专利名称：一种人白血病细胞胞质体的制备及鉴定方法
一种人白血病细胞胞质体的制备及鉴定方法技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种人白血病细胞胞质体的制备及鉴定方法。
背景技术：
细胞质在细胞分化过程中起着决定作用，胞质体(Cytoplast)即去核细胞，是研究线粒体DNA、细胞质膜成分及功能、细胞凋亡、细胞分化等很好的生物模型，也是通过细胞核与细胞质替换实现细胞重构的必备要件。胞质体的制备方法分为侵入性脱核和非侵入性脱核两种，前者是采用显微操作机械去核，适用于体积较大的细胞；后者是在细胞松弛素 (Cytochalasin B, CB)介导下通过离心脱核，适用于体积较小的细胞。CB介导的脱核技术已普遍用于大量胞质体的制备。但针对体外非贴壁生长细胞胞质体的制备该项技术还有诸如预处理方法、脱核介质、脱核温度、胞质体纯化及鉴定等技术环节有待改进。本发明针对这些技术环节，对体外悬浮生长的人白血病细胞HL-60胞质体的制备进行了优化，为进一步实施人白血病细胞胞质体和成体干细胞核质体的细胞重构，探讨白血病细胞胞质在细胞分化过程中的作用奠定了基础。
人白血病细胞胞质体是研究肿瘤细胞线粒体DNA、细胞质膜成分及功能、代谢变化、物质交换等重要的生物模式；另一方面，通过其胞质体与体细胞核进行细胞重构，对阐明细胞质在细胞分化过程中的分子机制具有重要意义。然而，人白血病细胞体外培养呈非贴壁生长，具有高增殖性，大量瘤细胞处于有丝分裂期，单用CB不易脱核，不能获得高收率的胞质体。
制备高纯度的胞质体是实现大量细胞重构和其它后续研究的必要前提。任何通过 CB介导所制备的胞质体都会有未脱核细胞的混杂，为了保证后实验的精准性，胞质体应进一步纯化。但目前未见这方面的介绍。
胞质体的鉴定方法较多，有姬母萨染色、HE染色、Hoechst 33258染色、DAPI染色等，但这些方法存在染色后的胞质体不能用于后续研究，如姬母萨染色、HE染色，或不能直接染色胞质体，如Hoechst 33258染色、DAPI染色。
基于上述人白血病细胞胞质体的制备及鉴定存在的问题，本发明提供一种人白血病细胞胞质体的制备及鉴定方法。发明内容
本发明解决的技术问题是现有人白血病细胞胞质体的制备及鉴定存在的胞质体收率不高，染色后的胞质体不能用于后续研究或不能直接染色胞质体等问题，本发明是提供一种人白血病细胞胞质体制备方法和鉴定方法。
本发明采用的技术方案，本发明的人白血病细胞胞质体的制备方法，包括以下步骤第一，取对数生长期人白血病HL-60细胞，离心后去上清，沉淀用培养基悬浮。取Percoll溶液于离心管中，将上述细胞悬液铺于Percoll溶液面，离心去除白膜层，沉淀用无血清DMEM悬浮，得到纯化的HL-60细胞；
第二，将上述纯化的细胞悬液加入细胞松驰素和秋水酰碱，孵育，离心去除上清，留细胞沉淀；
第三，将细胞沉淀再悬浮于含细胞松驰素的Percoll溶液中，加入超速离心管中配平， 转子提前预热至34°C，水平离心吸弃上清，收集Percoll液面上的部分，加入预冷的DMEM 混勻，离心去除上清，沉淀用DMEM悬浮，再离心去除上清，沉淀用DMEM悬浮，得到胞质体悬液；
第四，将上述的胞质体悬液铺于Percoll液面上，水平离心吸取白膜层，加入DMEM混合，离心除去上清，用DMEM悬浮，得到人白血病细胞胞质体。本发明的人白血病细胞胞质体的鉴定方法，采用荧光双染色鉴定人白血病细胞胞质体向胞质体悬液中加4，6-联脒-2-苯基吲哚二盐酸盐储存液，再加入羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯储存液，混勻，避光孵育，离心去上清；再加入PBS悬浮，离心去上清，此步骤再重复二次，适量PBS悬浮沉淀，将液体移入M孔板，沉降，用荧光显微镜观察结果。本发明达到的有益效果①基于秋水仙碱具有抑制肿瘤细胞有丝分裂作用， 与细胞松驰素联用在34°C条件下离心可明显提高脱核率，人白血病HL-60细胞的脱核率可达90% 93%，明显高于单用CB脱核；②采用38% Percoll密度梯度离心法纯化胞质体其纯度>95%，胞质体直径> 5 ym,脱核前HL-60细胞的平均直径为9. 92 μ m ； ③DNA荧光染料4，6-联脒-2-苯基吲哚二盐酸盐(4 ‘，6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride, DAPI)可穿透活细胞细胞膜与双链DNA结合并产生比DAPI自身强20余倍的蓝色荧光，无明显细胞毒性；胞质蛋白质荧光染料羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯 (5, 6-carboxyflu-orescein diacetate succinimidyl ester，CFSE)是一禾中无细胞毒性焚光染料，经紫外光激发呈绿色荧光，进人细胞后不可逆地与胞内的氨基结合偶联到蛋白质上，不被代谢降解，采用DAPI和CFSE荧光双染色鉴定胞质体有极高区分度，被CFSE嗜染的胞质体可再用于后续的研究；④本发明方法适用于所有体外非贴壁生长肿瘤细胞胞质体的制备及鉴定。
具体实施例方式实施例1
本发明的人白血病细胞胞质体的制备方法，具体包括以下步骤 第一，取对数生长期人白血病HL-60细胞，1000转/分离心5分钟，去上清，沉淀用Iml 培养基悬浮，取42% Percoll溶液3ml于15ml离心管中，将上述细胞悬液小心铺于Percoll 溶液面，20°C，1500转/分离心30分钟，去除白膜层，沉淀用无血清DMEM悬浮至1ml，此为纯化的HL-60细胞；
第二，上述纯化的细胞悬液(5X IO7个细胞//ml)加入CB (终浓度为10yg/ml) 和秋水酰碱(终浓度为5 μ g/ml)，同时设置仅含CB (终浓度为10 μ g/ml)组作为对照， 37°C孵育30分钟。1000转/分离心5分钟，去除上清，留细胞沉淀；
第三，细胞沉淀再悬浮于含10μ g/mlCB的50% Percoll溶液中，加入超速离心管中配平，转子提前预热至34°C，于34°C、20 600转/分水平离心70分钟，吸弃上清(细胞成分)，收集Percoll液面上的部分，按1 :4 (V/V)加入预冷的DMEM混勻，于10°C、2 350转/分离心15分钟，去除上清。沉淀用5ml的DMEM悬浮，于10°C、2 350转/分离心15分钟，去除上清，沉淀用5ml的DMEM悬浮，即为胞质体悬液。通过此步骤，CB联合秋水酰碱组的HL-60 细胞的脱核率达93. 4%，而单用CB组的脱核率仅为75. 5% ；第四，将制备的胞质体悬液体积1.5ml，分别铺于:3ml 38%的Percoll液面上，于20°C、 1490转/分水平离心30min，吸取白膜层，用DMEM按1 :4体积混合，10°C，2 350r/min离心15分钟，除去上清，以适量DMEM悬浮，此为纯化的胞质体，其纯度为95. 4%，而纯化前为 92. 3% ；实施例2本发明的人白血病细胞胞质体的鉴定方法，具体包括以下步骤 荧光双染色鉴定胞质体将上述纯化的胞质体悬液调体积至1ml，每管加DNA荧光染料 4，6-联脒-2-苯基吲哚二盐酸盐(4'，6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride, DAPI)储存液(lmg/ml)50y 1 (终浓度为50μ g/ml)，再加入胞质蛋白质荧光染料羧基荧光素二醋酸盐琥拍酉先亚胺酉旨(5，6-carboxyflu-orescein diacetate succinimidyl ester, CFSE)储存液(δμπιο / ml) 1μ 1 (终浓度为5nmol/ ml)，混勻，37°C避光孵育20分钟，于 10°C, 2 350转/分离心12分钟，去上清，加5mlPBS悬浮，10°C，2350转/分离心12分钟， 去上清，同法重复两次，适量PBS悬浮沉淀，将液体移入M孔板，沉降20分钟，荧光显微镜观察，胞质体嗜染CFSE呈绿色荧光但不显DAPI蓝色，而有核细胞的胞质和核分别呈绿色和蓝色。于倒置荧光显微镜下随机观察5个视野，用测微尺测量胞质体的大小，并计算直径彡5 μ m胞质体的百分比，结果为直径彡5 μ m的胞质体达81. 3%，脱核前HL-60细胞的平均直径为9. 92 μ m。
权利要求
1.一种人白血病细胞胞质体的制备方法，其特征在于包括以下步骤第一，取对数生长期人白血病HL-60细胞，离心后去上清，沉淀用培养基悬浮，取 Percoll溶液于离心管中，将上述细胞悬液铺于Percoll溶液面，离心去除白膜层，沉淀用无血清DMEM悬浮，得到纯化的HL-60细胞悬液；第二，将上述纯化的HL-60细胞悬液加入细胞松驰素和秋水酰碱，孵育，离心去除上清，留细胞沉淀；第三，将上述的细胞沉淀再悬浮于含细胞松驰素的Percoll溶液中，加入超速离心管中配平，转子提前预热，水平离心吸弃上清，收集Percoll液面上的部分，加入预冷的DMEM 混勻，离心去除上清，沉淀用DMEM悬浮，再离心去除上清，沉淀用DMEM悬浮，得到胞质体悬液；第四，将上述的胞质体悬液铺于Percoll液面上，水平离心吸取白膜层，加入DMEM混合，离心除去上清，用DMEM悬浮，得到人白血病细胞胞质体。
2.根据权利要求1所述的一种人白血病细胞胞质体的制备方法得到人白血病细胞胞质体的鉴定方法，其特征在于采用荧光双染色鉴定人白血病细胞胞质体向人白血病细胞胞质体悬液中加4，6-联脒-2-苯基吲哚二盐酸盐储存液，再加入羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯储存液，混勻，避光孵育，离心去上清；再加入PBS悬浮，离心去上清，此步骤再重复二次，PBS悬浮沉淀，将液体移入M孔板，沉降，用荧光显微镜观察结果。
全文摘要
本发明公开了一种人白血病细胞胞质体的制备及鉴定方法，经纯化的人白血病HL-60细胞用细胞松驰素和秋水酰碱处理，在34℃条件下离心脱核，收集胞质体组份经Percoll密度梯度离心法纯化得到纯化的胞质体；采用DAPI和CFSE荧光双染色鉴定胞质体。本发明方法可使非贴壁生长的人白血病HL-60细胞的脱核率达90%以上，纯化的胞质体纯度达95%以上，直径≥5μm的胞质体达81%，嗜染CFSE荧光探针的胞质体可直接用于后续研究；经本发明方法获得的HL-60细胞胞质体可广泛用于白血病细胞胞质成分及其代谢和功能、细胞重构、细胞分化、细胞凋亡等研究；本发明方法适用于所有体外非贴壁生长肿瘤细胞胞质体的制备及鉴定。
文档编号C12N5/09GK102492655SQ20111040458
公开日2012年6月13日 申请日期2011年12月8日 优先权日2011年12月8日
发明者陈代雄 申请人:遵义医学院附属医院