专利名称：抗出血性大肠杆菌o157:h7卵黄抗体生物制剂的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种生物制剂的制备方法，具体是一种抗出血性大肠杆菌O157:H7卵黄抗体生物制剂的制备方法，用于生物工程领域。
背景技术：
出血性大肠杆菌O157:H7能引起人的出血性肠炎、腹泻、溶血性尿毒症等症状，产生细胞毒素，通过食物传播。由于出血性大肠杆菌O157:H7主要致病因子为外毒素，常规抗生素治疗效果不佳。
口服特异性抗体是一种受人关注的方法，它能在人体和动物中建立抗胃肠道病原体的保护性免疫。日益增加的耐抗生素细菌数说明需要寻找抗生素替代物。研究显示，部分抗体经胃蛋白酶和胰蛋白酶消化后仍保持完整，但有相当部分的抗体裂解成Fab、Fab’2和Fc片断。然而，Fab’2和Fab片断仍能与抗原结合，具有中和活性。
经对现有技术的文献检索发现，王忠泽等人在《中国人兽共患病杂志》2002年18卷2期上发表的“抗大肠杆菌O157:H7鸡卵黄抗体的制备及其被动保护作用的研究”一文中，将大肠杆菌O157:H7菌株制备成抗原，免疫鸡，用脱脂、盐析、脱盐、浓缩的纯化技术路线提取免疫球蛋白。该法需对卵黄抗体进行提纯后使用，制备工艺繁琐，成本高。
发明内容
本发明针对现有技术中存在的不足和缺陷，提供一种抗出血性大肠杆菌O157:H7卵黄抗体生物制剂的制备方法，使其将具有生物活性的卵黄抗体制备成无副作用的能直接饮用的口服生物制剂或利于保存的粉剂，该制剂也可作为保健品或生物制药的原料。
本发明是通过以下技术方案实现的，本发明将出血性大肠杆菌O157:H7制成佐剂疫苗免疫无特定病原级供试蛋鸡，用平板凝集试验进行效价测定，当效价达1∶40以上时收集免疫卵，当效价低于1∶40时进行第三次免疫。强化免疫卵黄用对倍无菌水稀释，用乳酸液调pH4.4进行酸处理去除杂蛋白、0.7％邻苯二甲酸羟丙基甲基纤维素处理和-40℃冻融处理，以去除脂质，抽滤液放56℃水浴箱处理30分钟经无菌检验合格后即成安全的口服生物制剂。其出血性大肠杆菌O157:H7 IgY的得率达90％以上，喷雾干燥成粉剂后IgY的活性不受影响。
所述的佐剂疫苗，制备方法如下将出血性大肠杆菌O157:H7菌株培养于营养肉汤中，37℃36小时，按0.4％加入甲醛液，37℃振荡灭活24小时，按10％加入亚硒酸钠-维生素E乳剂、0.4％加入无菌吐温-80液为水相，与无菌油相以1∶1比例在高压乳化泵中乳化，即成出血性大肠杆菌O157:H7佐剂疫苗。
本发明的基本原理是利用家禽作为生物反应器生产各类生物活性物质。当供试鸡免疫后即产生特异性抗体，血液中的抗体逐渐进入卵黄并蓄积。该抗体稳定，经口服后能抵抗胃酸的破坏，活性物质进入肠道后封闭肠粘膜上的特异性病原入侵受体或直接中和特异性病原体或毒素，从而达到预防和治疗的目的。
本发明的有益效益是感染出血性大肠杆菌O157:H7的病人，可直接口服生物制剂替代药物治疗。该方法成本低，见效快，无副作用，不会产生耐药性菌株。
具体实施例方式
结合本发明的内容提供以下实施例实施例1饲养无特定病原级经产蛋鸡，第一次免疫出血性大肠杆菌O157:H7佐剂疫苗，免疫剂量每头份0.5ml。间隔14天进行第二次免疫，免疫剂量为1ml。免疫14天后，用平板凝集试验进行效价测定，当效价达1∶40以上时收集免疫卵，无菌获取卵黄，用乳酸液调pH4.4进行酸处理去除杂蛋白、0.7％邻苯二甲酸羟丙基甲基纤维素处理和-40℃冻融处理，以去除脂质，抽滤液放56℃水浴箱处理30分钟经无菌检验合格备用，或将抽滤液喷雾干燥，粉剂封装保存。其免疫球蛋白的得率达90％以上。
实施例2饲养无特定病原级经产蛋鸡，第一次免疫出血性大肠杆菌O157:H7佐剂疫苗，免疫剂量每头份0.5ml。间隔14天进行第二次免疫，免疫剂量为1ml。免疫14天后，用平板凝集试验进行效价测定，当效价低于1∶40时，进行第三次免疫，免疫剂量为1ml，14天后收集免疫卵，其后抗出血性大肠杆菌O157:H7卵黄抗体生物制剂的制备方法同方案1。
出血性大肠杆菌O157:H7感染病人，每天口服生物制剂，连用2周，能有效防治该病的发生，或制备于保健品中，或用于治疗该病的药物中。
权利要求
1.一种抗出血性大肠杆菌O157:H7卵黄抗体生物制剂的制备方法，其特征在于，将出血性大肠杆菌O157:H7制成佐剂疫苗免疫无特定病原级供试蛋鸡，强化免疫卵黄用对倍无菌水稀释，用乳酸液进行酸处理去除杂蛋白、邻苯二甲酸羟丙基甲基纤维素处理和冻融处理，以去除脂质，抽滤液水浴箱处理，经无菌检验合格后即成安全的口服生物制剂。
2.根据权利要求1所述的抗出血性大肠杆菌O157:H7卵黄抗体生物制剂的制备方法，其特征是，所述的佐剂疫苗，制备方法如下将出血性大肠杆菌O157:H7菌株培养于营养肉汤中，37℃36小时，按0.4％加入甲醛液，37℃振荡灭活24小时，按10％加入亚硒酸钠-维生素E乳剂、4％加入无菌吐温-80液为水相，与无菌油相以1∶1比例在高压乳化泵中乳化，即成出血性大肠杆菌O157:H7佐剂疫苗。
3.根据权利要求1或者2所述的抗出血性大肠杆菌O157:H7卵黄抗体生物制剂的制备方法，其特征是，将出血性大肠杆菌O157:H7制成佐剂疫苗免疫无特定病原级供试蛋鸡，用平板凝集试验进行效价测定，当效价达1∶40以上时收集免疫卵，当效价低于1∶40时进行第三次免疫。
4.根据权利要求1所述的抗出血性大肠杆菌O157:H7卵黄抗体生物制剂的制备方法，其特征是，所述的酸处理，pH值为4.4，邻苯二甲酸羟丙基甲基纤维素为0.7％邻苯二甲酸羟丙基甲基纤维素。
5.根据权利要求1所述的抗出血性大肠杆菌O157:H7卵黄抗体生物制剂的制备方法，其特征是，所述的冻融处理温度为-40℃。
6.根据权利要求1所述的抗出血性大肠杆菌O157:H7卵黄抗体生物制剂的制备方法，其特征是，所述的抽滤液放56℃水浴箱处理30分钟。
全文摘要
一种抗出血性大肠杆菌O157:H7卵黄抗体生物制剂的制备方法，将出血性大肠杆菌O157:H7制成佐剂疫苗免疫无特定病原级供试蛋鸡，强化免疫卵黄用对倍无菌水稀释，用乳酸液进行酸处理去除杂蛋白、邻苯二甲酸羟丙基甲基纤维素处理和冻融处理，以去除脂质，抽滤液水浴箱处理，经无菌检验合格后即成安全的口服生物制剂。本发明的有益效益是感染出血性大肠杆菌O157:H7的病人，可直接口服生物制剂替代药物治疗。该方法成本低，见效快，无副作用，不会产生耐药性菌株。
文档编号A61K39/395GK1660425SQ200410093089
公开日2005年8月31日 申请日期2004年12月16日 优先权日2004年12月16日
发明者刘永德, 徐建雄, 汪毅 申请人:上海交通大学