一种抗菌鸡卵黄复合抗体及其制备方法与应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物抗体免疫技术领域，具体是指一种抗菌鸡卵黄复合抗体及其制备 方法与应用。
【背景技术】
[0002] 目前广谱抗生素在口腔致病菌的灭杀方面还存在较多缺憾，不仅不能实现特异性 灭杀，而且有可能破坏益生菌，长时间使用的话还可能引起菌群失调，产生耐药菌；化学方 法能够破坏口腔致病菌的结构，引起致病菌的死亡，但是对皮肤黏膜具有刺激作用；物理方 法对口腔致病菌具有杀灭作用，但对人体皮肤黏膜有伤害。
[0003] 卵黄抗体是禽类对特定抗原所产生的相应特异性抗体。卵黄抗体是一种天然存 在、无残留、无毒副作用的免疫球蛋白，是抗生素的替代品。目前高免卵黄液广泛应用于一 些疾病的紧急预防和治疗中。
[0004] 现未见专门杀灭口腔致病菌的抗菌鸡卵黄抗体，且现有的制备鸡卵黄抗体的方 法，是通过混合抗原然后进行免疫，从而获得的抗体，但由于母鸡机体存在较大差异，其能 够分离提取的鸡卵黄抗体对单种菌的灭杀效果无法保证，难以实现工业化生产。
[0005] 现有制备卵黄抗体的方法中，所选取的免疫鸡为经过挑选、检查和进行了某些疫 病的预防接种的健康产蛋母鸡，仍存在一些鸡源性的细菌或/和病毒混存于鸡蛋中，进而 影响鸡蛋中的鸡卵黄抗体，如大肠杆菌、沙门氏菌、鸡减蛋综合征病毒、鸡禽白血病病毒 等，很容易影响到抗体的安全性。目前，一些研宄选用带有毒性的甲醛、二乙烯胺（BEI)及 β -丙内酯（BPL)作灭活剂，对鸡卵黄抗体中外源性病毒具有灭活效果，但对鸡卵黄抗体的 活性有影响，非常不利于鸡卵黄抗体发挥效果。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供一种直接作用于人口咽部，可在短时间与口腔致病菌的特 异性病原体结合，能够较长时间有效杀灭特异性口腔致病菌，且安全性能较好，使用人群更 为广泛的抗菌鸡卵黄复合抗体。
[0007] 本发明另一个目的在于提供抗菌鸡卵黄复合抗体的制备方法。
[0008] 本发明还有一个目的在于提供抗菌鸡卵黄复合抗体在抗口腔致病菌方面的应用。
[0009] 本发明通过下述技术方案实现：一种制备抗菌鸡卵黄复合抗体的方法，包括以下 步骤： (1) 分别制备口腔致病菌的免疫抗原，口腔致病菌包括溶血性链球菌、金黄色葡萄球 菌、白色念珠菌、大肠杆菌； (2) 将健康母鸡分群，分别对每群健康母鸡免疫一种口腔致病菌的免疫抗原； (3) 分别收集每群免疫母鸡所产的免疫鸡蛋，并分别对免疫鸡蛋的蛋黄进行提取、纯 化、分离，从而获得各单种菌的抗体原液； (4 )各单种菌的抗体原液按照抗体效价检测进行混合，并配加稳定剂制成抗菌鸡卵黄 复合抗体。
[0010] 本发明的制备口腔致病菌菌灭活后，分别稀释、乳化制成各单种菌免疫抗原；用该 抗原注射免疫产蛋母鸡，获得免疫鸡蛋，经消毒、蛋黄蛋白分离，取蛋黄，水稀释法提取、离 心分离获得水溶性组分，用硫酸铵提取获得各单种菌鸡卵黄抗体粗提物；将粗提物用缓冲 液溶解后，超滤纯化；将超滤液灭活；根据单价抗体效价检测结果，配制多种菌群口腔卵黄 抗体，经除菌过滤后加适量稳定剂制成溶血性链球金黄色葡萄球菌、白色念珠菌大肠杆菌 卵黄抗体成品。本品每毫升含相应特异病原抗体效价不低于1:16。主要用于人口咽部粘膜 的相应病原体的预防。
[0011] 为了更好的实现本发明的方法，进一步地，所述步骤（1)中，制备口腔致病菌的免 疫抗原的具体过程为： (1. 1)从急性扁桃体炎患者炎症部位的咽拭子处获得口腔致病菌，接种于10%的新鲜 羊血的血平板或沙保培养基； (1. 2)通过患者炎症部位症状判断，并经革兰染色形态观察、梅里埃鉴定仪和16SRNA 全长测序确认，口腔中的主要致病菌包括乙型溶血性链球菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠 菌、大肠杆菌； (1. 3)分别扩大培养上述四种口腔致病菌，并调整细菌浓度为2X IO9; (1. 4)将上述四种扩大培养的口腔致病菌均分成两份，一份通过0. 5%甲醛溶液灭活24 小时，另一份采用相应物理方法裂解相应的细菌：①大肠杆菌采用超声破碎法；②乙型溶 血性链球菌采用组织裂解仪共振裂解：2mlEP管中加入菌悬液和50-200 μ m玻珠50 μ g，以 25Hz振动5分钟，共振2-3次；③金黄色葡萄球菌采用研磨破碎；④白色念珠菌采用组织匀 浆器裂解； (1. 5)将灭活和裂解的相同种类的口腔致病菌按1 :1比例混合，即得该种口腔致病菌 的免疫抗原； (1. 6)根据步骤（1. 5)所述，分别获得四种口腔致病菌的免疫抗原。
[0012] 为了更好地实现本发明的方法，进一步地，所述步骤（2)中，母鸡具体的免疫过程 为： (2. 1)在口腔致病菌的免疫抗原中加入等体积弗氏完全佐剂，然后放在组织裂解仪上， 以25Hz的频率共振5分钟，重复两次，对该口腔致病菌的免疫抗原进行乳化，经安全试验、 无菌检验及物理性状检验合格后，制得首次免疫乳化混合液； (2. 2)对健康母鸡进行首次免疫，取初次免疫乳化混合液Iml/只，对健康母鸡的翅基 部三角肌或胸肌等位置用乳化好的免疫抗原进行肌肉、皮下多点注射，以使产蛋母鸡产生 更好的免疫反应； (2. 3)在口腔致病菌的免疫抗原中加入等体积弗氏不完全佐剂，按步骤（2. 1)所述制得 免疫乳化混合液； (2. 4)间隔2、4、6、10周时，取免疫乳化混合液Iml/只，对健康母鸡进行加强免疫。
[0013] 为了更好地实现本发明的方法，进一步地，所述步骤（3)中，对免疫鸡蛋的蛋黄进 行提取、纯化、分离，获得单种菌抗体原液的具体步骤如下： (3. 1)收集获得免疫的母鸡产下的鸡蛋，将免疫后收集的鸡蛋清洗干净、破壳，分离蛋 清蛋黄，去除蛋清，收集蛋黄称取重量； (3. 2)将蛋黄按比例1 :6~9比例加入纯化水稀释匀浆，用lmol/L盐酸溶液调 pH4. 8~5. 5,2~8°C条件下静置1~24小时； (3. 3)静置后用4000~20000r/min离心，去除沉淀物，取上层清液，在其中加入10%~35% 硫酸铵盐析，充分混匀，过夜沉淀； (3. 4)沉淀完成后，对沉淀物用4000~20000r/min离心脱盐后，取沉淀制得卵黄抗体粗 提物，将硫酸按上清液去除； (3. 5)制得沉淀用1/150~1/300体积弱酸性缓冲液复溶，调pH4. 8~5. 5,使其充分溶解， 并保持环境温度2~8°C过夜，取上层清液； (3. 6)制得上清液用截留相对分子量50~100kD超滤膜进行超滤，并进行病毒灭活； (3. 7)灭活后，取其上层清液，剩余悬浊液4000~200(K)r/min离心去沉淀，合并上层清 液，即得单种菌抗体原液，所获得的单种菌抗体原液中鸡卵黄抗体纯度不低于80%。
[0014] 为了更好地实现本发明的方法，进一步地，所述步骤（3. 6)中，病毒灭活过程为，将 需要病毒灭活的溶液放置在温度为54~60°C的环境中，保持8~20小时。
[0015] 为了更好地实现本发明的方法，进一步地，所述步骤（4)中，对获得单种菌抗体原 液进行效价检测的方法为ELISA法。
[0016] 通过上述方法制备的抗菌鸡卵黄复合抗体，包括抗乙型溶血性链球菌鸡卵黄抗 体、抗白色念珠菌鸡卵黄抗体、抗金黄色葡萄球菌鸡卵黄抗体、抗大肠杆菌鸡卵黄抗体。
[0017] 为了更好地实现本发明，进一步地，对抗菌鸡卵黄复合抗体效价进行检测，其中抗 乙型溶血性链球菌鸡卵黄抗体效价多1 :32、抗白色念珠菌鸡卵黄抗体效价多1 :32、抗金黄 色葡萄球菌鸡卵黄抗体效价多1 :16、抗大肠杆菌鸡卵黄抗体效价多1 :16。
[0018] 抗菌鸡卵黄复合抗体在制备口腔致病菌感染引起的相关疾病的制剂中的应用。
[0019] 抗菌鸡卵黄复合抗体在制备预防和\或治疗口腔致病菌感染引起的相关疾病的 药物、保健品、食品添加剂以及饲料添加剂中的应用。
[0020] 本发明的制备的抗菌鸡卵黄复合抗体的灭菌原理为，不同的口腔致病菌有不同的 特异性抗原，如链球菌属的蛋白质抗原是细胞壁成分，具有型特异性，有M、T、R和S等，M与 致病性有关；白色念珠菌属的蛋白质抗原是细胞壁成分，是甘露糖蛋白片段和能用血清学 方法区别开来的两种白色念珠菌血清型；葡萄球菌属的重要抗原有葡萄球菌A蛋白、磷壁 酸和肽聚糖；大肠埃希菌有菌体〇抗原，鞭毛H抗原，荚膜K抗原和包膜抗原等。
[0021] 使用少数几株乙型溶血性链球菌、白色念珠菌、金黄色葡萄球菌及大肠杆菌免疫 产蛋母鸡，此鸡产生的特异性抗乙型溶血性链球菌、白色念珠菌、金黄色葡萄球菌及大肠杆 菌的鸡卵黄抗体就可以不但与免疫的细菌菌株产生特异性抗原一抗体反应，也能够与不同 种和型的具有共同抗原，即共同抗原决定簇的菌株产生抗原一抗体反应。当鸡卵黄抗体与 细菌表面抗原发生抗原一抗体反应时，就能改变细菌表面结构、抑制细菌的一些功能活性、 抑制细菌生长、减少和抑制细菌对细胞的黏附、促进分叶核细胞和巨噬细胞等吞噬细胞对 细菌的吞噬和清除。
[0022] 本发明与现有技术相比，具有以下优点及有益效果： (1)按本发明方法制取的抗菌鸡卵黄复合抗体主要用于杀灭口腔致病菌