一种籽粒苋的绿色组织特异启动子及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于分子生物学及基因工程技术领域，具体涉及一种籽粒苋的绿色组织特异启动子及其应用。
【背景技术】
[0002]控制转基因在植物体内按照人们的设计表达是安全转基因的关键点。转基因的表达部位、表达水平受其上游的一段DNA序列，即启动子的控制。现在转基因研究中主要使用组成型启动子。组成型启动子驱动转基因在植株的所有部位持续恒定表达。在非必需部位的表达，额外消耗了植物的营养和能量，产生的异源蛋白质或代谢产物，可能干扰植物原有的代谢平衡。在食用部位的表达，还易引起民众食用安全性疑虑，迟滞转基因品种的推广种植。另外，在转基因研究中，不同的基因使用相同的启动子，或转基因所用的启动子与受体植物中已有的启动子相同，还易引起同源抑制，影响转基因的高效表达。
【发明内容】
[0003]本发明的目的是，提供一种新型的组织特异启动子及其应用。该启动子是一种籽粒苋的绿色组织特异启动子，它与现有的启动子的序列不同，它驱动外源基因只在绿色组织中表达，能避免在其它非绿色组织的表达产生的对植物养分和能量的过度消耗，将其用于以籽粒为主要收获产物的作物，如小麦、玉米、水稻等主要农作物，或用于以地下薯块为主要收获产物的作物，如马铃薯、甘薯等作物，让抗除草剂、抗虫等外源基因只在茎叶等绿色部分表达，在籽粒和地下薯块中不表达，以提高转基因作物的安全性。
[0004]本发明由如下技术方案实现的:一种籽粒苋的绿色组织特异性启动子，所述籽粒苋的绿色组织特异性启动子为ProAhPEPC，其核苷酸序列为:SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列。
[0005]本发明还提供一种表达盒，利用上述籽粒苋的绿色组织特异启动子ProAhPEPC与目的基因连接所构建而得。
[0006]本发明还提供一种表达载体，利用所述籽粒苋的绿色组织特异启动子ProAhPEPC构建而得。植物表达载体为pCAMBIA3301-ProAhPEPC-GUS，构建方法为:
将含有籽粒苋的绿色组织特异启动子的T载体用Bgl II和PstI双酶切，从酶切产物中回收启动子片段，同时用Bgl II和PstI双酶切植物表达载体pCAMBI3301，回收Ilkb的载体片段；将回收的启动子片段和载体片段用T4 DNA连接酶连接，使籽粒苋的绿色组织特异启动子取代PCAMBI3301载体上驱动⑶S基因表达的CaMV35S启动子。
[0007]本发明还提供了籽粒苋的绿色组织特异启动子ProAhPEPC在制备转基因植物的应用。所述植物为以籽粒为主要收获产物的作物或以地下根、茎为主要收获产物的作物。
[0008]所述载体为植物表达载体，例如植物双元表达载体等。所述重组表达载体具体可为将所述启动子核苷酸序列插入质粒PCAMBIA3301的多克隆位点得到的重组质粒。可用现有的表达载体构建含有所述启动子的重组表达载体。为了便于鉴定及筛选，可对所用表达载体进行加工，如加入编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因、具有抗性的抗生素标记物或是抗化学试剂标记基因等。
[0009]本发明还提供含有上述表达盒或载体的宿主细胞。所述宿主细胞为农杆菌LBA4404细胞和大肠杆菌ToplO细胞。
[0010]本发明还提供籽粒苋的绿色组织特异启动子在调控下游基因表达中的应用，优选下游基因为⑶S基因。
[0011]本发明还进一步提供籽粒苋的绿色组织特异启动子在制备转基因植物中的应用。例如，可以将抗病、抗虫等基因可操作地连接到籽粒苋的绿色组织特异启动子下游，构建得到表达盒，进一步将该表达盒插入到植物表达载体，将获得的重组表达载体通过比如，农杆菌介导、基因枪法等方式转化植物，获得转基因植物。
[0012]使用本发明的籽粒苋绿色组织特异性启动子驱动外源基因只在绿色组织中表达，将其用于玉米、水稻等以籽粒为主要收获产物的作物，或马铃薯、甘薯等以地下根、茎为主要收获产物的作物中，让抗除草剂、抗虫等外源基因只在茎叶等绿色部分表达，而不在籽粒或地下薯块等食用部分表达，以提高转基因作物的安全性。
【附图说明】
[0013]图1为本发明实施例1中籽粒苋绿色组织特异启动子的染色体步移结果图，图中M为DNA分子量标准DL5000，I为染色体步移产物；图2为本发明实施例1中籽粒苋绿色组织特异启动子连接到PSURE-T载体上用PstI酶切鉴定结果图，图中M为DNA分子量标准DL5000，I为籽粒苋绿色组织特异启动子连接到pSURE_T载体上用PstI酶切后的产物；图3为本发明实施例2中初始表达载体pCAMBIA3301结构示意图；图4为本发明实施例2中带有籽粒苋绿色组织特异启动子的表达载体PCAMBIA3301-ProAhPEPC-GUS的结构示意图；图5为用Bgl II和PstI对籽粒苋绿色组织特异启动子的表达载体pCAMBIA3301-ProAhPEPC-GUS的双酶切鉴定图，M为DNA分子量标准 DL5000，I 为 pCAMBIA3301-ProAhPEPC-GUS 用 Bgl II 和 PstI 双酶切后的产物；图6为转pCAMBIA3301-ProAhPEPC-GUS的烟草PCR检测鉴定图，M为DNA分子量标准DL2000, -CK为非转基因植株，+CK为载体pCAMBIA3301-ProAhPEPC-GUS，1-3为携带有籽粒苋绿色组织特异启动子的不同转基因株系；图7为转pCAMBIA3301-ProAhPEPC-GUS的马铃薯PCR检测鉴定图。M为DNA分子量标准DL2000，-CK为非转基因植株，+CK为载体pCAMB I A3 301 -ProAhPEPC-GUS，I _7为携带有籽粒苋绿色组织特异启动子的不同转基因株系O
【具体实施方式】
[0014]以下结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
[0015]若未特别指明，本发明以下实施例所使用的分子生物学和生物化学方法均为本领域技术人员所熟知的常规方法。
[0016]实施例1:籽粒苋绿色组织特异启动子的克隆根据克隆的籽粒苋磷酸稀醇式丙酮酸羧化酶基因的核苷酸序列(GenBank登陆号:HQ186302)，设计合成染色体步移所要求的三条特异性引物:
引物 SPl:5' -ATCAAGTTTCCCAGCTCCTCC-3' (SEQ ID N0.2)；
引物 SP2:5' -GGAAACGATCAAGCAACAAAGC-3' (SEQ ID N0.3)；
引物 SP3:5' -GATGCCATTTTCTCCAACTTCC-3' (SEQ ID N0.4)。
[0017]以籽粒苋基因组DNA为模板，进行染色体步移，步移步骤如下:
(I)第一步
①按下列组份配制PCR反应液:
籽粒苋DNAI μ L
dNTP Mixture (2.5 mM each )8 μ L
10XLA PCR Buffer II (Mg2+ plus)5 yL
TaKaRa LA Taq 酶(5 U/μ I)0.5 μ L
简并引物(100 pmol/μ I)I μ L
引物 SPl (10 pmol/μ I)I μ L
ddHoO_33.5 u L
总计50 μ L
②进行PCR反应，反应程序如下:
94°C I min ；98°C I min ；
94°C 30 sec,68°C 2min，72°C 2 min ；5 Cycles ；
94°C 30 sec, 25°C 3 min，72°C 2min ；
94°C 30 sec,68°C I min，72°C 2min，94°C 30 sec,68°C I min，72°C 2min，94°C 30sec,44°C I min ；72°C 2 min ；，15 Cycles ；
72°C 10 min。
[0018]反应完毕，将PCR反应液稀释100倍。
[0019](2)第 2 步
①按下列组份配制PCR反应液:
第I步的PCR反应液的稀释液I μ L
dNTP Mixture (2.5 mM each )8 μ L
10XLA PCR Buffer II (Mg2+ plus)5 yL
TaKaRa LA Taq 酶(5 U/μ I)0.5 μ L
简并引物(100 pmol/μ I)I μ L
引物 SP2 (10 pmol/μ I)IyL
ddHoO_33.5 u L
总计50 μ L
②进行PCR反应，反应程序如下:
940C 30 sec, 680C I min，72°C 2min，94°C 30 sec,68°C I min，72°C 2min，94°C 30sec,44°C I min,72°C 2min ；15 Cycles ；
72°C 10 min。
[0020]反应完毕，将PCR反应液稀释100倍 (3)第3步
①按下列组份配制PCR反应液。
[0021]第2步的PCR反应液的稀释液I μ L dNTP Mixture (2.5 mM each ) 8 μ L 10XLA PCR Buffer II (Mg2