急性髓系白血病miRNA标记物的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物医药领域，涉及一种急性髓系白血病miRNA标记物及其应用。
【背景技术】
[0002] 急性髓系白血病（acute myeloid leukemia，AML)是一组高度异质性疾病，其发 生发展是一个多基因改变和多步骤的过程，目前确诊时细胞遗传学异常已成为AML常用的 临床预后指标，但传统细胞遗传学尚存在一些缺陷，分子遗传学的改变对预后的意义日趋 重要。近年来，AML发病率呈逐渐上升的趋势，尽管现有治疗方法使患者完全缓解率可达 50 %~70 %，但该病病死率仍较高，对不同患者实施个体化分层治疗成为首要问题。综合研 究基因对AML发生发展的作用及其预后影响，有助于探寻有效的抗白血病血管生成治疗靶 点，从而进一步指导临床个体化治疗。虽然已有某些专利研究利用基因或蛋白标志物对患 者进行分类，但是这种分类仅依据mRNA和蛋白表达的差异，具有一定的局限性，结合miRNA 所显示的表达情况，将会进一步丰富基因表达谱，为急性髓系白血病提供更明确的诊断和 预后手段。
[0003] miRNA是天然存在于体内的21-22nt的非编码RNA分子，是一类通过转录后基因沉 默对靶基因表达进行调节的RNA。据估计，生物体内约有1/3的基因受miRNA的调控。miRNA 与RISC的复合体通过碱基配对可与靶基因mRNA 5' -UTR或者3' -UTR中的互补序列相结 合，抑制蛋白质翻译，或是引发mRNA降解，从而负调控靶基因的表达。
[0004] 检测miRNA的表达水平可以为癌症的临床诊断提供参考。而miRNA的异常表达直 接导致一些与疾病发生相关基因的表达异常，诱发癌症的发生。已有报道证明miRNA可以 通过调控靶基因mRNA的表达，在急性髓系白血病中起重要作用。在未来临床治疗中，miRNA 不仅可以成为新的急性髓系白血病早期诊断和疾病进程相关的标记物，而且也有望通过改 变miRNA的表达或者其靶基因的表达治疗急性髓系白血病等疾病。寻找和鉴定与急性髓系 白血病发生相关的miRNA及其靶基因为miRNA的临床治疗提供基础。
【发明内容】
[0005] 为了弥补现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种可用于诊断急性髓系白血 病的miRNA标记物。相比传统的急性髓系白血病的诊断方法，使用miRNA标记物来诊断急 性髓系白血病具有及时性、灵敏性，从而使患者在疾病早期就能知晓疾病风险，从而采取相 应的预防和治疗措施。
[0006] 为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
[0007] 本发明提供了 miRNA-1262在制备诊断急性髓系白血病的产品中的应用，所述 miRNA-1262 选自以下组中的至少一种：miRNA-1262 初始 miRNA、miRNA-1262 前体 miRNA、 成熟miRNA-1262 ;所述miRNA-1262初始miRNA能在人细胞内被剪切并表达成成熟 miRNA-1262 ;所述miRNA-1262前体miRNA能在人细胞内被剪切并表达成成熟miRNA-1262。
[0008] 进一步，所述miRNA-1262是成熟miRNA-1262,核苷酸序列如序列表中的SEQ ID NO. 1所示。
[0009] 应当知道，本发明的miRNA-1262包括组成型核酸分子的功能等同物，即变体，其 显示完整miRNA-1262核酸分子相同的功能，它们可能通过核苷酸残基的缺失、置换或者插 入而突变。
[0010] 本领域人员熟知，为了保证miRNA的稳定性，可以在miRNA的一端或者两端增加保 护性碱基，如TT，也可对miRNA碱基进行修饰，但是不影响miRNA的功能。因此，本领域技术 人员熟知，在不影响miRNA-1262功能的条件下，对miRNA-1262进行碱基修饰或者在两端增 加碱基获得的序列同样包含在本发明的保护范围之内。
[0011] 在本发明的一些具体的实施方式中，所述miRNA-1262是成熟miRNA-1262。
[0012] 虽然在某些【具体实施方式】中所使用的是成熟miRNA-1262,但是本领域技术人员可 以预期，初始miRNA(pri-miRNA-1262)、前体miRNA(pre-miRNA-1262)将可以获得与成熟 miRNA-1262同样的技术效果，因为细胞有能力进一步将初始miRNA (pri-miRNA-1262)、前 体 miRNA (pre-miRNA-1262)加工为成熟 miRNA-1262〇
[0013] 本发明的miRNA-1262核酸分子可以以单链或双链的形式存在。成熟的 miRNA-1262主要呈单链形式，而miRNA-1262前体是部分自互补的，以形成双链结构。本发 明的核酸分子可以是RNA、DNA、PNA、LNA的形式。
[0014] 本发明提供了 miRNA-1262在高通量测序平台中的应用。通过高通量测序能获知 待检测样本中miRNA-1262的表达水平，将待测样本的结果同健康人的样本相比，容易判断 待测样本是否患有急性髓系白血病以及患急性髓系白血病的风险。因此，通过高通量测序 获得miRNA-1262表达水平与急性髓系白血病相关性的应用同样包含在本发明的保护范围 之内。
[0015] 本发明提供了一种诊断急性髓系白血病的产品，所述产品能够通过检测 miRNA-1262的表达水平来诊断急性髓系白血病。
[0016] 进一步，上面所述的产品包括芯片或试剂盒。其中，所述芯片包括固相载体；以及 固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括特异性地对应于上面所述 的miRNA-1262的部分或全部序列。所述试剂盒包括用于检测上面所述的miRNA-1262的表 达水平的试剂。
[0017] 进一步，上面所述的寡核苷酸探针还可包括针对现有技术中已经报道的可用于诊 断急性髓系白血病的miRNA的寡核苷酸探针。将多种miRNA的检测探针放置在同一芯片上 通过检测多种miRNA指标联合诊断急性髓系白血病的情况也包含在本发明的保护范围之 内。
[0018] 进一步，所述固相载体包括所述固相载体可采用基因芯片领域的各种常用材料， 例如但不限于尼龙膜，经活性基团（如醛基、氨基等）修饰的玻片或硅片、未修饰的玻片、塑 料片等。
[0019] 所述的miRNA芯片的制备可采用本领域已知的生物芯片的常规制造方法，例如， 如果固相载体采用的是修饰玻片或硅片，探针的5'端含有氨基修饰的聚dT串，可将寡 核苷酸探针配制成溶液，然后采用点样仪将其点在修饰玻片或硅片上，排列成预定的序 列或阵列，然后通过放置过夜来固定，就可得到本发明的miRNA芯片。如果核酸不含氨 基修饰，则其制备方法也可参照：王申五主编的《基因诊断技术-非放射性操作手册》； J. L. erisi, V. R. Iyer, P. 0. BROWN. Exploring the metabolic and genetic control of gene expression on a genomic scale. Science，1997 ;278:680和马立人，蒋中华主编?生 物芯片.北京：化学工业出版社，2000,1-130。
[0020] 进一步，所述检测miRNA-1262表达水平的试剂包括针对miRNA-1262的引物和/ 或探针。所述试剂还包括针对现有技术中已经报道的诊断急性髓系白血病miRNA的引物和 /或探针。将多种miRNA的检测引物和/或探针放置在同一试剂盒中通过检测多种miRNA 指标联合诊断急性髓系白血病的情况也包含在本发明的保护范围之内。
[0021] 本发明的miRNA-1262可以是天然的或是人工合成的，或者使用可以表达 miRNA-1262的DNA片段的载体转染细胞获得。所述载体包括病毒载体、真核表达载体。
[0022] 病毒载体可以是任何适当的载体，包括但不限于逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺 病毒相关病毒载体、疱疹病毒（例如单纯疱疹病毒、痘苗病毒及EB病毒）载体、甲病毒载 体。
[0023] 真核表达载体可以是任何适当的表达载体，包括但不限于pCMV-Myc表达载体、 pcDNA3. 0表达载体、pcDNA3. 1表达载体、pEGFP表达载体、pEF Bos表达载体、pTet表 达载体、PTRE表达载体、或者在公知表达载体的基础上经改造的载体，比如pBin438、 PCAMBIA1301 等。
[0024] 可以表达miRNA-1262的DNA片段可以通过如下方式获取：从miRNA数据库中 (http: //microrna. sanger. ac. uk/sequences/)寻找 miRNA-1262 在基因组上的位置及 具体序列信息，根据基因组序列确定miRNA-1262初始miRNA的位置，在miRNA-1262初始 miRNA位置的上下游500-800bp区间内设计特异性引物，扩增引物中间的序列即可获得表 达 miRNA-1262 的 DNA 片段。
[0025] 本发明提供了上面所述的miRNA-1262在制备治疗急性髓系白血病药物中的应 用。
[0026] 进一步，所述药物包含miRNA-1262抑制剂。所述的miRNA-1262抑制剂能够抑制 miRNA-1262的表达或者能够抑制miRNA-1262的功能。所述miRNA-1262抑制剂的抑制靶标 不限于miRNA-1262本身，还包括miRNA-1262的上下游，例如：编码miRNA-1262的基因组序 列，miRNA-1262靶基因、调控miRNA-1262的蛋白或者基因。
[0027] 进一步，m