专利名称：一种基于大肠杆菌的植物抗蒸腾剂的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种基于大肠杆菌的植物抗蒸腾剂的制备方法。
背景技术：
随着全球气候变暖和人类活动的影响，水资源已逐渐成为制约经济社会发展的主要因子之一。农业作为国民经济的基础产业，向来是用水大户。在我国，由于水资源时空分布不均，基础水利设施落后，农业灌溉水分利用率只有40％左右，大大低于美国，以色列等西方发达国家。因此，开发新型植物节水抗旱剂，提高作物植被的水分利用效率，是我国发展节水农业不可获缺的组成部分。到目前为止，商品化的抗蒸腾剂多种多样，就其原理而言，一般分为代谢型和薄膜型两种代谢型抗蒸腾剂主要作用于植物光合代谢途径，诱发气孔关闭，增大气孔阻力，从而减少植物体通过气孔呼吸蒸腾而散失到环境中的水分。这一类型的抗蒸腾剂主要成分有醋酸汞苯，ABA，CaCl2，黄腐酸等。薄膜型抗蒸腾剂，则是通过外源喷施，在植物叶片表面形成一层薄膜，阻碍途经气孔的水分散失，这一类型的抗旱剂有高岭土等。上述两种抗蒸腾剂已经大量应用于生产实践，但同时也暴露出了一系列问题如毒性过大，对环境造成污染(如醋酸汞苯)，造价昂贵(ABA)，水溶性差，黏附力低(如黄腐酸)影响光合同化作用(薄膜型)等等。综上所述，研制生态安全，造价低廉，适用性广和作用明显的新型抗蒸腾剂，具有迫切的需要。本发明采用生物工程常用DH5α型大肠杆菌。菌种来自上海生工生物工程技术服务有限公司，商品编号SD8411。
发明内容
本发明的目的是提供一种生态安全的，价格低廉，适宜大规模生产的基基于大肠杆菌的植物抗蒸腾剂的制备方法。
基于大肠杆菌的植物抗蒸腾剂的制备方法包括如下步骤1)菌剂A的配制将保藏编号为CGMCC1.907大肠杆菌(Escherichia coli)菌株接入灭菌后的液体培养基中，置于37℃摇床振荡培养18～24小时，摇床振荡速度为90～120转/分钟，检测菌液终浓度为109cfu/ml，将培养后的菌液置于高压灭菌锅内，于121℃，0.12～0.15兆帕压力下灭活20～30分钟，待冷却后，涂平板检测细菌活性，若无菌斑出现，无菌封装制成菌剂A；2)辅剂B的配制用无菌水配制辅剂B，辅剂B配方为2.0g/L氯化钙，0.05g/L茉莉酸甲酯；3)将上述菌剂A∶辅剂B按1∶50～100的体积比混匀即可。
所述的液体培养基配方为葡萄糖20.0g/L，酵母膏6.0g/L，蛋白胨6.0g/L，1.5g/L磷酸二氢钾，其余为无菌水，调PH值为7.0。
本发明具有的有益效果是1)基于自然界微生物-植物免疫应答反应机理，采用成熟的工程菌株，经特殊处理后，去除致病性，对环境基本不造成污染，符合生态安全要求。
2)利用现代生物技术手段，可以进行大规模生产，成本低，产量高。
3)作用效果明显，适用范围广，是干旱和半干旱地区农林植物理想的抗蒸腾剂。
图1(a)是拟南芥活体没有喷施抗蒸腾剂的气孔开度示意图；图1(b)是拟南芥活体喷施抗蒸腾剂一小时后，其气孔开度示意图；图2是本发制备的抗蒸腾剂，喷施活体拟南芥，一小时后其气孔开度变化情况示意图。
具体实施例方式
本发明利用了自然界G-(革兰氏阴性)细菌与植物间相互作用的特点。具体而言，自然界中，气孔作为阻挡病原微生物入侵的第一道门户，在植物免疫应答中起到了不可替代的作用(Melotto et al 2006，Plant Stomata Functionin Innate Immunity against Bacterial Invasion，Cell 126，969-980)。革兰氏阴性细菌细胞膜上特有引发子(elicitor)类物质，能够被植物气孔保卫细胞上特异性受体(Pattern Recognize Receptor，PRR)所识别，进而引发气孔关闭以防御微生物入侵。
在表皮条和活体喷施试验上都一致证明，一定浓度和处理的菌剂可以诱发植物气孔开度大幅度下降，进而增大气孔阻力，减少因呼吸蒸腾而丧失的水分，在一定时期内提高了植物的水分利用效率。
实施例11)菌剂A的配制将保藏编号为CGMCC1.907大肠杆菌(Escherichia coli)菌株接入灭菌后的液体培养基中，置于37℃摇床振荡培养18小时，摇床振荡速度为90转/分钟，检测菌液终浓度为109cfu/ml，将培养后的菌液置于高压灭菌锅内，于121℃，0.12兆帕压力下灭活20分钟，待冷却后，涂平板检测细菌活性，若无菌斑出现，无菌封装制成菌剂A；所述的液体培养基配方为葡萄糖20.0g/L，酵母膏6.0g/L，蛋白胨6.0g/L，1.5g/L磷酸二氢钾，其余为无菌水，调PH值为7.0；2)辅剂B的配制用无菌水配制辅剂B，辅剂B配方为2.0g/L氯化钙，0.05g/L茉莉酸甲酯；3)将上述菌剂A∶辅剂B按1∶50的体积比混匀即可。
实施例21)菌剂A的配制将保藏编号为CGMCC1.907大肠杆菌(Escherichia coli)菌株接入灭菌后的液体培养基中，置于37℃摇床振荡培养24小时，摇床振荡速度为120转/分钟，检测菌液终浓度为109cfu/ml，将培养后的菌液置于高压灭菌锅内，于121℃，0.15兆帕压力下灭活30分钟，待冷却后，涂平板检测细菌活性，若无菌斑出现，无菌封装制成菌剂A；所述的液体培养基配方为葡萄糖20.0g/L，酵母膏6.0g/L，蛋白胨6.0g/L，1.5g/L磷酸二氢钾，其余为无菌水，调PH值为7.0；2)辅剂B的配制用无菌水配制辅剂B，辅剂B配方为2.0g/L氯化钙，0.05g/L茉莉酸甲酯；3)将上述菌剂A∶辅剂B按1∶100的体积比混匀即可。
实施例31)菌剂A的配制将保藏编号为CGMCC1.907大肠杆菌(Escherichia coli)菌株接入灭菌后的液体培养基中，置于37℃摇床振荡培养20小时，摇床振荡速度为100转/分钟，检测菌液终浓度为109cfu/ml，将培养后的菌液置于高压灭菌锅内，于121℃，0.13兆帕压力下灭活25分钟，待冷却后，涂平板检测细菌活性，若无菌斑出现，无菌封装制成菌剂A；所述的液体培养基配方为葡萄糖20.0g/L，酵母膏6.0g/L，蛋白胨6.0g/L，1.5g/L磷酸二氢钾，其余为无菌水，调PH值为7.0；2)辅剂B的配制用无菌水配制辅剂B，辅剂B配方为2.0g/L氯化钙，0.05g/L茉莉酸甲酯；3)将上述菌剂A∶辅剂B按1∶80的体积比混匀即可。
本发明的使用方法为使用时，将混合均匀的抗蒸腾剂喷施到植物叶片表面即可。按上述3种实施例配制抗蒸腾剂，在活体拟南芥上喷施，1小时后，如图1(b)所示，大部分气孔开度降低。随机测量50个气孔开度，用平均值和标准差表示，结果如图2所示。
由上面结果可知，本发明能够明显减低气孔开度，达到良好的植物抗蒸腾的效果。
权利要求
1.一种基于大肠杆菌的植物抗蒸腾剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤1)菌剂A的配制将保藏编号为CGMCC1.907大肠杆菌(Escherichia coli)菌株接入灭菌后的液体培养基中，置于37℃摇床振荡培养18～24小时，摇床振荡速度为90～120转/分钟，检测菌液终浓度为109cfu/ml，将培养后的菌液置于高压灭菌锅内，于121℃，0.12～0.15兆帕压力下灭活20～30分钟，待冷却后，涂平板检测细菌活性，若无菌斑出现，无菌封装制成菌剂A；2)辅剂B的配制用无菌水配制辅剂B，辅剂B配方为2.0g/L氯化钙，0.05g/L茉莉酸甲酯；3)将上述菌剂A∶辅剂B按1∶50～100的体积比混匀即可。
2.根据权利要求1所述的一种基于大肠杆菌的植物抗蒸腾剂的制备方法，其特征在于所述的液体培养基配方为葡萄糖20.0g/L，酵母膏6.0g/L，蛋白胨6.0g/L，1.5g/L磷酸二氢钾，其余为无菌水，调PH值为7.0。
全文摘要
本发明公开了一种基于大肠杆菌的植物抗蒸腾剂的制备方法。它包括如下步骤1)菌剂A的配制将来自中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号CGMCC1.907的大肠杆菌菌株接入灭菌后的液体培养基中，置于37℃摇床振荡培养18～24小时，检测菌液终浓度为10
文档编号C12R1/19GK101041812SQ200710066799
公开日2007年9月26日 申请日期2007年1月22日 优先权日2007年1月22日
发明者王根轩, 甘毅, 钱陈, 沈竹夏 申请人:浙江大学