087；特别是SEQ ID NO3和实施例14)。该片段被克隆到载体pBluescript中，并且筛选方向。用EcoRI/BamHI消化所得到的质粒pBS_CMPS，并且CMPS启动子片段被克隆到pCR2.1-TOPO中。所得到的质粒pTMR570用于将启动子克隆到pUC表达盒中。
2.7轻链表达盒的克隆化学合成编码来源于抗K88单克隆抗体，36-417-46和17-44的轻链可变区的序列，该序列具有在玉米中表达的最佳密码子使用。在可变区的5’末端引入SpeI限制位点，在FR4的高度保守性KLEIK(SEQ IDNO.56)基序中，在可变区的3’末端引入XhoI限制位点。在与来源于pTMT100，pTMR101和pTMR104(参见表5)的K99表达盒片段HindIII/XhoI和HindIII/SpeI的三方连接中克隆SpeI/XhoI K88 VL结构域片段。如表5中所述，CMPS启动子被克隆到K88 36-41表达盒中。
2.8重链表达盒的克隆化学合成编码来源于抗K88抗体的重链可变区和来源于小鼠IgG1共有序列的重链恒定区的序列(SEQ ID NO.57)(Kabat等，U.S.Dept Health and Human Services，U.S.Government PrintingOffices 1987)，该序列具有在玉米中表达的最佳化密码子使用。在可变区的5’末端引入SpeI限制位点，在对应于氨基酸9的CH1结构域中引入AccI限制位点。在利用来源于pTMR142，pTMR143和pTMR144(参见表5)的K99表达盒片段AccI/HindIII和HindIII/SpeI的三方连接中克隆SpeI/AccI K88 VH结构域片段。如表5中所述，CMPS启动子被克隆到36-41表达盒中。
表5含有K88抗体元件的构建体






SEKDEL允许ER保留的C-末端基序；MSMS。
天然从杂交瘤细胞克隆的原始序列；当不特别说明时，抗体序列是经用于在植物中表达而密码子优化的。所有密码子优化的序列都含有g-玉米醇溶蛋白信号序列。从玉米(Zea mays)分离遍在蛋白和g-玉米醇溶蛋白启动子。从夜香树属黄叶卷曲病毒分离CMPS启动子。
2.9植物中的转化和表达利用正常的细胞加工，在植物中表达和装配两种独立的抗体链或抗体结构域。抗体蛋白质或者靶向植物质外体，或者在构建体具有ER保留信号的情况下，靶向植物细胞内的细胞器。本领域已知羧基末端前肽形式的液泡导向序列(Muntz，Plant Mol.Biol.，3877-99，1998；Neuhaus和Rogers等，Plant Mol.Biol.，38127-144，1998)。
2.10农杆菌属(Agrobacterium)介导的玉米转化基本如Negrotto等，Plant Cell Reports 19798，2000中所述，进行未成熟玉米胚的转化。对于这个实施例，所有培养基组分都如上文Negrotto等所述。
用于转化的基因被克隆到适于玉米转化的载体中。在该实施例中所用的载体含有用于转基因系筛选的磷酸甘露糖异构酶(PMI)基因(Negrotto等，上文)。
产生胚发生愈伤组织的未成熟胚被转移到再生培养基，并且在光下生长。2-3周后，用PCR检测植物中PMI和其它目的基因的存在。来源于PCR测定的阳性植物被转移到温室中。
再生表达pTMR554，555，556和557(表5)的转基因玉米植物。在V4-V6阶段的几种独立转基因玉米系中通过酶联免疫吸附测定法(ELISA，参见实施例2.13)及通过免疫印迹分析抗体表达。ELISA分析表明转基因玉米植物表达功能性抗体，并且表达范围在约0.02到2％的总可溶蛋白(TSP)(表6)。
进行ELISA测定以检测装配的抗体对K88抗原的结合能力。在表6中给出了结果，该结果表明来源于表达重链和轻链的植物的提取物与抗原反应。通过ELISA测定的功能性抗体水平达到所产生的总抗体分子的88％。
图4中表示来源于表达抗K88抗体的转基因玉米植物的Western印迹的典型结果。在非还原和还原条件下，非转基因玉米植物在Western印迹上没有条带出现。图4A中示出了在还原条件下的结果。在约50和25kDa出现了两条主要的条带，并且该条带显示了与从杂交瘤细胞纯化的相应抗体条带相似的大小。利用一系列不同的检测抗体，上方的的条带被鉴定为重链；下方的表达被鉴定为轻链。
所有单独的克隆都产生了约150kDa的条带，在非还原条件下，该条带与对照抗体的主要条带共迁移。这个大小最可能代表完全装配的抗体。在非还原条件下，从杂交瘤细胞纯化的小鼠抗体产生了3条条带。在植物提取物中也出现了分子量在50和135kDa之间的几条其它主要条带。一系列探针用于植物提取物的Western印迹以鉴定抗体片段。在非还原条件下150kDa条带与抗Fc和抗κ探针结合，表明这些分子具有完整抗体的成分。有趣地，对于含有ER保留信号的抗体分子，条带的模式看起来不同。并且，该模式在抗体之间变化。
在向来源于非转基因植物的玉米植物提取物中添加从杂交瘤细胞纯化的单克隆抗体后，相对于未处理的IgG1，没有额外的条带产生。这些观察结果表明Western印迹后所观察到的条带模式不是由于组织研磨和提取引起蛋白质降解而产生的。
通过表面等离子体共振证实了植物产生的抗体的结合。用大肠杆菌(E.coli)株系K88的菌毛包被CM5-rg传感芯片的葡聚糖基质，并且表面稳定化后，注射来源于玉米叶片的蛋白质提取物，该玉米叶片表达有或无ER保留信号的构建体。相似地，注射从杂交瘤细胞纯化的抗体。在所有情况下观察结合。在缺少菌毛的对照表面上或者使用来源于非转化对照植物的提取物时，没有检测到结合。比较植物产生的纯化抗体与杂交瘤产生的单克隆抗体的功能性。在杂交瘤和植物产生的蛋白质之间观察到了几乎相同的热力学(即，KD0.03nM)和动力学模式(profiles)。
从植物材料纯化的单克隆抗体显示了与从鼠杂交瘤材料分离的天然IgG1分子相同的对K88抗原的亲和性。只从植物材料纯化了和通过表面等离子体实验分析了3种植物产生的抗体中2种抗体，36/41和17/44。如这里所述，从玉米植物材料提取和纯化植物产生的抗体。抗体36/41以与杂交瘤产生的抗体几乎相同的动力学特征结合K88表面(图5)。对于抗体17/44获得了相似的结果。
表6 T0玉米植物中K88抗体的表达从含有K88抗体基因的年幼玉米小植物分离总的可溶蛋白质，该K88抗体保留在ER(pTMR554，事件11114)中或靶向质外体(pTMR555，事件11115)。通过ELISA，利用兔抗小鼠IgG1定量整个抗体和功能性抗体的水平，并且表示为总的可溶蛋白质百分数。

2.11农杆菌(Agrobacterium)介导的水稻愈伤组织转化水稻(Oryza sativa var.japonica)栽培品种“Kaybonnet”用于产生转基因植物。然而，也可以使用其它的水稻栽培品种(Hiei等，Plant J.，6271-282，1994；Dong等，Mol.Breeding，2267-276，1996；Hiei等，Plant Mol.Biol.，35205-218，1997)。而且，可以在量上改变或置换下述各种培养基成分。通过在MS-CIM培养基(MS基本盐，4.3g/l；B5维生素(200×)，5ml/l；蔗糖，30g/l；脯氨酸，500mg/l；谷氨酰胺，500mg/l；酪蛋白水解物，300mg/l；2，4-D(1mg/ml)，2ml/l；用NaHO将pH调整到5.8；Phytagel，3g/l)上培养，从成熟胚建立胚发生培养物。用含有期望载体构建体的农杆属(Agrobacterium)株系LBA4404(Cangelosi等，Meth.Enzymol.，204384，1991)接种和共培养建立的培养系。在28℃，在固体2YT培养基(16g细菌-胰蛋白胨，10g细菌-酵母提取物，5gNaCl)(100mg/l壮观霉素)上培养来源于甘油贮存培养物的农杆菌(Agrobacterium)3天，然后再次划线和培养1-2天。在液体MS-CIM培养基中重悬浮衣杆菌(Agrobacterium)。农杆菌(Agrobacterium)培养物被稀释到0.2-0.3 OD600，并且添加终浓度是200μM的乙酰丁香酮。在溶液与水稻培养物混合前，用乙酰丁香酮诱导农杆菌(Agrobacterium)至少30分钟。为了接种，培养物浸入到细菌悬浮液中30分钟。用真空抽吸器移除液体悬浮液，并且接种的培养物放置在共培养培养基MS-CIM-As(含有200μM乙酰丁香酮的MSB-CIM)上的Whatman滤纸上，并且在22℃温育2天。然后，将培养物转移到含有Timentin(400mg/l)的MS-CIM培养基上以抑制农杆菌(Agrobacterium)的生长。对于利用了PMI选择性标记基因的构建体，7天后将培养物转移到含有甘露糖做为碳水化合物源的筛选培养基(含有2％甘露糖，300mg/l Timentin的MS)，并且在黑暗下培养约21天。然后，将抗性集落转移到再生诱导培养基(没有2，4-二氯苯氧基乙酸的MS，0.5mg/lIAA，1mg/l玉米素，200mg/l timentin，2％甘露糖和3％山梨糖醇)上，并且在黑暗下生长14天。然后，将增殖中的集落转移到另一轮再生诱导培养基上，并且移到光生长室中。再生的小苗转移到GA7-1培养基(没有激素和2％山梨糖醇的MS[Murashige和Skoog，PlantPhysiol.，15473-497，1962])上2周，然后当它们足够大和具有充足的根时，它们被移到温室中。植物被移到温室土壤中，并且生长直到成熟。
获得了几个转基因植物。通过几个独立的转基因水稻植物的酶联免疫吸附测定法(ELISA)和免疫印迹法(参见实施例2.13)分析抗体表达。ELISA分析表明转基因植物表达功能性抗体(表7a，7b&7c)。ELISA所测定的功能性抗体水平达到靶向质外体或存留在ER中的总抗体分子的50％。
表7a T0玉米和水稻植物中K88抗体基因的表达。
从含有K88抗体基因的玉米和水稻植物分离总的可溶蛋白质，该K88抗体保留在ER(pTMR554，事件11114；pTMR546，事件11110)中或靶向质外体(pTMR555，事件11115；pTMR547，事件11111)。通过ELISA，利用兔抗小鼠IgG1定量整个抗体和功能性抗体的水平，并且表示为总可溶蛋白质的百分数。

表7b玉米种子中K88抗体基因的表达。
从含有K88抗体基因的玉米种子分离总的可溶蛋白质，该K88抗体保留在ER(pTMR554，事件11114)中或靶向质外体(pTMR555，事件11115)。通过ELISA，利用兔抗小鼠IgG1定量整个抗体和功能性抗体的水平，并且表示为总可溶蛋白质的百分数。

表7c水稻愈伤组织中K88抗体基因的表达。
从含有K88抗体基因的稳定转化的水稻愈伤组织分离总的可溶蛋白质，该K88抗体保留在ER(pTMR568事件11114；pTMR167，pTMR169，pTMR171)中或靶向质外体(pTMR569事件11115；pTMR168，pTMR170，pTMR172)，或者轻链保留在ER中，重链靶向外质体(pTMR198)，或者反之(pTMR199)。通过ELISA，利用兔抗小鼠IgG1定量整个抗体和功能性抗体的水平，并且表示为总的可溶蛋白质(TSP)的百分数。所有构建体都含有K8836-41VL和VH结构域。

2.11来源于植物组织的蛋白质提取物从水稻和玉米转基因和非转基因愈伤组织、叶和种子制备可溶蛋白质提取物。收集约7×25mm叶，250mg种子和100mg愈伤组织样品，并且放置在含有1mm玻珠(BioSpec Products，Bartlesville，OK)的96孔板(Corning，Corning，NY)的孔中。该板保持在干冰上。通过修改的往复式锯研磨组织30秒，旋转180°，研磨另外的30秒。添加含有植物蛋白酶抑制剂混合物(Sigma Chemical，St.Louis，MO，Cat#P9599)的冷却蛋白质提取缓冲液(PEB50mM Tris-HCl，100mM KCl，5mM EDTA，0.1％Tween-20，pH 8.0)后，再研磨组织一次，并且在4℃，以4000rpm离心该板10分钟。每mg水稻愈伤组织使用1.8μl含有2％(v/v)蛋白酶抑制剂的PEB缓冲液。做为可替代的方案，也可以在液氮中冷冻组织，用Teflon手工研磨器，在1.5ml管中将其研磨成细粉，与蛋白质提取缓冲液一起涡漩，放置在冰上，并且如上所述进行处理。上清液用于ELISA和Western印迹分析。
2.13表达分析通过酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测植物表达抗体的活性。对于ELISA使用下面的缓冲液ELISA稀释剂(11.9mM Na2HPO4/NaH2PO4，137mM NaCl，2.7mM KCL，0.05％Tween-20，1％BSA，3.3％NaN3，pH7.4)；10x ELISA洗涤缓冲液(100mM Tris，0.5％Tween 20，3.3％NaN3，pH8.0)；封闭缓冲液ELISA稀释剂中5％(w/v)脱脂奶粉；碱性磷酸酶底物(Sigma Fast pNPP，Sigma Chemical，St.Louis，MO，cat#；2770)。
用每孔250ng PBS缓冲液中的抗原包被微量滴定板(NUNC-MaxiSorb，Nalgene Nunc Intl.Rochester，NY)，并且在4℃温育过夜。用200μl封闭缓冲液封闭该板。利用来源于非转化植物的提取物制备系列稀释度的转基因植物提取物。将等份25μl每个稀释的样品转移到抗原包被的板上。以1∶5000稀释度向每个孔添加碱性磷酸酶缀合的IgG Fc特异性兔抗小鼠IgG(Pierce Chemical，RockfordIL，cat.#31332)，接着添加如制造商(Promega，Madison，WI，USA)所确定的50μl对硝基苯磷酸酯。在37℃与底物的反应进行1小时。利用μQuant分光光度计(Bio-Tek Instruments，Inc.，Winooski，VT)，在405nm测定吸收。所有的样品都进行2份。利用Bradford蛋白质测定法(BioRad，Hercules，CA)测定蛋白质浓度。
对于定量ELISA，用50μl PBS缓冲液中10μg/ml兔抗小鼠(H+L)(Zymed Laboratories，So.San Francisco，CA，Cat#61-6500)或用兔抗小鼠IgG-κ(Fizgerald，Concord，MA，cat#41-RM28)包被该板，并且在4℃温育过夜。在室温下封闭包被的板45分钟，之后添加25μl稀释的植物提取物，并且允许在37℃温育该包被的板1.5小时。以ELISA稀释剂中1∶1000稀释度添加缀合碱性磷酸酶的兔抗小鼠IgG(H+L)(Zymed Laboratories，Cat#61-6522)，并且在37℃温育1.5小时。如前述添加底物试剂。用ELISA洗涤缓冲液在每步之间洗涤该板3次。用来源于野生型组织的提取物稀释转基因蛋白质提取物。
对于Western印迹分析，利用预制凝胶4-12％或tris-醋酸盐3-8％(w/v)Nupage凝胶(Invitrogen，Carlsbad，CA)，等量蛋白质和Mr标准(BenchMark，Invitrogen，Carlsbad，CA)进行SDS-PAGE。小鼠IgG1(Lampire Biological Laboratories，Pipersville，PA)或来源于杂交瘤的纯化单克隆抗体做为标准。凝胶电印迹到硝酸纤维素膜(Invitrogen)上，并且用Ponceau S(Sigma Chemical，St Louis，MO)染色以观察转移。在室温，在封闭溶液中温育印迹2小时或者在4℃过夜，该封闭溶液含有TTBS(20mM Tris 7.5；100mM NaCl；0.1％TWEEN-20)中的10％(w/v)脱脂奶粉。通过温育膜和1∶500稀释度的兔抗小鼠H+L(Zymed Laboratories，cat#04-6600)2小时，接着与第二抗体碱性磷酸酶缀合的山羊抗兔(Zymed Laboratories，Cat#656122)(1∶4000)温育，进行整个抗体的检测。通过温育膜与1∶2000稀释度的碱性磷酸酶缀合的抗小鼠Fc(Pierce Chemical，cat#31332)进行Fc片段检测。用1∶200稀释度的大鼠抗小鼠IgG-κ(ZymedLaboratories，cat#04-6600)，接着通过1∶5000稀释度的碱性磷酸酶山羊抗大鼠H+L(Sigma Chemical，cat#A8438)检测轻链片段。如上所述进一步洗涤印迹，并且按照制造商的说明书(Promega，Madison，WI)，利用碱性底物检测免疫标记的蛋白质。
2.14结论上述试验清楚地证明在玉米和水稻植物细胞中获得了完整功能性K88抗体的表达。发现K88抗体重链上含有ER保留信号的构建体具有较低比例错装配的片段(即，较少的二聚体或三聚体)，因此比没有ER保留信号的其它构建体具有更多装配的功能性抗体(参见，表7c，构建体12645对12646)。有趣地，含有ER保留信号的构建体比没有ER保留信号的等同构建体产生了更好水平的装配抗体(参见表7c，并且比较11114对11115，12639对12640，12641对12642)。CMPS和玉米遍在蛋白启动子以不同组合用于表达重链和轻链。具有最高效果抗体表达水平的组合(并且优选这样的组合)是，玉米遍在蛋白启动子驱动重链的表达，同时CMPS启动子驱动轻链的表达，或者CMPS启动子驱动重链和轻链的表达。因此在一个优选的安排中，两条链的表达都受CMPS控制且重链中具有ER保留信号(12645对12646)。第二种优选的安排是至少受CMPS启动子控制表达重链，优选地(尽管不是必需地)通过ER保留信号的使用，重链保留在ER中。
表8轻链和重链可变区的序列标识符


实施例3抗原制备抗体制备和分离方法是基于Karkhanis和Bhogal Anal.Biochem.，1555l-55，1986的工作。对于抗原制备，用50μl 1∶200稀释度OD600nm＝1.0的大肠杆菌(E.coli)培养物接种250ml三角瓶中100ml含有1％IsoVitaleX(Becton Dickinson，Sparks，MD)的Minca肉汤。在37℃的定轨振荡器中，以200rpm培养培养物18小时，并且在SorvalSS-34离心机中以8000rpm离心20分钟后收集培养物。在10ml补加有0.01％TWEEN-80的磷酸缓冲盐溶液(PBS)，pH7.2中重悬浮沉淀，然后在60℃水浴中加热30分钟。用polytron以最大速度(28Krpm)在冰浴上匀浆细菌5分钟。以15,000rpm离心20分钟后，通过0.45μm薄膜滤器过滤上清液。向过滤的上清液(pH约7)添加2.5％柠檬酸溶液，pH3.55以获得4.0pH。在4℃沉淀菌毛抗原30分钟，然后在Sorval SS-34离心机中以10,000rpm离心20分钟。在1ml 50mM磷酸盐缓冲液，pH7.2中重悬浮沉淀。通过进行非变性的4-12％或15％SDS-PAGE凝胶检测抗原纯度。
实施例4单克隆抗体IgG1的提取和纯化4.1杂交瘤培养鼠科杂交瘤细胞培养物达到每毫升约1-3×106个细胞的最大细胞密度，并且监测2-3天以允许单克隆IgG1的表达和分泌。这个期间后，在室温下以1200rpm以下旋转培养物。收集上清液，并且通过0.2μm滤器。最终的上清液包含DMEM(具有高葡萄糖的Dulbecco极限必需培养基，Gibco，Invitrogen，Carlsbad，CA)，10％FBS(无菌的胎儿牛血清，Sigma Chemical，St.Louis，MO)，和1X谷氨酰胺/青霉素/链霉素(Gibco，Invitrogen，Carlsbad，CA)。含有小鼠IgG1抗体的上清液直接以3ml/min应用于5ml HiTrapTM蛋白质G柱子(Amersham Biosciences，Piscataway，NJ)。上清液多次通过柱子不必要，因为95％以上来源于每份上清液的所有IgG1物质在第一次通过时就结合柱子了。流动相由1X PBS(流动缓冲液，FisherScientific，Pittsburgh，PA)和0.1M甘氨酸pH 2.7(洗脱缓冲液，Sigma Chemical)组成。用1M TrisHCl，pH 9.0稀释0.1M甘氨酸中的抗体收集物20％(v/v)进行中和作用。收集IgG1收集物，并且彻底用水，然后用1×PBS透析。用甘油以1∶1(v/v)稀释透析液，并且贮存在-20℃。稀释样品中甘油的存在不影响通过表面等离子体共振分析(Biacore，Piscataway，NJ)所测定的任何IgG1抗体的结合亲和性。在添加甘油前，利用商购的鼠科IgG1母液(1mg/ml Sigma Chemical，St.Louis，MO，Cat#M9269)做为标准，通过Bradford分析(Biorad，Hercules，CA)检测每种IgG1母液的浓度。
通过表面等离子体共振(Biacore，Piscataway，NJ)分析来源于杂交瘤细胞培养物的纯化的鼠科单克隆抗体对K88菌毛蛋白质抗原(也称为F4伞毛粘附素)的结合特征。K88菌毛蛋白质由于依赖于浓度的自身缔合，所以不能用做分析中的分析物。做为分析物，K88存在多种复合形式，并且不能模拟其与固定的抗K88抗体的结合。然而，利用K88做为配体可以获得敏感数据。K88以非常低的浓度结合生物传感器芯片产生高度敏感的芯片表面。单克隆抗体与连接有K88的表面结合非常符合标准二价分析物模型系统其中A是溶液中游离的二价抗体，B是芯片表面上相互作用位点，AB是单结合的抗体分子，AB2是抗体的两个相互作用位点都参与表面相互作用的位置。在芯片使用的使用期限中K88结合的表面基线响应水平没有降低。这个结果有力地表明与多聚亚基非共价结合芯片表面相反，能结合IgG1的所有K88分子共价结合芯片表面。与用于分析的IgG1无关，50RU的K88抗原与CM5表面结合产生了约130RU的最大IgG1响应。该Rmax值比假如K88在芯片表面上是单体(28KDa)，期望的225RU“理想的”响应水平要小。考虑到通过配体随机伯胺的表面连接常常减少表面呈现给潜在分析物的活性配体的量，这并不惊奇。
3种单克隆IgG1抗体(17/44，36/41和7/46)中每种抗体都显示了与K88抗原的独特结合特征。在所有情况下，由ka1和kd1控制每种抗体的总缔合-解离速率，ka2和kd2的作用最小。单基于kd1/ka1，发现了每种抗体的“假”平衡解离常数Kd。图6中示出了每种IgG1的sensograms曲线。在表9中给出了来源于将曲线拟合成二价分析物模型的动力学参数。单克隆抗体7/46对K88具有最弱的亲和性，36/41具有最高的亲和性。36/41的解离如此慢以致于在3.5小时期间进行另外的试验以跟踪信号衰变(36/41 IgG1的释放)，其中实际上可以测定一些解离。二价分析物拟合的残数(residuals)都随机聚集在零附近。轻微偏离二价分析物模型在17/44中是明显的，表明K88表面上多个17/44结合位点的可能性，或者溶液中IgG1分子可能的非理想行为。
表9来源于对3种IgG1抗体中每种抗体多个浓度的二价分析物拟合的速率常数(参见图6)。假KD指Kd1/Ka1假设Kd2和Ka2没有显著地贡献所观察的速率。

4.2植物产生抗体的提取和纯化首先使用SPEX CertiPrep Model 6800冷冻磨机，浸没在N2(1)中粉碎冷冻的转基因玉米材料(玉米叶和种子)。在N2(1)存在的情况下，用研钵和研杵进一步粉碎冷冻的粉末。用含水的25nM TrisHCl，100mM KCl，5mM EDTA，0.1％TWEEN-20(聚氧化乙烯山梨糖醇酐单月桂酸酯)缓冲液从粉碎的材料提取蛋白质，该缓冲液包含1∶10000稀释度的浓缩蛋白酶抑制剂混合物(ICN Biomedicals，Costa Mesa，CA，#B000126)。干质量提取缓冲液比率是1∶4，并且对于玉米叶产生了约1.6±0.6mg/ml的总可溶蛋白质浓度，对于玉米种子是2.7±0.4mg/ml的总可溶蛋白质浓度。以15000rpm离心植物提取物20分钟，并且用0.2μm滤器过滤。随后以1ml/min的流速将提取物应用于1ml HiTrapTM蛋白质G柱子上。流动缓冲液和洗脱缓冲液分别是1×PBS和0.1M甘氨酸，pH2.7。利用水，随后利用0.1M HEPES，0.15M NaCl，3mM EDTA和0.01％TWEEN-20缓冲液(用于表面等离子体共振分析的流动缓冲液)透析纯化的植物IgG1。通过Western印迹分析证实了植物产生的鼠IgG1的存在。通过Bradford分析检测植物产生的IgG1浓度。
实施例5表面等离子体共振利用BIA3000软件中固定方法和标准的N-乙基-N′-(二甲基氨基丙基)-碳二亚胺-盐酸盐/400mM N-羟基-琥珀酸亚胺(NHS/EDC)活化化学，蛋白质/配体通过它们暴露的伯胺基团共价结合生物传感器(Biosensor)CM5(BioSensor，Uppsala，Sweden)芯片表面。用乙醇胺封闭未反应的表面位点以阻止进一步的反应性。在实施例4.1中讨论了固定水平。通过在10mM醋酸盐，pH4.0中添加0.5到10μg/ml配体获得固定。在40℃，以50μL/min的流速进行所设计的用于配体/分析物动力学和亲和性参数定量测定的试验。在25℃，以25μL/min的流速进行所设计的用于多个分析物定性比较的试验以保存蛋白质。流动缓冲液含有0.1M HEPES，0.15M NaCl，3mM EDTA和0.01％TWEEN-20，pH 7.4。用NHS/EDC激活参照流动池，并且立即用乙醇胺封闭。
实施例6口服施用单克隆抗体的肠内水平使用15头去势公猪(PIC，C15x Canabrid)。通过外科手术在猪回肠运端装有单个T插管。在试验开始时期，猪称重约30kg，约9周龄。每天给大约5头猪装插管，并且允许3-7天期间的术后恢复。
将猪圈在一个房间中1.2m(长)×0.8m(高)×1.2m(长)的代谢围栏中。该围栏允许整个试验期间猪的自由活动。代谢围栏装有碗状进料器和碗状类型饮水器，并且在相邻围栏之间安装有机玻璃面板使得猪具有视觉接触。
猪恢复食欲后，在约08:30，11:30和15:30给猪提供等重量的三餐(约1∶1)。猪随时有机会饮水。该研究设计是随机化完全区组设计(参见表10)。根据手术的天数和重量给猪分组，并且将猪随机分配给5种处理中的一种处理。将单个猪视为试验单元。参与进行回肠消化物和粪便样品上分析和/或定量实验测定的全体人员对于向任何一头猪提供的试验区组或处理都不知情。
表10猪免疫球蛋白治疗的研究设计

在第0天，区组中的猪被随机分配给上述5个处理中的一个处理。一天施用处理一次或3次(取决于试验组)，连续3天(第0天到第2天)。在第1天，在约8:00，11:00和14:00点给猪喂食3餐。
将塑料袋与肛门周围的Velcro环和回肠T插管连接以在整天内收集粪便和回肠消化物用于分析牛抗K99抗体和IgG1水平。没有化学试剂或防腐剂被添加到收集袋中。在第0天，在用牛免疫球蛋白施用第一次处理前，也收集回肠消化物和粪便。
为了确保猪消耗所有干的试验样品，试验样品与等份的饲料(～100g)混合，在喂食猪饲料之前将其喂食给猪。在消耗了该小量的饲料后，施用该餐的剩余部分。对于接受溶于水中的试验样品的猪，在被喂食前，猪口服接受10ml体积溶解在水中试验样品。为了检测IgG1和抗K99抗体的转运时间、吸附和/或衰变速率，在第0到4天，按照基线期收集回肠消化物和粪便。
在手术后恢复、基线、和收集处理期间，每天观察动物以进行健康状况评估及核实和记录每餐的量和消耗。对于大部分猪，没有与给猪施用牛免疫球蛋白相关的有害影响。在第0天，施用第一次处理后不久，观察到了一头猪(组5)的呕吐。每天核实和记录水的利用率。记录试验样品的消耗或拒绝。
在第0和1天，处理后3小时，接受和初乳混合的单个大剂量(500mg)干牛免疫球蛋白的猪(组)中抗K99的平均抗体水平最高，随后是用饲料中直接混合的干单个大剂量(500mg)处理的猪(组2)(图7和9)。在第2天，小组2中处理后3小时，K99抗体水平最高，接着是小组1(图11)，而在用溶解于水中的单剂量(500ml)处理的猪中，在第2天，抗K99水平相当低(图7，9和11)。在所有3个单剂量组中，免疫球蛋白施用后6小时，K99水平已经显著下降。在所有3个处理日中，在每日3次接受(干的和溶解于水中的)170mg牛免疫球蛋白剂量的小组中，抗K99水平约低3倍(图8，10和12)。与单剂量组比较，每日3次处理的猪中在处理后3和6小时都维持抗了K99水平。当平均所有处理日的K99水平时，观察到了相似的结果(图13)。
回肠内含物中总IgG1检测是可变的。在几种情况下，在用单剂量(500mg)干牛免疫球蛋白和初乳混合治疗的一头猪中(小组1)IgG1水平大大高于相同组中其它2头猪中IgG1的水平，产生了比在其它组中获得的平均值显著更高的平均值(图14-19)。当平均所有治疗日的IgG1水平时，观察到了相似的结果(图20)。粪便中抗K99抗体和总IgG1的水平低于所用测定法的检测水平。
实施例7抗体CH3结构域的优化7.1 IgG Fc结构域(CH2CH3)的残基频率分析通过对NCBI(国家生物技术信息中心)所维护的非冗余蛋白质序列数据集进行Tera-BlastTM例行程序并且利用牛科、鼠科和人类Fc序列做为诱饵，收集总共36个唯一的IgG Fc序列。用于Fc残基位置频率分析的所有序列是至少95％独特的(即，与数据集中任何其它序列相比约220个残基中至少10个残基变异)。没有5％的截断，序列集发展到100个以上的序列。冗余产生了相当多的偏离，因此排除冗余。图22A表示数据集中所有序列的Clustal W序列对齐的一部分。
利用内部编写的Perl程序，对36个序列进行位置频率和位置熵(positional entropy)计算。该程序利用Clustal W序列对齐文件做为输入(Higgins等，Nuc.Acids Res.，224673-4680，1994-http//www.ebi.ac.uk/clustalw)。单个序列中每个位置i的残基频率，pi(r)，简单地是数据集中所观察到的特定残基类型(r＝A，C，D...V，W，Y)的次数除以总的序列数。位置熵N(i)计算为每个残基位置变异性的量度(Shenkin等，Proteins，11297-313，1991)。位置熵是Shanno信息熵H(i)的函数每个序列的记分粗略地计算为它们与“最佳”或共有序列相似性的函数(表11)。有趣地，不管任何其它的灵长类序列是否包含在全部的数据集中，人类序列最接近共有序列。牛序列记分中等，而小鼠记分是低的。记分的变化可能反应了全部数据集中基本的偏离，而不是人类序列最高程度演化以最接近最佳序列的一些现象。即使考虑偏离，鼠IgG1序列记分特别低，并且与其它Fc序列，包括鼠科IgG2，相当不同。
来源于分析的数据用于指导诱变以最优化牛科CH3结构域。根据4个标准筛选突变。首先，在给定位置的单个序列残基频率除以整个数据集相同位置的最常见残基频率必须小于0.2(即，rf/mfr≤0.2)。其次，根据CH3结构分析和残基类型，突变必须是保守性的；因此，没有进行电荷反转等等。第三点是整个序列中必须不存在该位置和其它残基位置的相关变异。第四，待要突变的天然残基在单个物种IgG亚类(例如牛)中不必是保守性的。最后的标准涉及非相关变异标准。
几种CH3结构域，包括牛科CH3含有插入或缺失；因此，选择Fc数据集用于整个原稿的残基编号。括号中数字指标准全长人类IgG残基编号，而直接邻近残基字母的数字指来源于Fc数据集的编码。
表11反应与IgG数据集单个序列的共有序列相似性的序列记分。对于单个序列的所有Fc残基与共有序列238个残基位置的完整匹配，最大记分是238。括号中数字表示来源于数据集中所代表的特定类群的相关物种数。该类群被任意地分为灵长类、啮齿动物、牲畜(即，牛、绵羊、马、山羊)、家畜(猫和狗)和其它。*这种情况下，恒河猴不包含在数据集中，但是以它做为比较。


7.2牛、鼠科和人类CH3结构域的表达和纯化从购自ATCC(Manassas，VA)的genbank来源#BC014258亚克隆人类CH3结构域。从来源于购自Stratagene(La Jolla，CA)的牛脾脏cDNA文库的牛构建体亚克隆牛CH2CH3和CH3构建体。从基于鼠科Kabat数据库共有序列的合成鼠科IgG1基因亚克隆鼠科CH3。利用设计的BamHI和XhoI限制位点(酶购自Invitrogen，Carlsbad，CA)消化CH3 PCR插入片段和商购的pET21a质粒(Novagen，Madison，WI)。利用H.C.T4DNA连接酶(Invitrogen)，将插入片段连接到载体中。
使用QuickChange定点诱变试剂盒(Stratagene)以在牛CH3pET21a载体上产生单个的突变。
使用下面的引物扩增来源于全长抗体基因序列的恒定结构域片段。括号中数字表示每个扩增的多核苷酸片段的核苷酸总数。人类CH3(330)5’-gaattaaggatccaaagccaaaggccagccccgcgaacc-3’(SEQ ID NO.58)5’-tttattgattattgctcgagtttacccggagacaggga-3’(SEQ ID NO.59)鼠CH3(330)5’-aattaatgaattaaggatccaagaccaagggccgcccgaagg-3’(SEQ ID NO.60)5’-tttattgattattgctcgagcttgcccggggagtgagagagg-3’(SEQ ID NO.61)牛CH3(336)5’-aattaatgaattaaggatcccgcaccaaaggccctgcc-3’(SEQ ID NO.62)5’-tttattgattattgctcgagcttgccggcggacttggagg-3’(SEQ ID NO.63)牛CH2CH3(642)5’-ttaatgaattaaggatccggcggcccatctgtgttcatcttc-3’(SEQ ID NO.64)5’-tttattgattattgctcgagcttgccggcggacttggagg-3’(SEQ ID NO.65)研究BL21(DE3)，BL21(DE3-trxB)和Rosetta-Gami大肠杆菌(E.coli)细胞系(所有都来自于Novagen)做为蛋白质表达的潜在宿主。在转化/接种后，在Luria肉汤(LB)中，在37℃培养来源于这3种宿主的细胞。在用1mM IPTG(异丙基β-D-硫代半乳糖苷)诱导前，允许细胞产生达到0.6-0.8AU的A600读数。在37℃进行蛋白质表达5小时。通过以5000g离心收集细胞，并且冷冻过夜细胞沉淀。
在30ml 8M尿素，pH8.5中重悬浮来源于1L培养物的细胞沉淀。超声处理重悬浮液，以15000rpm离心20分钟，并且通过0.2μM滤器。通过His标记亲和性层析进行最初的纯化。将粗蛋白质悬浮液施用于Ni2+-NTA琼脂糖(Qiagen，Valencia，CA)重力柱子。用8M尿素，pH4.4从亲和性柱子洗脱相对纯的CH3构建体。利用H2O/乙腈(0.1％TFA)梯度，通过在JupiterC5柱子(Phenomenex，Torrance，CA)上反相HPLC进一步纯化半纯的蛋白质。HPLC系统包含连接AD25吸收检测器和LC10人工注射器的Dionex(Sunnyvale，CA)GP50四泵(quadrapump)单元。冷冻，冻干纯的蛋白质，在中性pH下重悬浮，并且在4℃贮存。
在图22B中所示的3种蛋白质序列相对于来源于残基频率分析的共有序列对齐。牛科CH3(bCH3)用于探测最适合的表达宿主。研究BL21(DE3)，BL21(DE3-trxB)和Rosetta-Gami大肠杆菌(E.coli)细胞系(所有都来自于Novagen，Madison，WI)做为蛋白质表达的潜在宿主。开发用于胞质蛋白质表达的构建体(即，缺少将蛋白质引入到外周质空间的信号肽)。bCH3在所有宿主中都表达很好，并且所有宿主都产生了相似数量的可溶蛋白质(根据反相PCR分析，约70％可溶/30％不可溶)。
CH3结构域在C170(367)和C230(425)之间含有单个二硫键。BL21(DE3)宿主几乎没有产生氧化的蛋白质(根据丙烯酰胺凝胶分析，＜20％)。BL21(DE3-trxB)和Rosetta-Gami细胞系都产生了显著的氧化的牛科CH3(70-80％氧化的)。Rosetta-Gami的生长期一向更长，并且要求使用4种独立的标记，使得它的处理更麻烦。因此，尽管可以使用其它的表达宿主，但是选择BL21(DE3-trxB)用于该实施例中所述所有CH3构建体的表达。利用Ni2+-NTA重力柱子(Qiagen，Valencia，CA)进行CH3结构域的最初纯化。测定牛科CH3可以在天然缓冲液系统中再次折叠；因此，在超声处理以捕获约70％可溶和约30％不溶蛋白质组分之前，在pH8.5的8M尿素中溶解所有的细胞沉淀，并且如上所述进行纯化。如通过HPLC所证明的，在还原的CH3之前，显著地洗脱了氧化的CH3，并且被分为纯氧化和还原形式，图23A。图23B中示出了CH3结构域的纯度。bCH3的最终产量范围是20-40mg纯蛋白质/1L摇瓶培养物。有趣地，鼠科CH3(mCH3)不产生显著数量的氧化蛋白质，人类CH3(hCH3)表达几乎不产生。可以收集足够氧化的mCH3用于生物物理分析，而看起来所有hCH3收集物至少部分还原了，图23B。bCH3和mCH3做为二聚体出现在BioSpec2000(Pharmacia)凝胶过滤柱子上。洗脱的hCH3有几种形式，占优势的三聚体、二聚体和单体；另外表明它不是完完地被折叠/氧化。根据蛋白质已知的生物物理特性，预期蛋白质做为二聚体出现。
7.3牛科和鼠科CH3是稳定地和协作地被折叠的利用装配有热电小池固定器和总荧光配件的Aviv Model 215分光计进行圆二色性(CD)和荧光测定。通过以1点/nm的扫描获得CD光谱。所有最后的光谱都是利用信号平均时间2s/λ至少4次扫描的平均值。从样品光谱扣除背景光谱，并且根据蛋白质浓度和肽键数量，将所得到的校正光谱转换为平均残基椭圆率(mean residueellipticity)(deg cm2dmol-1)。利用近UV CD和远UV CD荧光分别监测从1到101℃(2℃温度步幅)的温度熔解。荧光激发波长是278nm，带宽3nm；利用2nm带宽，在278nm监测近UV CD信号；并且利用1nm带宽，在217nm监测远UV CD信号。所有熔解试验的信号平均期间是50s/℃。CD透明缓冲液用于所有的试验(2mM磷酸盐，硼酸盐，柠檬酸盐，10mM NaCI，pH 7.5)。牛科和鼠科CH3的熔解温度不随着浓度而变化，因此曲线被拟合成两种状态/单个分子未折叠的模型F(折叠的)U(未折叠的)，其中Ku＝[U]/[F]；Ku-fu/(1-fu)以获得精确的Tm值。[U]和[F]分别是未折叠和折叠状态的摩尔浓度。fu是溶液中未折叠的蛋白质组分。根据Gibbs-Helmholtz等式 假设折叠和未折叠状态的信号随着温度线性变化，并且在试验的温度范围中，折叠和未折叠状态之间的热容量差ΔCp°不变，则熔解曲线可拟合成下面等式 其中(d+c*T)和(b+a*T)分别描述了对于折叠和未折叠状态的信号，随着温度的线性变化。根据蛋白质折叠和未折叠状态之间可接近的表面积的变化(ΔASA)估测，计算理论上的ΔCp°，1727cal/mol*K(Myers等，Prot.Sci.，42138-2148，1995)。ΔASA与蛋白质大小成比例，并且对于CH3单体估算其是93232。以前计算了CH3二聚作用的ΔASA是10902(Miller，J Mol.Biol.，216965-973，1990)。这2个值的和用于计算折叠和未折叠状态之间的ΔCp°。
在BioSpec2000(Amersham Pharmacia，Piscataway，NJ)HPLC凝胶过滤柱子上进行凝胶过滤。分子量标准包括牛血清白蛋白、碳酸酐酶、溶菌酶和遍在蛋白。通常，每次凝胶过滤注射10-100μg之间的蛋白质。利用0.1M HEPES，150mM NaCl，3mM EDTA，pH 7.5做为流动相，以1mL/min进行凝胶过滤。
CH3结构域都含有显著的通过它们的圆二色性(CD)所判断的二级结构光谱，图24A。bCH3，mCH3和hCH3在217nm都显示了最小值，这是β-片层结构特征性的。这与包含2次折叠的β-片层三明治结构的抗体折叠一致，图21。hCH3光谱在强度和形状方面显著不同于bCH3和mCH3光谱，但是与观察到的还原bCH3光谱非常相似(未示出数据)。bCH3和mCH3光谱几乎是可重叠的，表明它们的结构一定几乎相同。考虑到bCH3和mCH3在序列中相互只有53％相同，这不是完全所预期的。可预期影响CD光谱的局部结构重排以调节一级序列中的差异。
通过监测217nm的远UV CD信号，278nm近UV CD信号和利用278nm激发波长的荧光研究温度诱导的结构域的解析叠。bCH3和mCH3都经历了分别具有中点(Tm)在349.5±0.5K和346.8±0.5K的单个解折叠转换。bCH3和mCH3的重折叠几乎是完全可逆的。温度变性前后，在5℃的CD光谱实际上没有改变。hCH3没有显示两种状态解折叠行为，图24B。在约340K，hCH3的CD和荧光信号开始显著地改变，但是不是单一的S形曲线形式。对纯化的还原bCH3也观察到了该行为(未示出数据)。此外，温度变性后hCH3的CD光谱没有完全回到其原始形状，而是强度减少了。
bCH3和mCH3的Tm不受浓度影响。利用0.5和4μM bCH3进行荧光测定，用10μM bCH3进行近UV CD测定，用30μM bCH3进行远UV CD测定(参见图24B的远UV CD温度变性)。在该60倍范围的浓度内，没有观察到Tm的变化。该结果表明两种可能性中的一种可能性。第一种可能性是解折叠转换出现前二聚体解离。第二种可能性是如果KD是低的pM或fM，可能没有游离的CH3存在以增加高浓度时折叠二聚体的稳定性。而且，蛋白质的折叠速率不受二聚体缔合的速率影响，而是受Buchner和coworkers(Thies等.J.Mol.Biol.，29367-79，1999)所观察到的单体折叠控制。在任何情况下，bCH3和mCH3的稳定性非常相似，尽管它们一级序列不同。
7.4基于残基频率分析的牛科CH3定向突变允许结构域的稳定化作用当与Fc数据集比较牛科CH3序列时，鉴定了5个潜在非理想的残基位点，图22B。位点是S174(371)，Y179(376)，G197(392)，S207(402)和T246(441)，其中括号中数字是标准人类IgG残基编码。每个残基位点基于hCH3结构均远离4个其它位点(DeLano等.Science，2871279-1283，2000)，并且期望对结构域的结构和稳定性具有独立的影响。进行下面的点突变以试图“优化”bCH3S174G，Y179D，G197K，G197A(保守性突变)，S207G和T246L。
所有突变蛋白质都显示了与天然蛋白质几乎相同的CD光谱(图25A)，表明任何点突变都没有诱导大的结构改变。分别通过近和远UV CD，在278nm和217nm监测所有6个突变体的温度解折叠转换。每个突变体CH3结构域都显示了通过近和远UV CD可以重复再现的独特Tm。表12中给出了所有构建体的温度变性结果。
表12将bCH3和6个突变体蛋白质温度变性曲线拟合成两种状态解折叠模型的结果。*表示假设的三重突变体中，假设单个突变体稳定化对总的蛋白质稳定性是加合的。

G197K，S207G和T246L突变都对bCH3具有稳定化作用。利用残基频率分析以优化蛋白质稳定性的以前研究表明稳定性的这种突变的增加通常是加合的(Roth和Davidson，Protein Sci.92457-2469，2000，Steipe等.J.Mol.Biol.，240188-192，1993)。bCH3的解折叠曲线，6个突变体CH3结构域和假设的三重突变体如图25B所示。
实施例8鼠和人类CH2CH3及牛CH2的优化根据建立的用于牛CH3结构域的突变标准，利用相同的数据集和残基频率分析鉴定了牛IgG1 CH2结构域中及鼠和人类IgG1 CH2CH3结构域中潜在地稳定化突变。由于严格性突变筛选，牛CH3中没有一个突变体对结构域具有去稳定化影响。实际上，最差表现的突变，Y179D和S17G没有引起结构域总的稳定性变化。这提供了下面给出的牛CH2及鼠和人类CH2CH3中突变对每个结构域的稳定性将具有有益的作用的高置信度。
下面示出了带有Fc(SEQ ID No.66)数据集编号的数据集共有序列HCPCPAPELLGGPSVFIFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQPVFSWYVDGVEVHTAKMLTKPR|||25 50 75EEQFNSTYRVVSVLPIQHQDWLNGKEFKCKVNNKALPAPIEKTISKAKGQPREEPQVYVLPPPREELSKND|||100 125 150TVSLTCIVKGFYPPDIAVEWQSNGQPEPENKYKTTPPQLDSDGSYFLYSKLSVDKSRWQQGNTFTCSVMHE|||175 200 225ALHNHYTQKSLSKSPGK.
|252所有现存和潜在的突变都遵循该编号系统。基于残基频率分析的牛CH2中潜在有益的突变包括N85H，R109P，T116L和H126N。基于残基频率分析的鼠CH2CH3中潜在有益的突变包括V48T，I64V，K66Q，S104V，S127N，F130L，F176Y，W186S，Q200P，V211L和A224Q。基于残基频率分析的人类CH2CH3中潜在有益的突变包括K72Q，Y98F，L111Q，S126N和V202Q。
实施例9植物产生的抗体的N-末端测序对36/41 IgG1分子进行N-末端测序以进一步表征转基因材料。测序了来源于杂交瘤材料和转基因植物材料的IgG1。测序前，轻链没有与重链分离。对水透析来源于杂交瘤细胞系和来源于转基因植物材料的纯化的36/41单克隆IgG1，冷冻和冻干成粉末。约50p摩尔的每种蛋白质被送到犹他州大学生物技术和基因组研究中心进行N-末端测序。利用Applied Biosystems(Foster City，CA)Procise测序仪，以4Hz的采样速率和1AUFS的检测器标度对10p摩尔级进行测序。对每种蛋白质进行总共10轮循环以证实头10个氨基酸。
在连续测序循环中轻链产生了一致更强的信号，可以区分重链和轻链氨基酸。在数据库分析前没有提供IgG1分子的N-末端序列以确保无偏见地解释数据库。误差可能是有限数量材料和来源于纯化方法的残余甘氨酸存在的结果。在表13中将结果制成表格。在转基因IgG1材料的情况下，内质网信号序列被精确地加工为所预期的形式。
表13对鼠科杂交瘤细胞和转基因玉米材料产生的36/41 IgG1分子进行N-末端测序的结果。

根据本发明的详细描述和上面给出的实施例，可以理解可以实现本发明的几个方面。
可以理解，所描述的本发明的特定实施方式不是穷尽的或限制本发明，并且根据前述实施例和详细的描述，许多替换、修改和变化对本领域普通技术人员显而易见。因此，本发明包括所有这种替换、修改和变化。
序列表<110>SYNGENTA PARTICIPATIONS AG<120>在植物中表达抗肠产毒性大肠杆菌的抗体COLI<130>S 70235/WO<150>US 60/448429<151>2003-02-18<160>80<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>399<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>抗K99的密码子优化的VH<400>1actagtgagg tgcagctcgt ggagtccggc ggcggcttcg tgaagccggg cggctccctc60aagctctcct gcgccgcctc cggcttcacc ttctccgact acttcatgtc ctggattcgc120cagaccccgg agaagcgcct ggagtgggtc gccaccatca acaacggcgg ctcccacacc180tactgctccg acaacgtgaa gggccgcttc accaccttcc gcgacaacgt gaagaacacc240ctctacctcc agatgtcctc cctcaacttc gaggacaccg ccatgtacta ctgcgcccgc300gcctactacc gcttcgacgt gcgcgcctgg ttctcctact ggggccaggg caccctcgtg360accgtgtcca cggccaagac caccccgccgtccgtctac399
<210>2<211>582<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>抗K99的密码子优化的VL<400>2agtgacatcc tcctcaccca gtccccggcc atcctctcca tgatcccgcg ccagcgcgtg60tccttctcct gccgcgcctc ccagatcatc ggcaccacca tccactggtc ccagcagcgc120accgacggct ccccgcgcct cctcatccag tgcgcctccg agtccatctc cggcatcccg180tcccgcttct ccggcaccgg ctccggcacc gacttcaccc tcaacttcaa ctccgtggag240tccgagtaca tcaccgacta ctactgccag cagtccaaca cctggccgac ctacccgttc300ggcggcggca ccaagctcga gatcaagcgc gccgacgccg ccccgaccgt gtccatcttc360ccgccgtcct ccgagcagct cacctccggc ggcgcgtccg tggtgtgctt cctcaacaac420ttctacccga aggacatcaa cgtgaagtgg aagatcgacg gctccgagcg ccagaacggc480gtgctcaact cctggaccga ccaggactcc aaggactcca cctactccat gtcctccacc540ctcaccctca ccaaggacgagtacgagcgc cacaactcct ac582<210>3<211>399<212>DNA<213>小鼠<400>3actagtgaag tgcaactggt ggagtctggg ggaggcttcg tgaagcctgg agggtccctg60aaactctcct gtgcagcctc tggattcact ttcagtgact atttcatgtc ttggattcgc120cagactccgg aaaagaggct ggagtgggtc gcaaccatta ataatggtgg tagtcacacc180tactgttcag acaatgtgaa gggacgattt acaactttca gagacaatgt caaaaacacc240ctgtaccttc aaatgagcag tctgaacttt gaggacacag ccatgtatta ctgtgcaaga300gcctactata ggttcgacgt gagggcctgg ttttcttatt ggggccaagg gactctggtc360actgtctcta cagccaaaac gacaccccca tctgtctac399
<210>4<211>330<212>DNA<213>小鼠<400>4actagtgaca tcttgctgac tcagtctcca gccatcctgt ctatgattcc aagacaaaga60gtcagtttct cctgcagggc cagtcagatc attggcacaa ccatacactg gtctcagcaa120agaacagatg gttctcctag gcttctcata cagtgtgctt ctgagtctat ctctgggatc180ccttccaggt ttagtggcac tggatcaggg acagatttta ctcttaactt caacagtgtg240gagtctgaat atattacaga ttattactgt caacaaagta atacctggcc aacgtacccg300ttcggagggg ggaccaagct cgagataaaa 330<210>5<211>396<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>来自17_44的抗K88的密码子优化的VH<400>5actagtgacg tgcagctcgt ggagtccggc ggcggcctcg tgcagccggg cggctcccgc60aagctctcct gcgccgcctc cggcttcacc ttctcctcct tcgccatgca ctgggtgcgc120caggccccag agaagggcct ggagtgggtg gcctacatct cctccggctc catcaccatc180tactacgccg acaccgtgaa gggccgcttc accgtgtccc gcgacaaccc gaagtccacc240ctcttcctcc agatgacctc cctccgcagc gaggacaccg ccatgtacta ctgcgcccgc300gacgactacg gctcctccgg ctggtacttc gacgtctggg gcgctggcac cacggtgacc360gtgtcctcgg ccaagaccac cccgccgtcc gtctac 396<210>6<211>336<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>来自17_44的抗K88密码子优化的VL<400>6actagtgaca tcgtgatgtc ccagtccccg tcctccctcg ccgtgtccgc tggcgagaag60gtcaccatg tcctgcaagtc ctcccagtcc ctcctcaact cccgcacccg caagaactac120ctcgcctgg tatcagcagaa gccgggccag tccccgaagc tcctcatcta ctgggcctcc180acccgcgagt ccggcgtgcc ggaccgcttc accggctccg gctccggcac cgacttcacc240ctcaccatct cctccgtgca ggcggaggac ctcgccgtgt actactgcac ccagtcctac300aacctcctca ccttcggcgc cggtaccaag ctcgag 336<210>7<211>393<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>来自36_41的抗K88的密码子优化的VH<400>7actagtgagg tccagctgca gcagtctgga cctgaactag tgaagactgg ggcttcagtg60aagatatcct gcaaggcttc tgattactca ctcactgatt actacatgca ctgggtcaag120cagagccatg gagagagcct tgagtggatt ggatatatta atttttacaa tggtgctact180aactacaacc agaagttcaa gggcaaggcc acatttactg tagacacatc ctccagcaca240gtctacatgc agttcaacag cctgacatct gaagactctg cggtctatta ttgtgtaaga300gaagcattac tacggaacta tgctatggac tactggggtc aaggaacctc agtcaccgtc360tcctcagcca aaacgacacc cccatctgtc tac 393<210>8<211>324<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>来自36_41的抗K88的密码子优化的VL<400>8actagtgaaa atgtgctcac ccagtctcca gcaatcatgt ctgcatctcc aggggaaaag60gtcaccatga cctgcagggc cagctcaagt gtaagttccc gttacttgca ctggtaccag120cagaagtcag gtgcctcccc caaactctgg atttatagca catccaactt ggcttctgga180gtccctgctc gcttcagtgg cagtgggtct gggacctctt actctctcac aatcagcagt240gtggaggctg aagatgctgc cacttattac tgccagcaat acagtggtta cccgtggacg300ttcggtggag gcaccaagct cgag 324<210>9<211>408<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>来自7_46的抗K88的密码子优化的VH<400>9actagtgaag tgaagcttga ggagtctgga ggaggcttgg tgcaacctgg aggatccatg60agactctcct gtgttgcctc tggattcact ttcagtaact actggatgaa ctgggtccgc120cagtctccag agaaggggct tgagtgggtt gctgaaatta gattgacatc taataatttt180gcaacacatt atgcggagtc tgtgaaaggg aggttcacca tctcaagaga tgattccaaa240agtagtgtct acctgcaaat gaacaactta agagctgaag acactggcat ttattactgt300accaggcctt actacggtgg taggttcttc tactggtact tcgatgtctg gggcgcaggg360accacggtca ccgtctcctc aaccaaaacg acacccccat ctgtctac 408<210>10<211>324<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>来自7_46的抗K88的密码子优化的VL<400>10actagtgaaa ttgtgctcac ccagtctcca accaccatgg ctgcatctcc cggggagaag60
atcactatca cctgcagtgc cagctcaagt ataagttcca attacttgca ttggtatcag120cagaagccag gattctcccc taaactcttg atttatagga catccaatct ggcttctgga180gtcccagttc gcttcagtgg cagtgggtct gggacctctt actctctcac aattggcacc240atggaggctg aagatgttgc cacttactac tgccagcagg gtaatagtat accattcacg300ttcggctcgg ggacaaagct cgag 324<210>11<211>363<212>DNA<213>小鼠<400>11gatgtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttagtgcagc ctggagggtc ccggaaactc60tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt agctttgcaa tgcactgggt tcgtcaggct120ccagagaagg ggctggagtg ggtcgcatat attagtagtg gcagtattac catctactat180gcagacacag tgaagggccg attcaccgtc tccagagaca atcccaagag caccctgttc240ctgcaaatga ccagtctaag gtctgaggac acggccatgt attactgtgc aagagacgac300tacggtagta gcgggtggta cttcgatgtc tggggcgcag ggaccacggt caccgtctcc360tca 363<210>12<211>350<212>DNA<213>小鼠<400>12gacattgtga tgtcacagtc tccatcctcc ctggctgtgt cagcaggaga gaaggtcact60atgagctgca aatccagtca gagtctgctc aacagtagaa cccgaaagaa ctacttggct120tggtaccagc agaaaccagg gcagtctcct aaactgctga tctactgggc atccactagg180gaatctgggg tccctgatcg cttcacaggc agtggatctg ggacagattt cacyctcacc240atcagcagtg tgcaggctga agacctggca gtttattact gcacgcaatc ttataatctg300ctcacgttcg gtgctgggac caagctggaa ctgaatcggg ctgatgctgc 350
<210>13<211>410<212>DNA<213>小鼠<400>13gaggtccagc tgcagcagtc tggacctgaa ctagtgaaga ctggggcttc agtgaagata60tcctgcaagg cttctgatta ctcactcact gattactaca tgcactgggt caagcagagc120catggagaga gccttgagtg gattggatat attaattttt acaatggtgc tactaactac180aaccagaagt tcaagggcaa ggccacattt actgtagaca catcctccag cacagtctac240atgcagttca acagcctgac atctgaagac tctgcggtct attattgtgt aagagaagca300ttactacgga actatgctat ggactactgg ggtcaaggaa cctcagtcac cgtctcctca360gccaaaacga cacccccatc tgtctatcca ctggccccta ctagtgctgc 410<210>14<211>317<212>DNA<213>小鼠<400>14gaaaatgtgc tcacccagtc tccagcaatc atgtctgcat ctccagggga aaaggtcacc60atgacctgca gggccagctc aagtgtaagt tcccgttact tgcactggta ccagcagaag120tcaggtgcct cccccaaact ctggatttat agcacatcca acttggcttc tggagtccct180gctcgcttca gtggcagtgg gtctgggacc tcttactctc tcacaatcag cagtgtggag240gctgaagatg ctgccactta ttactgccag caatacagtg gttacccgtg gacgttcggt300ggaggcacca agctgga 317<210>15<211>374<212>DNA<213>小鼠<400>15gaagtgaagc ttgaggagtc tggaggaggc ttggtgcaac ctggaggatc catgagactc60
tcctgtgttg cctctggatt cactttcagt aactactgga tgaactgggt ccgccagtct120ccagagaagg ggcttgagtg ggttgctgaa attagattga catctaataa ttttgcaaca180cattatgcgg agtctgtgaa agggaggttc accatctcaa gagatgattc caaaagtagt240gtctacctgc aaatgaacaa cttaagagct gaagacactg gcatttatta ctgtaccagg300ccttactacg gtggtaggtt cttctactgg tacttcgatg tctggggcgc agggaccacg360gtcaccgtct cctc 374<210>16<211>318<212>DNA<213>小鼠<400>16gaaattgtgc tcacccagtc tccaaccacc atggctgcat ctcccgggga gaagatcact60atcacctgca gtgccagctc aagtataagt tccaattact tgcattggta tcagcagaag120ccaggattct cccctaaact cttgatttat aggacatcca atctggcttc tggagtccca180gttcgcttca gtggcagtgg gtctgggacc tcttactctc tcacaattgg caccatggag240gctgaagatg ttgccactta ctactgccag cagggtaata gtataccatt cacgttcggc300tcggggacaa agctcgag 318<210>17<211>134<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>抗K99的重链可变区<400>17Ala Thr Ser G1u Val Gln Leu Val G1u Ser Gly Gly G1y Phe Val Lys1 5 10 15Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe20 25 30
Ser Asp Tyr Phe Met Ser Trp Ile Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu35 40 45Glu Trp Val Ala Thr Ile Asn Asn Gly Gly Ser His Thr Tyr Cys Ser50 55 60Asp Asn Val Lys Gly Arg Phe Thr Thr Phe Arg Asp Asn Val Lys Asn65 70 75 80Thr Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Asn Phe Glu Asp Thr Ala Met85 90 95Tyr Tyr Cys Ala Arg Ala Tyr Tyr Arg Phe Asp Val Arg Ala Trp Phe100 105 110Ser Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Thr Ala Lys Thr115 120 125Thr Pro Pro Ser Val Tyr130<210>18<211>229<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>抗K99轻链<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(225)..(226)<223>225和226位的X表示未知氨基酸<400>18Ala Thr Ser Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Met1 5 10 15Ile Pro Arg Gln Arg VaL Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ile Ile20 25 30
Gly Thr Thr Ile His Trp Ser Gln Gln Arg Thr Asp Gly Ser Pro Arg35 40 45Leu Leu Ile Gln Cys Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg50 55 60Phe Ser Gly Thr Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Phe Asn Ser65 70 75 80Val Glu Ser Glu Tyr Ile Thr Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn Thr85 90 95Trp Pro Thr Tyr Pro Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg100 105 110Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln115 120 125Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr130 135 140Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln145 150 155 160Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr165 170 175Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg180 185 190His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro195 200 205Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys Ser Glu Lys Asp Glu Leu210 215 220Xaa Xaa Thr Gly Phe225<210>19<211>29<212>DNA<213>人工序列
11<220>
<223>引物MLALT2<400>19accatggatt ttcaagtgca gattttcag 29<210>20<211>31<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物MLALT3<400>20caccatggag wcacakwctc agtgtctttr t31<210>21<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物MLALT4<400>21caccatgkcc ccwrctcagy tyctkgt 27<210>22<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物MLALT5<400>22caccatgaag ttgcctgtta ggctgttg 28
<210>23<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物MH1<400>23atatccacca tggratgsag ctgkgtmats ctctt 35<210>24<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物MH2<400>24atatccacca tgracttcgg gytgagctkg gtttt35<210>25<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物33615<400>25gaagatctag acttactatg cagcatcagc 30<210>26<211>27<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>引物MVG1R<400>26ggcagcacta gtaggggcca gtggata 27<210>27<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物MVG2R<400>27gaggarccac tagtatctcc acacmcaggg gccag 35<210>28<211>19<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>ER转运肽<400>28Met Arg Val Leu Leu Val Ala Leu Ala Leu Leu Ala Leu Ala Ala Ser1 5 10 15Ala Thr Ser<210>29<211>24<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>引物<400>29acgcgtcgat catccaggtg caac 24<210>30<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>30actagtggcg ctcgcagcga ga 22<210>31<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>31accggttctg ttctgcacaa agtgt25<210>32<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>32acgcgtttgt acccctggat t21
<210>33<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>33acgcgt ttgc atgcctgcag tg 22<210>34<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>34agtccaacgg tggagcggaa ct 22<210>35<211>6<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>ER保留信号<400>35Ser Glu Lys Asp Glu Leu1 5<210>36<211>30<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸<400>36agcttggatc cactagtacc ggtacgcgtg 30<210>37<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸<400>37aattcacgcg taccggtact agtggatcca30<210>38<211>72<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸<400>38catgtgaggc cacccacaag acctccacct ccccaatcgt gaagagcttc aaccgcaacg60agtgctgata ga72<210>39<211>72<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸<400>39ccggtctatc agcactcgtt gcggttgaag ctcttcacga ttggggaggt ggaggtcttg60tgggtggcct ca72<210>40<211>36<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸<400>40agcttacgcg tggatccact agtgagctcg gtaccg36<210>41<211>36<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸<400>41aattcggtac cgagctcact agtggatcca cgcgta36<210>42<211>54<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸<400>42ccgggcaagt ccgagaagga cgagctgtga taggagctca aggtaccgaa ttca54
<210>43<211>54<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸<400>43agcttgaatt cggtaccttg agctcctatc acagctcgtc cttctcggac ttgc54<210>44<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物IIA<400>44aagcagtggt atcaacgcag agt 23<210>45<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物SMART IIA<400>45aagcagtggt atcaacgcag agtacgcggg 30<210>46<211>22<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>引物K99HC-3’<400>46aagtagacag atgggggtgt cg22<210>47<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物K88_746_VAR_H5’<400>47gccactagtg aagtgaagct tgaggag 27<210>48<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物K88_1744_VAR_H5’<400>48gccactagtg atgtgcagct ggtgga 26<210>49<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物K88_3641_VAR_H5’<400>49gccactagtg aggtccagct gcagcag 27
<210>50<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物K88_746_VAR_L5<400>50ccactagtga aattgtgctc acccag 26<210>51<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物K88_746_VAR_L3<400>51ttatctcgag ctttgtcccc gagccgaa28<210>52<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物K88_3641_VAR_L5<400>52gccactagtg aaaatgtgct cacccag 27<210>53<211>28<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>引物K88_3641_VAR_L3<400>53ttatctcgag cttggtgcct ccaccgaa 28<210>54<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物K88_1744_VAR_L5<400>54gccactagtg acat tgtgat gt cacag 27<210>55<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物K88_1744_VAR_L3<400>55ttatctcgag cttggtccca gcaccgaacg30<210>56<211>5<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>轻链可变区基序
<400>56Lys Leu Glu Ile Lys1 5<210>57<211>972<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Consensus nucleotide sequence of murine IgG1 Heavy Chain<400>57gccaaaacga cacccccatc tgtctatcca ctggcccctg gatctgctgc ccaaactaac60tccatggtga ccctgggatg cctggtcaag ggctatttcc ctgagccagt gacagtgacc120tggaactctg gatccctgtc cagcggtgtg cacaccttcc cagctgtcct gcagtctgac180ctctacactc tgagcagctc agtgactgtc ccctccagca cctggcccag cgagaccgtc240acctgcaacg ttgcccaccc ggccagcagc accaaggtgg acaagaaaat tgtgcccagg300gattgtggtt gtaagccttg catatgtaca gtcccagaag tatcatctgt cttcatcttc360cccccaaagc ccaaggatgt gctcaccatt actctgactc ctaaggtcac gtgtgttgtg420gtagacatca gcaaggatga tcccgaggtc cagttcagct ggtttgtaga tgatgtggag480gtgcacacag ctcagacgca accccgggag gagcagttca acagcacttt ccgctcagtc540agtgaacttc ccatcatgca ccaggactgg ctcaatggca aggagttcaa atgcagggta600aacagtgcag ctttccctgc ccccatcgag aaaaccatct ccaaaaccaa aggcagaccg660aaggctccac aggtgtacac cattccacct cccaaggagc agatggccaa ggataaagtc720agtctgacct gcatgataac agacttcttc cctgaagaca ttactgtgga gtggcagtgg780aatgggcagc cagcggagaa ctacaagaac actcagccca tcatggacac agatggctct840tacttcgtct acagcaagct caatgtgcag aagagcaact gggaggcagg aaatactttc900acctgctctg tgttacatga gggcctgcac aaccaccata ctgagaagag cctctcccac960tctcctggta aa972<210>58<211>39<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>人CH3的引物<400>58gaattaagga tccaaagcca aaggccagcc ccgcgaacc 39<210>59<211>38<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人CH3的引物<400>59tttattgatt attgctcgag tttacccgga gacaggga 38<210>60<211>42<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>鼠CH3的引物<400>60aattaatgaa ttaaggatcc aagaccaagg gccgcccgaa gg 42<210>61<211>42<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>鼠CH3的引物 CH3
<400>61tttattgatt attgctcgag cttgcccggg gagtgagaga gg 42<210>62<211>38<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>牛CH3的引物<400>62aattaatgaa ttaaggatcc cgcaccaaag gccctgcc 38<210>63<211>40<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>牛CH3的引物<400>63tttattgatt attgctcgag cttgccggcg gacttggagg 40<210>64<211>42<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>牛CH2CH3的引物<400>64ttaatgaatt aaggatccgg cggcccatct gtgttcatct tc 42<210>65<211>40
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>牛CH2CH3的引物<400>65tttattgatt attgctcgag cttgccggcg gacttggagg 40<210>66<211>230<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>IgG Fc序列的共有氨基酸序列<400>66His Cys Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe1 5 10 15Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro20 25 30Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val35 40 45Gln Pro Val Phe Ser Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Thr Ala50 55 60Lys Met Leu Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg65 70 75 80Val Val Ser Val Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys85 90 95Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu100 105 110Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Glu Pro Gln Val115 120 125
Tyr Val Leu Pro Pro Pro Arg Glu Glu Leu Ser Lys Asn Asp Thr Val130 135 140Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Pro Asp Ile Ala Val145 150 155 160Glu Trp Gln Ser Asn Gly Gln Pro Glu Pro Glu Asn Lys Tyr Lys Thr165 170 175Thr Pro Pro Gln Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys180 185 190Leu Ser Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Thr Phe Thr Cys195 200 205Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu210 215 220Ser Lys Ser Pro Gly Lys225 230<210>67<211>471<212>PRT<213>小鼠<400>67Thr Met Arg Val Leu Leu Val Ala Leu Ala Leu Leu Ala Leu Ala Ala1 5 10 15Ser Ala Thr Ser Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val20 25 30Gln Pro Gly Gly Ser Arg Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr35 40 45Phe Ser Ser Phe Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Glu Lys Gly50 55 60Leu Glu Trp Val Ala Tyr Ile Ser Ser Gly Ser Ile Thr Ile Tyr Tyr65 70 75 80Ala Asp Thr Val Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Pro Lys85 90 95
Ser Thr Leu Phe Leu Gln Met Thr Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala100 105 110Met Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Asp Tyr Gly Ser Ser Gly Trp Tyr Phe115 120 125Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser A1a Lys Thr130 135 140Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr145 150 155 160Asn Ser Met Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu165 170 175Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His180 185 190Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser195 200 205Val Thr Val Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser Glu Thr Val Thr Cys Asn210 215 220Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro225 230 235 240Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser245 250 255Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr260 265 270Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp275 280 285Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr290 295 300Ala Gln Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser305 310 315 320Val Ser Glu Leu Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu325 330 335
Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys340 345 350Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr355 360 365Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr370 375 380Cys Met Ile Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln385 390 395 400Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met405 410 415Asp Thr Asp Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys420 425 430Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu435 440 445Gly Leu His Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly450 455 460Lys Ser Glu Lys Asp Glu Leu465 470<210>68<211>244<212>PRT<213>小鼠<400>68Met Arg Val Leu Leu Val Ala Leu Ala Leu Leu Ala Leu Ala Ala Ser1 5 10 15Ala Thr Ser Asp Ile Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val20 25 30ser Ala Gly Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu35 40 45Leu Asn Ser Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys50 55 60
Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu65 70 75 80Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe85 90 95Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr100 105110Cys Thr Gln Ser Tyr Asn Leu Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu115 120 125Glu rle Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro130 135 140Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu145 150 155 160Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly165 170 175Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser180 185 190Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp195 200 205Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr210 215 220Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys Ser Glu225 230 235 240Lys Asp Glu Leu<2L0>69<211>469<212>PRT<213>小鼠<400>69
Met Arg Val Leu Leu Val Ala Leu Ala Leu Leu Ala Leu Ala Ala Ser1 5 10 15Ala Thr Ser Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys20 25 30Thr Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Asp Tyr Ser Leu35 40 45Thr Asp Tyr Tyr Met His Trp Val Lys Gln Ser His Gly Glu Ser Leu50 55 60Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Phe Tyr Asn Gly Ala Thr Asn Tyr Asn65 70 75 80Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Phe Thr Val Asp Thr Ser Ser Ser85 90 95Thr Val Tyr Met Gln Phe Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val100 105 110Tyr Tyr Cys Val Arg Glu Ala Leu Leu Arg Asn Tyr Ala Met Asp Tyr115 120 125Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro130 135 140Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser145 150 155 160Met Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val165 170 175Thr val Thr Trp Asr Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe180 185 190Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr195 200 205Val Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser Glu Thr Val Thr Cys Asn Val Ala210 215 220His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp225 230 235 240Cys Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val245 250 255
Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr260 265 270Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu275 280 285Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln290 295 300Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser305 310 315 320Glu Leu Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys325 330 335Cys Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile340 345 350Ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro355 360 365Pro Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met370 375 380Ile Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn385 390 395 400Gly Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr405 410 415Asp Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn420 425 430Trp Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu435 440 445His Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys Ser450 455 460Glu Lys Asp Glu Leu465<210>70<211>240
<212>PRT<213>小鼠<400>70Met Arg Val Leu Leu Val Ala Leu Ala Leu Leu Ala Leu Ala Ala Ser1 5 10 15Ala Thr Ser Glu Asn Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala20 25 30Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val35 40 45Ser Ser Arg Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Ala Ser Pro50 55 60Lys Leu Trp Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala65 70 75 80Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser85 90 95Ser Val Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser100 105 110Gly Tyr Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg115 120 125Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln130 135 140Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr145 150 155 160Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln165 170 175Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr180 185 190Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg195 200 205His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro210 215 220
Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys Ser Glu Lys Asp Glu Leu225 230 235 240<210>71<211>474<212>PRT<213>小鼠<400>71Met Arg Val Leu Leu Val Ala Leu Ala Leu Leu Ala Leu Ala Ala Ser1 5 10 15Ala Thr Ser Glu Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln20 25 30Pro Gly Gly Ser Met Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe35 40 45Ser Asn Tyr Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu50 55 60Glu Trp Val Ala Glu Ile Arg Leu Thr Ser Asn Asn Phe Ala Thr His65 70 75 80Tyr Ala Glu Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser85 90 95Lys Ser Ser Val Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Arg Ala Glu Asp Thr100 105 110GlY Ile Tyr Tyr Cys Thr Arg Pro Tyr Tyr Gly Gly Arg Phe Phe Tyr115 120 125Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser130 135 140Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala145 150 155 160Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr165 170 175
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser180 185 190Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu195 200 205Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser Glu Thr Val210 215 220Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys225 230 235 240Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro245 250 255Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu260 265 270Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser275 280 285Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu290 295 300Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr305 310 315 320Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn325 330 335Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro340 345 350Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln355 360 365Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val370 375 380Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val385 390 395 400Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln405 410 415Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn420 425 430
Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val435 440 445Leu His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His450 455 460Ser Pro Gly Lys Ser Glu Lys Asp Glu Leu465 470<210>72<211>240<212>PRT<213>小鼠<400>72Met Arg Val Leu Leu Val Ala Leu Ala Leu Leu Ala Leu Ala Ala Ser1 5 10 15Ala Thr Ser Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Thr Thr Met Ala Ala20 25 30Ser Pro Gly Glu Lys Ile Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Ile35 40 45Ser Ser Asn Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Phe Ser Pro50 55 60Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Val65 70 75 80Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Gly85 90 95Thr Met Glu Ala Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn100 105 110Ser Ile Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg115 120 125Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln130 135 140
Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr145 150 155 160Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln165 170 175Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr180 185 190Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg195 200 205His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro210 215 220Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys Ser Glu Lys Asp Glu Leu225 230 235 240<210>73<211>10<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>预测的36/41VL的N-端序列<400>73Glu Asn Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile1 5 10<210>74<211>9<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>获得的36/41VL的N-端序列<400>74Val Arg Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile1 5
<210>75<21l>10<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>预测的36/41VH的N-端序列<400>75Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu1 5 10<210>76<211>10<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>获得的36/41VH的N-端序列<400>76Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu1 5 10<210>77<211>10<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>玉米中产生的来自36/41的VL的预测N-端序列<400>77Glu Asn Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile1 5 10
<210>78<211>9<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>玉米中产生的来自36/41的VL的获得的N-端序列<400>78Leu Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile1 5<210>79<211>10<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>玉米中产生的来自36/41的VH的预测N-端序列<400>79Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu1 510<210>80<211>10<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>玉米中产生的来自36/41的VH的获得的N-端序列<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(2)..(2)
<223>第2位的X表示在测序中未获得该残基<400>80Glu Xaa Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu1 5 10
权利要求
1.一种包含牛科CH3结构域的免疫球蛋白重链，其中所述CH3结构域具有至少一种选自S174G，Y179D，G197K，G197A，S207G和T246L的突变。
2.一种包含牛科CH2结构域的免疫球蛋白重链，其中所述CH2结构域具有至少一种选自N85H，R109P，T116L和H126N的突变。
3.一种包含鼠科CH2 CH3结构域的免疫球蛋白重链，其中所述CH2 CH3结构域具有至少一种选自V48T，I64V，K66Q，S104V，S127N，F130L，F176Y，W186S，Q200P，V211L和A224Q的突变。
4.一种包含人类CH2 CH3结构域的免疫球蛋白重链，其中所述CH2 CH3结构域具有至少一种选自K72Q，Y98F，L1 11 Q，S 126N和V202Q的突变。
5.一种分离的多核苷酸序列，其包含编码权利要求1至4中任一权利要求所述免疫球蛋白重链的核苷酸序列。
6.一种增加IgG重链稳定性的方法，该方法包括用权利要求1所述的CH3结构域置换所述IgG重链的CH3结构域。
7.一种增加IgG重链稳定性的方法，该方法包括用权利要求2所述的CH2结构域置换所述IgG重链的CH32结构域。
8.一种增加IgG重链稳定性的方法，该方法包括用权利要求3或4所述的CH2CH3结构域置换所述IgG重链的CH2CH3结构域。
9.一种分离的多核苷酸，其包含与SEQ ID NOs1，3，5，7，9，11，13或15中任何一个序列或其互补序列具有至少90％序列同一性的核苷酸序列。
10.如权利要求9所述的分离的多核苷酸，其包含SEQ ID NOs1，3，5，7，9，11，13或15中任何一个序列或其互补序列。
11.一种分离的多核苷酸，其包含与SEQ ID NOs2，4，6，8，10，12，14或16中任何一个序列或其互补序列具有至少90％序列同一性的核苷酸序列。
12.如权利要求11所述的分离的多核苷酸，其包含SEQ ID NOs2，4，6，8，10，12，14或16中任何一个序列或其互补序列。
13.一种分离的多核苷酸，其包含在严格条件下与权利要求9至12中任一权利要求所述的分离的多核苷酸杂交的至少15个核苷酸。
14.如权利要求9至13中任一权利要求所述的分离的多核苷酸，其中所述的多核苷酸编码抗体或抗体片段的至少一个可变区。
15.如权利要求14所述的分离的多核苷酸，其中所述可变区是重链可变区。
16.如权利要求14所述的分离的多核苷酸，其中所述可变区是轻链可变区。
17.一种分离的多肽，其包含权利要求9至16中任一权利要求所述多核苷酸编码的氨基酸序列。
18.一种重组载体，其包含权利要求9至16中任一权利要求所述分离的多核苷酸。
19.一种表达盒，其包含可操作连接的元件，至少一种启动子，至少一种权利要求9至16中任一权利要求所述分离的多核苷酸和至少一种终止序列。
20.如权利要求19所述的表达盒，其进一步包含内质网保留信号。
21.如权利要求20所述的表达盒，其中内质网保留信号是SEQ IDNO 35。
22.如权利要求19至21中任一权利要求所述的表达盒，其中所述启动子是CMPS启动子或遍在蛋白启动子。
23.一种宿主细胞，其包含权利要求18所述的重组载体，或权利要求19至22中任一权利要求所述的表达盒。
24.如权利要求23所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞选自细菌细胞、真菌细胞、昆虫细胞、酵母细胞、藻类、植物细胞和动物细胞。
25.一种转基因植物，其包含至少一种权利要求9至13中任一权利要求所述的多核苷酸，或它们的组合。
26.如权利要求25所述的转基因植物，其中所述植物表达抗体或抗体片段。
27.如权利要求26所述的转基因植物，其中所述抗体或抗体片段是单链抗体，scFv或VHH抗体。
28.如权利要求27所述的转基因植物，其中所述植物选自玉米、小麦、黑麦、大麦、水稻、燕麦、大豆和烟草。
29.如权利要求26或27所述的转基因植物，其中所述抗体或抗体片段结合K88或K99抗原。
30.一种转基因植物，其包含至少一种权利要求9，10或13至15中任一权利要求所述的多核苷酸，或它们的组合；和至少一种权利要求10至14或16中任一权利要求所述的多核苷酸，或它们的组合。
31.如权利要求30所述的转基因植物，其中所述植物选自玉米、小麦、黑麦、大麦、水稻、燕麦、大豆和烟草。
32.如权利要求30或31所述的转基因植物，其中所述植物表达抗体或抗体片段。
33.如权利要求32所述的转基因植物，其中所述抗体是scFv。
34.如权利要求32或33所述的转基因植物，其中所述抗体结合K88或K99抗原。
35.如权利要求1至4中任一权利要求所述的免疫球蛋白重链，进一步包含权利要求15所述多核苷酸编码的可变区。
36.如权利要求5所述的分离的多核苷酸，进一步包含权利要求15所述的多核苷酸。
37.如权利要求26所述的转基因植物，其中所述抗体或抗体片段进一步包含牛科CH3结构域，其中所述CH3结构域具有至少一种选自S174G，Y179D，G197K，G197A，S207G和T246L的突变。
38.如权利要求26所述的转基因植物，其中所述抗体或抗体片段进一步包含牛科CH2结构域，其中所述CH2结构域具有至少一种选自N85H，R109P，T116L和H126N的突变。
39.如权利要求26所述的转基因植物，其中所述抗体或抗体片段进一步包含鼠科CH2 CH3结构域，其中所述CH2 CH3结构域具有至少一种选自V48T，I64V，K66Q，S104V，S127N，F130L，F176Y，W186S，Q200P，V211L和A224Q的突变。
40.如权利要求26所述的转基因植物，其中所述抗体或抗体片段进一步包含人类CH2 CH3结构域，其中所述CH2 CH3结构域具有至少一种选自K72Q，Y98F，L1 11 Q，S 126N和V202Q的突变。
41.一种包含权利要求5所述的多核苷酸的转基因植物。
42.如权利要求41所述的转基因植物，进一步包含至少一种选自SEQ ID NOs.1-16的多核苷酸。
43.一种治疗或预防动物中肠疾病的方法，该方法包括肠内施用有效量的化合物用于治疗或预防动物中的肠疾病，该化合物含有来源于权利要求25至34或37至42中任一权利要求所述植物的材料或部分纯化材料。
44.如权利要求43所述的方法，其中所述材料包括叶片材料、种子材料、果实材料、根材料、茎材料或任何它们的组合。
45.如权利要求43或44所述的方法，其中所述肠内施用包括口服施用。
46.如权利要求45所述的方法，其中所述材料包含液体。
47.如权利要求43至45中任一权利要求所述的方法，其中所述材料已经被干燥。
48.如权利要求43至47中任一权利要求所述的方法，其中所述有效量包含每天至少10mg抗体。
49.一种组合物，其包含权利要求25至34或37至42中任一权利要求所述的转基因植物，或来源于所述转基因植物的材料。
50.一种药物组合物，其包含权利要求25至34或37至42中任一权利要求所述的转基因植物，或来源于所述转基因植物的材料。
51.如权利要求50所述的药物组合物，其进一步包含药物学可接受的载体、赋形剂或稀释剂。
52.如权利要求49所述的组合物，其中动物饲料包含所述组合物。
53.如权利要求49所述的组合物，其中食品包含所述组合物。
54.如权利要求49所述的组合物，其中动物饲料添加剂包含所述组合物。
55.如权利要求54所述的组合物，其中所述饲料添加剂是预混合的饲料。
56.如权利要求49所述的组合物，其中所述组合物包含营养补剂。
57.一种包含代乳品的组合物，该代乳品包含权利要求25至34或37至42中任一权利要求所述的转基因植物，或来源于所述转基因植物的材料。
58.一种分离的多核苷酸，其编码选自SEQ ID NOs 17，18和67-72的多肽。
59.一种产生抗体或抗体片段的方法，该方法包括i)向植物细胞中引入权利要求19至23中任一权利要求所述的表达盒；ii)表达来源于所述表达盒多核苷酸元件的多肽；和可选地iii)纯化所述多肽；其中所述多肽是抗体或其片段。
60.一种产生抗体或抗体片段的方法，该方法包括i)向植物细胞中引入权利要求19至23中任一权利要求所述的表达盒；ii)从所述植物细胞再生整个植物；iii)在所述整个植物中表达来源于所述表达盒多核苷酸元件的多肽；和可选地iv)纯化所述的多肽；其中所述多肽是抗体或其片段。
全文摘要
本发明涉及植物中抗体和/或其片段的表达，特别地涉及对肠产毒性大肠杆菌(Escherichia coli)具有特异性的抗体和/或其片段的表达。公开了这种抗体和/或片段的核苷酸和氨基酸序列，公开了产生这种抗体和/或片段的方法，表达这种抗体和/或其片段的转基因植物，和利用这种转基因植物或来源于其的材料治疗或预防特别是肠疾病的方法。也描述了增加抗体和其片段稳定性的方法。
文档编号C07K14/415GK1761754SQ200480007043
公开日2006年4月19日 申请日期2004年2月16日 优先权日2003年2月18日
发明者D·布朗, M·坎波斯, B·达尔米亚, S·德马雷斯特, G·汉森, P·B·海费茨 申请人:辛根塔参与股份公司