专利名称：细胞松弛素类化合物及其制备方法和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及细胞增殖抑制剂或抗肿瘤剂，具体的说是一种细胞松弛素类化合物及其制备方法和用途。
背景技术：
海洋生物因其所处的高盐、高压、低温、低营养等特殊的生活环境而
产生和积累了许多结构新颖、生物活性显著的次级代谢产物，成为研究发现新型海洋药物的重要资源。而海洋微生物因其可常年人工大规模培养并且代谢过程可被人工调节的特点，相对于其他海洋生物资源而言，又避免了生长季节及自然生物量的限制，不致引起生态破坏，相对易于解决药源问题，因此在生物活性物质研究及后续开发方面具有独特的优势。
内生真菌(Endophytic fungus)是指内共生在宿主体内、但不引起宿主明显致病症状的一类真菌。内生真菌与宿主之间存在着相互依赖的互惠共生关系，在与宿主协同进化的过程中可产生结构新颖、生物活性显著的次生代谢产物，已成为天然活性物质的重要来源。最近几年，随着全世界对海洋生物资源研究的不断深入，海洋真菌由于其资源优势和新颖的次生代谢产物，成为海洋天然产物的研究热点。
发明内容
本发明旨在提供一种细胞松弛素类化合物及其制备方法和用途。为实现上述目的，本发明釆用的技术方案为-.细胞松弛素类化合物，如图(I)中化合物1或2所示
2
(I)
制备方法
1 )将球毛壳菌(Ow"wm'Mm^^o "m)经发酵培养，而后将发酵液经用有机溶液提取2-5次，合并提取液进行浓缩，获得发酵物；
2)将步骤1)中的发酵物经硅胶柱层析，以石油醚-乙酸乙酯和氯仿-
甲醇分别进行梯度洗脱，洗脱下的每个组分经薄层层析检测；
所述石油醚-乙酸乙酯梯度范围为100: 0-0: 100、；氯仿-甲醇梯度范围为100: 10-0: 100;
3 )将步骤2 )中经经薄层层析检测Rf 0. 3-0. 5的洗脱组分进行硅胶柱层析、凝胶柱层析，再经反相柱层析分离纯化，而后以甲醇-水80: 20洗脱，洗脱液经薄层层析检测，展开剂为氯仿甲醇=10: 1, Rf为O. 38并经HPLC分析(甲醇水=55: 45 )保留时间为24. 86分钟即图(I )中化合物1;薄层层析检测展开剂为氯仿甲醇=10: 1, Rf为0. 42并经HPLC分析(甲醇水=55: 45 )保留时间为29. 61分钟为图(I )中化合物2。
步骤1)中所得的发酵培养物为菌丝体和发酵液，发酵液用有机溶剂乙酸乙酯萃取，菌丝体用可用甲醇、丙酮-水(80-20 )、乙醇或氯仿-甲醇l:1中一种或几种萃取，萃取后得到的菌丝体和发酵液合并得发酵物。
所述球毛壳菌(C/w"om/ww g/o6oswm)酵培养，首先将在琼脂-麦芽膏培养基中保存的球毛壳菌接种到PDA平板上，在28。C培养箱中培养4天，其次在平板上取大小为4cm2的菌丝体放入已灭菌盛有300ml液体培养基上静置室温培养30天。所述液体培养基为土豆200 g/L,葡萄糖20 g/L，蛋白胨5 g/L,酵母膏3 g/L, pH 6.5。
细胞松弛素类化合物的应用，可作为细胞增殖抑制剂或肿瘤细胞杀伤剂中应用。同时可作为抑制肿瘤细胞增殖药物或抗肿瘤药物中应用。
本发明所具有的优点
1. 本发明所得的化合物釆用MTT法测试对于A-549细胞株的抗肿瘤活性，试验证明，本发明所得的化合物对肿瘤细胞有增殖抑制作用；其用作细胞增殖抑制剂或肿瘤细胞杀伤剂。
2. 本发明细胞松弛素类化合物从球毛壳菌(C/wetom/ww g/o6o^w)内生真菌中通过人工发酵培养经分离纯化获得。经实验表明化合物对人肺癌细胞株A-549的半数抑制浓度ICso分别2.55, 2.26 ^M,具有抗肿瘤活性，可作为细胞增殖抑制剂或肿瘤细胞杀伤剂。
3. 本发明细胞松弛素类化合物具有细胞增殖抑制以及直接杀伤癌细胞等抗肿瘤活性可用在制备肿瘤细胞增殖抑制剂或抗肿瘤剂中。
具体实施方式
实施例1
细胞松弛素类化合物1或2的化学结构分别是(结构式中的阿拉伯数字式化学结构中的碳原子的标位)
1 2
H
rNH细胞松弛素类化合物的制备方法
1) 生产菌的发酵培养
菌种培养球毛壳菌(Ozaetom/wm g/o6oszw7)菌种以琼脂-麦芽膏培养基，4 。C保存。取球毛壳菌(Owetom/wm g/o6仍ww)接种到PDA平板上，在28。C培养箱中培养4天。
琼脂-麦芽膏培养基为琼脂12g/L,麦芽膏15g/L，海盐24.4g/L, PH7. 4-7. 8。
在平板上取大小为4cm2的菌丝体放入已灭菌盛有300ml液体培养基(土豆200 g/L,葡萄糖20 g/L，蛋白胨5 g/L，酵母膏3 g/L， pH 6. 5 )的容量为1000mL的锥形瓶中，静置室温培养30天。
2) 浸膏的获得将上述经发酵培养后的将发酵液，用纱布将菌丝体和发酵液分离，将发酵液用乙酸乙酯萃取3次合并乙酸乙酯萃取液减压蒸馏得粗浸膏。菌丝体用甲醇浸泡三次减压蒸馏并合并菌丝体和发酵物的浸膏，获得发酵物共45g。
3) 化合物的分离精制
发酵物(45g)进行硅胶柱(200-300目)层析，用石油醚-乙酸乙酯和氯仿-甲醇分别进行梯度洗脱，分别收集洗脱液，洗脱液用薄层层析(TLC)检测，根据Rf值来判断、合并相同或类似部分，薄层层析(TLC)检测时用茴香醛-硫酸作为显色剂，获得14个组分(Fr. l-Fr. 14)。所述石油醚-乙酸乙酯梯度范围为100: 0-0: 100、；氯仿-甲醇梯度范围为100: 10-0:100;
以氯仿-甲醇10: l梯度洗脱下的Rf 0. 3-0. 5，组分为Fr. 12经硅胶柱层析(氯仿甲醇50: 1、 20: 1和10: 1 )和凝胶(氯仿-甲醇1: 1)柱层析，再经反相柱层析，而后以甲醇-水80: 20洗脱，洗脱液经硅胶薄层层析检测，展开剂为氯仿甲醇=10: 1, Rf值为0.38， HPLC分析条件为甲醇水=55: 45，保留时间为24. 86分钟，即图(I )中化合物1 ( 7. 4mg );硅胶薄层层析检测展开剂为氯仿甲醇=10: 1， Rf值为0.42, HPLC分析条件为甲醇水=55: 45,保留时间为29. 61分钟，为图(I)中化合物(3. 0mg) 2。
其结构鉴定为如(I)所示，命名为细胞松弛素类化合物CytoglobosinB化合物1和CytoglobosinC化合物2。(I)
该化合物具有以下理化和波谱特性
化合物1,白色形粉末，比旋光度[a]g +36° (c 0.02, CH3OH); UV(CH3OH;Umax (log s) 289 (4.29), 261 (3.45), 254 (3.46), 223 (4.18), 206 (3.86)nm;红外光谱(KBr) ymax 3376, 1692, 1613, 1447 cm—、核磁共振氢谱和碳谱如表I;ESI质谱m/z 553 [M + Na]+;569 [M + K]+，高分辨ESI质谱m/z553.2659 [M + Na]+, (:321~138]^20^&+计算值为553.2678。
化合物2，白色形粉末，比旋光度[a]^5 -34°(c0.04,CH3OH);UV(CH3OH) zl腿(log s) 290 (3.30)， 279 (3.39)， 222 (4.17), 203 (4.08) ■;红外光谱(KBr) ymax 3443, 3403, 1672, 1454, 1427 cm—1;核磁共振氢谱和碳谱如表I;ESI质谱m/z 537 [M + Na]+; 553 [M + K]+，高分辨ESI质谱m/z 537.2731[M + Na]+， (:3必38!^20^3+计算值为537.2729。
表I化合物1和2的核磁共振氢谱和碳谱(500 MHz, in DMS0 )数据
(5H ( / in Hz)(5H in Hz)
1173.2 s173.3 s
28.31 (s)7,83 (s)
33.33 (m)57.5 d3.30 (m)52.9 d
42,74 (br s)47.7 d2.58 (dd, 2,0, 5.8)48.7 d
125.0 s2.36 (m)34.1 d
6134.5 s138.4 s
3.65 (dd, 7.4, 9.4)67.5 d5.30 (s)126.0 d
849.9 d2.77 (brd, 10.5)45.4 d
960.5 s66.1 s
102.72 (m)， 2.47 (m)31.3 t2.69 (dd, 5.6, 14.3), 2.5333.41
(d，d 7.5, 14.3)
111.54 (s)14.5 q0.71(d, 7.2)13.3 q
121,13 Cs)16.7 q1.62 (s)21.3 q
135.84 (dd, 11.4, 15.3)127.1 d6.12 (dd, 10.5, 15.3)128.8 d
145.00 (m)135.0 d5.04 (ddd, 2.6, 9.8, 15,1)132.0 d
152.24 (m)， 1.63 Cm)39.0 t2.17 (m), 1.72 (m)41.2t
162.53 (m)31.7d2.27 (m)31.5 d
174.65 (d, 10.0)131.6d4,72 (d, 8.8)131.8d
18133.9 s136.1 s
194.05 (br s)78.3 d3.97 (dd, 4.0,7.4)75.3 d
204.52 (br s)75.5 d4.30 (dd， 4.3, 7.4)78.1 d
216.83 (dd,3.3' 15.1)147.9 d6.55 (dd,线15.5)145.6 d
226.57 (dd, 1.9， 15.1)122.8 d6.51 Cd, 15.5)125.0 d
23198.3 s198.3 s
16-Me0.89 (d, 6.5)21.2 q0.88 Cd， 6.7)19.3 q
18-Me1.65 (s)13.5 q1.57 (s)12.8 qr10.87 (s)10.8 (s)
l'a136.1 s133.9 s
2'7.36 (d， 0.87)123.2 d7.07 (d， 2.2)123.7 d
3'110.2 s跳6s
3'a125.9 s127,5 s
4'7.41 (d, 7.9)118.3 d7.42 (d, 7.6)118.0d
5'7,00 Cm)118.0 d6.97 (m)118.3 d
6'7.06 (m)120,9 d7.02 (m)120.7 d
7'7.33 (d, 8.1)110.3 d7.30 (d， 8.1)川.3 d
7-OH4.52 (br s)
12-OH
19-OH5.02 (d, 4.5)
20-OH5.10(d, 4.3)
a)本表信号归属基于DEPT、 'H-C0SY、 HSQC及HMBC图谱解析结果，碳信号的多重度利用DEPT方法确定并分别用s (单重峰)、d(双重峰)、t (三重峰)和q (四重峰)表示。_
~~实施例2
抗肿瘤活性实验人肺癌细胞株A-549可用来评价化合物抗肿瘤活性的强弱，操作简便，重现性好。实验方法
四氮唑盐MTT是一种能接受IT的黄色染料。在活细胞线粒体呼吸链中，琥珀酸脱氢酶和细胞色素C可使MTT的四氮唑环开裂，生成蓝紫色的formazan结晶，而死细胞中不含这种脱氢酶。Formazan结晶的生成量与活细胞数成正比，该结晶的DMSO溶液在570纳米处有最大吸收峰，所以，可通过检测formazan结晶的量来评价药物对细胞增殖的影响。
取对数生长期的肿瘤细胞，将细胞密度调至2"05个细胞/亳升，按每孔200微升接种于96孔细胞培养板中，于37。C通入5%二氧化碳的培养箱中培养4小时。上述实施例1所得的化合物1或化合物2样品分别设定5个浓度梯度l(T8， l(T7， l(T6， 10隱5和l(T4 mol/L，每个浓度设三个平行样，每孔加样品液或空白液各2微升，培养48小时，然后每孔加浓度为5亳克/亳升的MTT液10微升，继续培养4小时，除去上清液。每孔加入DMSO各100微升，在微量震荡器上震荡10分钟，至结晶完全溶解后，酶标仪测定每孔570纳米处的吸光值(OD值)。取三孔平均OD值按IR%= ( OD空白对照-OD样品)/OD空白对照xl00。/。式计算样品对细胞增殖的抑制率(IR%),并计算半数抑制浓度IC5。值。
实验结果
上述获得的化合物1和2对人肺癌细胞株A-549的半数抑制浓度IC5Q为2.55, 2.26 ;/M (参见表2)。
表2化合物1和2对P388肿瘤细胞生长的抑制率浓度mol/Llx10-41x10—1x10"
化合物198.161.32.91.51.0
化合物298.373.56.8U2.7
试验证明可知，化合物1和2对肿瘤细胞有增殖抑制作用可作为细胞增殖抑制剂或肿瘤细胞杀伤剂。
并且从化合物1和2的物化性质可知其可溶于甲醇，也可溶于二甲亚砜或二甲亚砜的含水溶液加以利用。因此化合物1或化合物2可作为抗肿瘤药物中应用。
权利要求
1.一种细胞松弛素类化合物，其特征在于如图(I)中化合物1或2所示
2. —种权利要求1所述的细胞松弛素类化合物的制备方法，其特征在于1 )将球毛壳菌(C7 "e/ow/Mwg/oZ)a^w)经发酵培养，而后将发酵液经用 有机溶液提取2-5次，合并提取液进行浓缩，获得发酵物；2)将步骤1)中的发酵物经硅胶柱层析，以石油醚-乙酸乙酯和氯仿-甲醇分别进行梯度洗脱，洗脱下的每个组分经薄层层析检测；所述石油醚-乙酸乙酯梯度范围为100: 0-0: 100、；氯仿-甲醇梯度范 围为100: 10—0: 100;3 )将步骤2 )中经经薄层层析检测Rf 0. 3-0. 5的洗脱组分进行硅胶柱 层析、凝胶柱层析，再经反相柱层析分离纯化，而后以甲醇-水80: 20洗 脱，洗脱液经薄层层析检测，Rf为O. 38时即图(I)中化合物l; Rf为 0. 42时为图(I)中化合物2。
3. 按权利要求2所述的细胞松弛素类化合物的制备方法，其特征在于 步骤l)中所得的发酵培养物为菌丝体和发酵液，发酵液用有机溶剂乙酸乙 酯萃取，菌丝体用可用甲醇、丙酮-水(80-20 )、乙醇或氯仿-甲醇l: l中 一种或几种萃取，萃取后得到的菌丝体和发酵液合并得发酵物。
4. 按权利要求2所述的细胞松弛素类化合物的制备方法，其特征在于 所述球毛壳菌(C/2aeto脂'wmg/o6oswm)酵培养，首先将在琼脂-麦芽膏培养 基中保存的球毛壳菌接种到PDA平板上，在28。C培养箱中培养4天，其次 在平板上取大小为4cm2的菌丝体放入已灭菌盛有300ml液体培养基上静置 室温培养30天。
5. 按权利要求4所述的细胞松弛素类化合物的制备方法，其特征在于 所述液体培养基为土豆200 g/L,葡萄糖20 g/L,蛋白胨5 g/L,酵母膏3 g/L, pH 6. 5。
6. —种权利要求1所述的细胞松弛素类化合物的应用，其特征在于所述细胞松弛素类化合物可作为细胞增殖抑制剂或肿瘤细胞杀伤剂中应 用。
7. —种权利要求l所述的细胞松弛素类化合物的应用，其特征在于 所述细胞松弛素类化合物可作为抑制肿瘤细胞增殖药物或抗肿瘤药物中应 用。
全文摘要
本发明涉及细胞增殖抑制剂或抗肿瘤剂，具体地说是一种细胞松弛素类化合物及其制备方法和用途。具体化合物1或2如图(I)中所示，具体制备为将球毛壳菌经发酵培养即得到，其可作为细胞增殖抑制剂或抗肿瘤剂。本发明细胞松弛素类化合物从球毛壳菌(Chaetomium globosum)内生真菌中通过人工发酵培养经分离纯化获得。经实验表明化合物对人肺癌细胞株A-549的半数抑制浓度IC<sub>50</sub>分别2.55，2.26μM，具有抗肿瘤活性，可作为细胞增殖抑制剂或肿瘤细胞杀伤剂。
文档编号C07D209/00GK101591288SQ20091001696
公开日2009年12月2日 申请日期2009年6月26日 优先权日2009年6月26日
发明者崔传明, 李晓明, 王斌贵 申请人:中国科学院海洋研究所