人类松弛素-2衍生物以及由其制备人类松弛素-2的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及药物合成技术领域，具体涉及人类松弛素_2衍生物以及由其制备人 类松弛素-2的方法。
【背景技术】
[0002] 人类松弛素-2,通常简称为RLN2,药物名称也被命名为Relaxin，即松弛肽，是人 体内发现的一种多肽激素。人类松弛素-2由两条链组成，A链含24个氨基酸且存在链内 二硫键，B链含29个氨基酸，A链与B链通过两个二硫键相连，其结构式如下：
[0004] 近年来的一系列研究发现，人类松弛素-2对心力衰竭等心血管疾病具有显著的 治疗作用，能够扩张体循环血管、扩张肾脏血管并增加动脉顺应性。美国专利US5166191A 已经公开了人类松弛素用于治疗心血管疾病，尤其是急性和慢性心力衰竭的方法专利。
[0005] 人类松弛素_2的制备方法国内外均有报道，其中Erika E. Bullesbach和 Christian Schwabe公开了一种人类松弛素-2的固相合成方法(参见Erika E. Bullesbach and Christian Schwabe: "Totalsynthesis of human relaxin and human relaxin derivatives by solid-phasepeptide synthesis and site-directed chain combination，'，the Journal of Biological Chemistry, 1991,第 266 卷，第 17 期，第 10754-10761页)。在该方法中，松弛素-2的A链采用Fmoc法合成，B链采用Boc法合成， 合成过程需要采用HF处理两次，并且需要三步进行链的组合，不同的二硫键采用不同的保 护基、不同的脱保护剂，因此操作极其复杂，并且产率很低，以使用的人类松弛素-2的B链 计算，总产率仅为1.4%。可以认为，从经济学上讲，其在大规模生产中不可接受。
[0006] 2010年，Kostas K. Barlos等公开了一种人类松弛素-2的化学合成方法(参见 Kostas K. Barlos等："An optimized chemical synthesis of human relaxin-2，'，Journal of P印tide Science, 2010,第16卷，第4期，第200-211页)。在该方法中，松弛素-2的A 链和B链均采用Fmoc法合成，二硫键的形成采用随机组合法，各个半胱氨酸的侧链采用同 一保护基。这一方法可提高松弛素-2的产率，但产率也仅为48%，且松弛素-2的B链的合 成工艺复杂，不利于工业化生产。
[0007] CN102180964A公开了一种人类松弛素-2的固相合成方法，松弛素-2的A链和B 链均采用Fmoc法合成，但氨基酸侧链采用特殊基团保护，不同半胱氨酸侧链采用交叉保护 基。然而，此类保护基团不易脱除，工业化有一定难度。
[0008] 目前，单链小分子多肽的合成技术已经成熟。虽然松弛素-2的A链和B链的固相 合成已经可以得到较好的收率，但是将A链和B链链接制备松弛素-2的固相合成方法的收 率仍然较低。
【发明内容】
[0009] 本发明针对现有技术中存在的上述缺陷，通过各个半胱氨酸的侧链采用常用的不 同侧链保护基，通过不同氧化方法得到人类松弛素-2的A链衍生物和B链衍生物，从而制 备人类松弛素-2。该方法操作简单、设备要求低，易于工业化生产。
[0010] 为此，本发明一方面提供了人类松弛素_2的A链衍生物A-1，其具有如下所示的结 构，
[0011] pGlu-Leu-Tyr-Ser-Ala-Leu-Ala-Asn-Lys-Cys-Cys(Acm)-His-Val-Gly-Cys-Thr -Lys-Arg-Ser-Leu-Ala-Arg-Phe-Cys-OH0
[0012] 该衍生物A-I的制备方法，包括如下步骤：
[0013] 1、Fmoc-Cys (Trt) -OH和树脂反应，获得Fmoc-Cys (Trt)-树脂，其中树脂优选为 2-CTC树脂；
[0014] 2、Fmoc-Cys(Trt)-树脂采用逐一偶联的方式偶联Fmoc保护基团的其他氨基酸， 获得A链肽树脂；
[0015] 3、A链肽树脂经裂解反应，获得A链衍生物A-I。
[0016] 本发明另一方面提供了人类松弛素-2的A链衍生物A-2,其具有如下所示的结构，
[0018] 该衍生物A-2的制备方法，包括如下步骤：
[0019] 1、按照上述方法制备A链衍生物A-I;
[0020] 2、A链衍生物A-I经氧化获得A链衍生物A-2。
[0021] 本发明另一方面提供了人类松弛素_2的A链衍生物A-3,其具有如下所示的结构，
L0023」 该佑生物A-3的制备万法，包括如卜步骤：
[0024] 1、按照上述方法制备A链衍生物A-2;
[0025] 2、A链衍生物A-2与2, 2' -二吡啶二硫PySSPy反应，获得A链衍生物A-3。
[0026] 在本发明优选的实施方案中，在制备衍生物A-I的步骤2中，所述的Fmoc保护 基团的其他氛基酸分别为 Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Leu-OH、 Fmoc-Ser (tbu)-〇H、Fmoc-Arg(pbf)-〇H、Fmoc-Lys(boc)-〇H、Fmoc-Thr (tbu)-〇H、 Fmoc-Cys (Trt)-〇H> Fmoc-Gly-〇H> Fmoc-Val-〇H> Fmoc-His (trt)-〇H> Fmoc-Cys (Acm)-〇H> Fmoc-Cys (Trt)-〇H、Fmoc-Lys (boc)-〇H、Fmoc-Asn (trt)-〇H、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Leu-OH、 Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ser(tbu)-〇H、Fmoc-Tyr(tbu)-〇H、Fmoc-Leu-OH 和 pGlu-〇H。
[0027] 在本发明优选的实施方案中，在制备衍生物A-I的步骤3中，采用的裂解液为TFA :ΡΗ0Η:PHSME:EDT:H20=80:5:5:2. 5:5 (v:v)〇
[0028] 本发明另一方面提供了人类松弛素-2的B链衍生物B-1，其具有如下所示的结构，
[0029] H-Asp-Ser-Trp-Met-Glu-Glu-Val-Ile-Lys-Leu-Cys(Acm)-Gly-Arg-Glu-Leu-Va I-Arg-Ala-Gln-Ile-Ala-Ile-Cys-Gly-Met-Ser-Thr-Trp-Ser-OH
[0030] 该衍生物B-I的制备方法，包括如下步骤：
[0031] 1、Fmoc-Ser (tbu) -OH和树脂反应，获得Fmoc-Ser (tbu)-树脂，其中树脂优选为 wang树脂；
[0032] 2、Fmoc-Ser (tbu)-树脂采用逐一偶联的方式偶联Fmoc保护基团的其他氨基酸， 获得B链肽树脂；
[0033] 3、B链肽树脂经裂解反应，获得B链衍生物B-I。
[0034] 本发明另一方面提供了人类松弛素_2的B链衍生物B-2,其具有如下所示的结构，
[0036] 该衍生物Β-2的制备方法，包括如下步骤：
[0037] 1、按照上述方法制备B链衍生物B-I;
[0038] 2、B链衍生物B-I与2, 2' -二吡啶二硫PySSPy反应，获得B链衍生物Β-2。
[0039] 在本发明优选的实施方案中，在制备衍生物B-I的步骤2中，所述的Fmoc保护 基团的其他氨基酸分别为 Fmoc-Trp (Boc) -OH、Fmoc-Thr (tbu) -OH、Fmoc-Ser (tbu) -0Η、 Fmoc-Met-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Cys (Trt)-OH、Fmoc-IIe_0H、Fmoc-Ala-OH、 Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Gln (trt) -OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Arg (Pbf)-OH、Fmoc-Val-OH、 Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Glu(OtBu) -OH> Fmoc-Arg(Pbf) -OH>Fmoc-Gly - 0H>Fmoc-Cys(Acm)-OH、Fmoc-Leu - OH、Fmoc-Lys (boc) - OH、Fmoc-Ile - OH、Fmoc-Val - OH、Fmoc-Glu (OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu) - OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Trp (Boc)-OH、Fmoc-Ser(tbu)-OH、 Fmoc-Asp(OtBu)-OH。
[0040] 在本发明优选的实施方案中，在制备衍生物B-I的步骤3中，采用的裂解液为TFA :PHOH:PHSME:EDT:H20=80:5:5:2. 5:5 (v:v)〇
[0041] 本发明另一方面提供了一种制备人类松弛素-2的方法，包括如下步骤：
[0042] 1、按照上述方法制备人类松弛素-2的B链衍生物B-2 ;
[0043] 2、按照上述方法制备人类松弛素-2的A链衍生物A-2 ;
[0044] 3、将步骤1制备的B链衍生物B-2与步骤2制备的A链衍生物A-2反应，获得具 有如下所示的A-B:
[0045]
[0046] 4、步骤3获得的A-B经氧化获得人类松弛素-2粗品；
[0047] 5、步骤4获得的人类松弛素-2粗品经纯化、转盐和冻干后获得人类松弛素-2纯 品。
[0048] 本发明另一方面还提供了另外一种制备人类松弛素-2的方法，包括如下步骤：
[0049] 1、按照上述方法制备人类松弛素-2的A链衍生物A-3 ;
[0050] 2、按照上述方法制备人类松弛素-2的B链衍生物B-I ;
[0051] 3、将步骤1制备的A链衍生物A-3与步骤2制备的B链衍生物B-I反应，获得具 有如下所示的A-B:
[0052]
[0053] 4、步骤3获得的A-B经氧化获得人类松弛素-2粗品