黄连素在制备治疗急性髓系白血病的药物中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于医药领域，具体涉及黄连素在制备治疗急性髓系白血病的药物中的应 用。
【背景技术】
[0002] 白血病又称"血癌"，是造血组织的恶性疾病，其特征为白细胞在骨髓及其他造血 组织中呈恶性、无限制地增生，进而浸润全身各组织和脏器，对机体产生严重损害。根据细 胞的成熟度和自然病程，白血病可分为急性白血病和慢性白血病两大类。急性白血病根据 细胞类型又分为急性淋巴细胞性白血病和急性非淋巴细胞性白血病两大类。急性非淋巴 细胞性白血病又称急性髓细胞白血病，它是多能干细胞或已轻度分化的前体细胞核型发生 突变所形成的一类疾病。急性早幼粒细胞白血病是的一种急性非淋巴细胞性的特殊类型， 而人前髓细胞（HL-60)是一种急性早幼粒白血病细胞系，其不表达多药耐药蛋白p-gp和 MRP，对化疗药物较敏感。急性髓系白血病是成年人常见的一种急性白血病，其发病率随年 龄而增加，美国仅在2012年有将近14, 000名成年人诊断为急性髓系白血病，这一年中大约 10, 〇〇〇名白血病患者失去生命。虽然，大多数年龄小于60岁的初发急性髓系白血病（AML) 可以达到完全缓解，但是只有30-40 %的患者能够长期存活，而年龄超过60岁AML患者中只 有10%至15%、复发的AML患者中仅仅〈10%的患者能够长期存活。因此，新的治疗AML方 案和药物的寻找显得尤为必要。尽管在支持治疗和优化治疗方案的进步，成人急性髓系白 血病的5年生存率也只有20 %至25 %左右。按目前AML治疗水平，有10 %~20 %的患者对 一线标准诱导方案无效，50%~80%已经获得CR的患者早晚（多数在1年内）还要复发， 这是AML治疗失败的主要原因。因此急性髓系白血病（AML)目前仍是白血病治疗上的难点。 国内外对其治疗失败病例进行分析总结，发现急性髓系白血病患者中大部分都存在FLT3 基因突变。现国内外研究发现，FLT3在人类白血病细胞中的表达非常广泛，70% -100%的 AML、100 %B系急性淋巴细胞白血病、27 %的T系急性淋巴细胞白血病、混合性白血病、慢粒 急变期（CML)和慢性淋巴细胞白血病都有FLT3的异常表达，其中20%~25%的AML的患 者FLT3基因发生FLT3-ITDS基因突变，并见于AML各亚型，其中以M3和M5多见。FLT3异 常表达包括野生型FLT3的过表达和FLT3基因突变，这类患者临床上多存在有高白细胞综 合症、缓解率低、复发早等特点。因此，对FLT3的突变引起的急性髓系白血病药物研究如火 如荼，但成功药物尤其少见。
[0003] 黄连素其作为中药治疗消化道疾病用药已有3000多年的历史。研究发现，黄连素 具有明显的抗肿瘤作用，对许多肿瘤细胞的生长、增殖都有抑制作用，目前依然主要用于消 化道系统的疾病。国内外研究表明，黄连素具有的能力诱导早幼粒细胞白血病HL-60细胞 凋亡，表明黄连素对未发生FLT3突变的HL60 (人急性早幼粒白血病细胞）细胞系有一定的 抑制。但目前对黄连素在FLT3突变引起的急性髓系白血病研究几乎近于空白。鉴于黄连 素来源广泛、价格低廉，加之毒副作用小，如能对其相关药理效应及其作用机制进行深入研 究，有望为难治性急性髓系白血病的治疗提供一种有效、安全、价廉的新型药物。
【发明内容】
[0004] 有鉴于此，本发明的目的在于提供黄连素在制备治疗急性髓系白血病的药物中的 应用，开辟了黄连素作为药物的新用途，也为难治性急性髓系白血病治疗提供新的途径，从 而为难治性急性髓系白血病的治疗提供一种新的有效、安全、价廉的新型药物。
[0005] 为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：
[0006] 黄连素在制备治疗急性髓系白血病的药物中的应用。
[0007]目前黄连素主要应用于抗感染、肿瘤、调整血脂血糖以及抗动脉硬化炎症反应，为 了方便服用，通过现阶段常用药物制剂手段可以将黄连素按照药学上的常规工艺，添加常 规辅料制成药学上可接受的口服制剂或注射制剂，可以是片剂、胶囊、散剂、口服液或颗粒 剂。也可以与药学上的治疗急性髓系白血病药物等制成复方制剂，用于治疗急性髓系白血 病。
[0008] 更优选的，所述急性髓系白血病为FLT3的突变引起的急性髓系白血病。
[0009] 本发明通过以下方法研究黄连素在难治性急性髓系白血病过程中的抑制作用，寻 找黄连素在难治性急性髓系白血病领域旧药新用的研究依据：
[0010] 通过难治性急性髓系白血病（FLT3突变）标准细胞系MV-41模型，通过体外细胞 形态学，细胞增殖活性和细胞周期的影响，表明黄连素在急性髓系白血病过程中的抑制作 用，能够用于治疗急性髓系白血病。
[0011] 通过难治性急性髓系白血病患者分离的细胞，通过增殖活性影响，表明黄连素对 急性髓系白血病有抑制作用。
[0012] 通过难治性急性髓系白血病分离MV-41细胞接种老鼠动物模型，也表明了黄连素 在难治性急性髓系白血病的抑制作用。因此，黄连素还能用于制备抑制急性髓系MV-41细 胞的药物。
[0013] 本发明的有益效果在于：本发明公开了黄连素在制备治疗急性髓系白血病的药物 中的应用，急性髓系白血病患者提供了新的治疗方案。与现有的临床上用于治疗急性髓系 白血病的阿胞糖苷相比，对细胞抑制率、凋亡率均更好。并且黄连素为祖国传统中药，成本 较低，副作用小，为急性髓系白血病患者带来福音。
【附图说明】
[0014] 为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图：
[0015] 图1为黄连素素抑制MV-41作用24h后光学显微镜图（100倍）。
[0016] 图2为黄连素素抑制MV-41作用48h后光学显微镜图（100倍）。
[0017] 图3为黄连素素抑制MV-41作用12和24小时抑制率柱形图。
[0018] 图4为黄连素素抑制MV-41作用48、72、96小时抑制率柱形图。
[0019] 图5为黄连素素抑制MV-41作用24h，48h和72h抑制率柱形图。
[0020] 图6为FSC-H对不同黄连素作用MV-41检测结果图。
[0021] 图7为Comp-FLl-H对不同黄连素作用MV-41检测结果。
[0022] 图8为不同浓度黄连素对MV-41细胞作用48的细胞凋亡检测结果。
【具体实施方式】
[0023] 下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体 条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。
[0024] 实施例1、黄连素对难治性急性髓系白血病标准细胞系MV-41的形态学影响
[0025] 本实施例使用的实验材料如下：MV-41细胞系（难治性急性髓系白血病细胞） 购自美国ATCC;黄连素（Berberine，含量98.5% )购自陕西大地制药公司，生产批号为 20111016;阿胞糖苷（Cytarabine)购自辉瑞制药有限公司；DMEM培养基购自GIBCO公 司；胎牛血清购自浙江天杭生物科技有限公司；NaHC03购自上海久亿化学试剂有限公司， Cat.No. 11810-033 ;胰蛋白酶、EDTA、青霉素G钠盐、链霉素硫酸盐购自AMRESC0公司；无 水乙醇购自重庆川东化工有限公司；PBS购自北京中杉金桥生物技术有限公司；莱卡倒置 显微镜购自德国Leica公司，型号为DMIL5CO2培养箱购自FORMA公司，型号为3111 ;超净 台由苏净集团安泰公司制造，型号为SW-CJ-ZFD;纯水仪购自美国Spring公司，型号为S/ N020579 ;精密移液器购自法国吉尔森公司，型号为P2 ;电子天平购自德国赛多利斯有限公 司，型号为BT323S;全自动高压灭菌锅购自日本SANYO公司，型号为MLS-3020 ;台式电热 鼓风干燥箱购自上海精密实验设备公司，型号为DHG9123A;冰箱购自西门子公司，型号为 KG18V21TI;液氮罐购自CBS公司，型号为2001 ;低速离心机购自上海安亭科学仪器厂，型号 为KA-1000 ;0? 2ym滤器购自MILLIP0RE公司，型号为SLGP033RB;Icm培养皿购自NEST公 司、96孔培养板购自Costar公司；细胞计数板；离心管、移液管、Tips若干。
[0026] 实验方法：准确称取0. 2g黄连素，溶于IOml生理盐水中，用0. 2ym滤器过滤后用 500y1离心管分装，得黄连素储备液，然后-20°C存储，备用。使用前将黄连素储备液分别 配制为含 1〇〇yg/ml、200yg/ml、400yg/ml、800yg/ml、1000yg/ml、2000yg/ml黄连素 的0. 9%氯化钠水溶液，同时配制含2000yg/ml阿糖胞苷的0. 9%氯化钠水溶液。将MV-41 细胞系用DMEM+10%FBS于37°C、5%CO2进行常规培养（10cm培养皿），当细胞生长至对数 期时，收集细胞，弃去培养液，PBS轻洗3遍，然后加入3ml含0. 25 % (wt)胰蛋白酶和0. 04% EDTA(