CRISPR-Cas9特异性敲除猪GGTA1基因的方法及用于特异性靶向GGTA1基因的sgRNA的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及基因敲除技术领域，具体涉及 CRISPR-Cas9特异性敲除猪GGTA1基因的方法及用于特异性靶向GGTA1基因的sgRNA。
【背景技术】
[0002] 器官移植是治疗器官衰竭疾病最有效的治疗手段。迄今为止，全球已有近百万的 患者通过器官移植而延续生命。随着人口老龄化及医疗技术的进步，需要进行器官移植手 术的病人越来越多，但供体器官的短缺严重制约了器官移植手术的开展。以肾脏移植为例， 我国每年需要进行肾移植的患者多达30万，而可用于移植的捐献肾脏不超过1万例，大部 分患者死于肾衰竭。依靠死后器官捐献已不能满足器官移植的需要。通过基因工程改造其 他物种，以提供合适于人体移植的器官，成为解决人类供体器官短缺问题的主要途径。
[0003] 目前，根据生物安全性、生理功能指标、经济性及稀有物种保护等多方面评价，猪 成为了最为理想的异种器官来源。但猪和人之间存在巨大的差异，直接将猪的器官移植到 人会产生强烈的免疫排斥反应。因此，通过基因工程对猪进行改造，以产生适合于人体移植 的器官，成为异种移植的终极目标。
[0004] 免疫学的研究发现猪的细胞表面表达一种糖类化合物：α-l，3-半乳糖化合物 (α -1，3_Gal)。它的合成依赖于 α -半乳糖苷转移酶 1 (alpha-galactosyltransferase 1， GGTA1)。人类细胞由于缺乏有功能的GGTA1基因，不能合成α-1，3_半乳糖化合物。而在 细菌及非灵长类动物中该类化合物广泛存在。人体在体内细菌的刺激下会大量产生针对 α-1，3_半乳糖化合物的抗体。如果将猪的器官移植给人，会由于相应的抗体而出现超急性 排异反应，导致移植失败。因此，需要消除猪细胞表面的α-1，3-半乳糖化合物分子以减少 异种供体器官的免疫原性。而准确高效的敲除猪GGTA1基因，是消除a-l，3_Gal引起的免 疫排斥的关键步骤。
[0005] 目前，常见的基因敲除技术包括同源重组（Homologus Recombination，HR)技术、 类转录激活效应子核酸酶（Transcription Activator-Like Effector Nuclease，TALEN) 技术、锌指核酸酶（Zinc-Finger Nuclease，ZFN)技术以及最近发展的规律成簇间隔短回 文重复（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat，CRISPR)技术。 HR技术由于重组效率低下（效率大约只有10 6)，对突变体的筛选工作非常耗时和低效，已 逐渐被取代。TALEN技术和ZFN技术的切割效率一般能达到20%，但都需要构建可以识别 特定序列的蛋白质模块，前期工作繁琐费时。ZFN技术的模块设计较为复杂且有较高的脱靶 率，其应用有限。
[0006] CRISPR是一种源于原核生物的后天免疫系统，该系统执行干扰功能的复合物由蛋 白质Cas和CRISPR-RNA(crRNA)组成。目前该系统已发现有三种类型，其中第二类Cas9 系统组成简单，已被积极应用于基因工程领域。Cas9革El向切割DNA是通过两种小RNA-- crRNA (CRISPR RNA)和 tracrRNA (trans-activating crRNA)与革E序列互补识别的原理实现 的。现在已经将两种小RNA融合成一条RNA链，简称sgRNA(single guide RNA)，能够识别 特定的基因序列，引导Cas9蛋白进行切割。在真核生物中，DNA被切断后发生非同源重组 末端连接，造成移码突变，最终导致基因功能性敲除。
[0007] 相比于上述3种技术，CRISPR技术操作简单、筛选效率高，能够实现精确的靶向切 害J。因此，通过CRISPR技术敲除GGTA1基因能够极大地提高a-l，3_Gal缺失细胞及基因 工程猪的筛选效率。但是该路径的关键技术难题是设计并制备精确靶向的sgRNA，因为基 因的靶向精确度高度依赖于sgRNA靶序列，能否成功设计出精确靶向的sgRNA成为敲除目 的基因的关键技术问题，本发明意在解决该技术问题从而为敲除GGTA1基因提供坚实的基 础。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的在于提供CRISPR_Cas9特异性敲除猪GGTA1基因的方法及用于特异 性靶向GGTA1基因的sgRNA。
[0009] 根据本发明的第一方面，本发明提供在CRISPR_Cas9特异性敲除猪GGTA1基因中 用于特异性靶向GGTA1基因的sgRNA，该sgRNA具有以下特点：
[0010] (1)该SgRNA在GGTA1基因上的靶序列符合5' -N(20)NGG-3'的序列排列规则，其 中N(20)表示20个连续的碱基，其中每个N表示A或T或C或G，符合上述规则的靶序列位 于正义链或反义链；
[0011] (2)该SgRNA在GGTA1基因上的靶序列位于GGTA1基因的N端的5个外显子编码 区，或靶序列的一部分位于GGTA1基因的N端的5个外显子，其余部分跨越与相邻内含子的 交界，位于相邻内含子；
[0012] (3)该sgRNA在GGTA1基因上的靶序列是唯一的。
[0013] 作为本发明的优选方案，上述靶序列为序列表中SEQ ID N0 :1~38中任一条序列 所示的序列。
[0014] 作为本发明的优选方案，上述靶序列为序列表中SEQ ID N0 :1所示的序列。
[0015] 根据本发明的第二方面，本发明提供运用CRISPR-Cas9特异性敲除猪GGTA1基因 的方法，该方法包括如下步骤：
[0016] (1)在第一方面所述的sgRNA的靶序列的5' -端加上用于形成粘性末端的序列， 合成得到正向寡核苷酸序列；在第一方面所述的sgRNA的靶序列对应的互补序列的两端加 上合适的用于形成粘性末端的序列，合成得到反向寡核苷酸序列；将合成的正向寡核苷酸 序列与反向寡核苷酸序列退火、复性，形成具有粘性末端的双链寡聚核苷酸；
[0017] (2)将上述双链寡聚核苷酸连入线性化的携带Cas9基因的表达载体，得到携带含 相应靶序列的sgRNA寡聚核苷酸和Cas9基因的表达载体，转化感受态细菌，筛选鉴定出正 确的阳性克隆，并对阳性克隆摇菌、提取质粒；
[0018] (3)用上述携带有sgRNA寡聚核苷酸和Cas9基因的表达载体、包装质粒和包装细 胞系包装出同时携带靶向GGTA1基因的sgRNA和Cas9的假型慢病毒；
[0019] (4)使用上述假型慢病毒感染目的细胞，并进一步培养；然后收集被感染的目的 细胞，以其基因组DNA为模板扩增包含上述靶序列的基因片段，经过变性、复性及酶切，确 定GGTA1基因的敲除情况。
[0020] 作为本发明的优选方案，上述表达载体为序列表中SEQ ID NO :39所示序列的载 体。
[0021] 作为本发明的优选方案，上述方法包括如下步骤：
[0022] (1)在第一方面所述的sgRNA的靶序列的5' -端加上CACCG序列，合成得到正向 寡核苷酸序列；在第一方面所述的sgRNA的靶序列对应的互补序列的5' -端加上AAAC序 列、3' -端加上C，合成得到反向寡核苷酸序列；将合成的正向寡核苷酸序列与反向寡核苷 酸序列退火、复性，形成具有粘性末端的双链寡聚核苷酸；
[0023] (2)将上述双链寡聚核苷酸连入如序列表中SEQ ID N0 :39所示序列的表达载体 lentiCRISPR v2经BsmB I限制性内切酶酶切得到的线性化载体，得到携带sgRNA寡聚核苷 酸的重组表达载体1 entiCRISPR V2-GGTA1，转化感受态细菌，筛选鉴定出正确的阳性克隆， 并对阳性克隆摇菌、提取质粒；
[0024] (3)用上述表达载体lentiCRISPR V2-GGTA1、包装质粒和包装细胞系包装出同时 携带靶向GGTA1基因的sgRNA和Cas9的假型慢病毒；
[0025] (4)使用上述CRISPR假型慢病毒感染目的细胞，并进一步培养；然后收集被感染 的目的细胞，以其基因组DNA为模板扩增包含上述靶序列的基因片段，经过变性、复性及酶 切，确定GGTA1基因的敲除情况。
[0026] 作为本发明的优选方案，上述包装质粒为质粒pLPl、质粒pLP2和质粒pLP/VSVG ; 上述包装细胞系为HEK293T细胞。
[0027] 作为本发明的优选方案，上述目的细胞为猪PIEC细胞。
[0028] 作为本发明的优选方案，上述以其基因组DNA为模板扩增包含上述靶序列的基因 片段，经过变性、复性及酶切，确定GGTA1基因的敲除情况，具体为：
[0029] (a)以感染病毒的目的细胞的基因组DNA为模板，用GGTA1基因的上下游引物扩增 包含上述sgRNA的靶序列的GGTA1基因片段，同时用相同引物扩增未感染病毒的野生型细 胞的基因组DNA ;
[0030] (b)纯化上述扩增到的GGTA1基因片段，然后将来自感染病毒的目的细胞的GGTA1 基因片段与来自野生型细胞的GGTA1基因片段等量混合、加热变性、复性，形成杂交DNA分 子；
[0031] (c)用Cruiser酶切割复性后的杂交DNA分子；
[0032] (d)电泳检测酶切产物，检测靶序列介导的GGTA1基因敲除效果。
[0033] 根据本发明的第三方面，本发明提供在CRISPR_Cas9特异性敲除猪GGTA1基因的 方法中用到的重组表达载体lentiCRISPR V2-GGTA1，该重组表达载体的骨架载体的序列如 序列表中SEQ ID N0 :39所示；所携带的靶序列如第一方面的sgRNA的靶序列，优选序列表 中SEQ ID N0 :1所示的靶序列。
[0034] 根据本发明的第四方面，本发明提供如第一方面所述的sgRNA或第三方面所述的 重组表达载体lentiCR