与猪生长和肉质性状相关的分子标记的克隆及应用的制作方法

专利名称：：与猪生长和肉质性状相关的分子标记的克隆及应用的制作方法
技术领域：
：本发明属于家畜基w工程
技术领域：
，具体涉及一种与猪生长和肉质性状相关的分于标记的克隆及应用。
背景技术：
：猪肉是动物性蛋白的主耍来源，随着经济的发展和人Ui生活水平的提高，人们对猪肉需求数量和质量在不断的增L《。培育生L々速度快、肉质优良的种猪是满足消费者对猪肉需求增长的有效途径。培育和生产生长速度快、肌肉品质高的种猪已成为我国养猪业发展的重耍趋势。生长性状和肉质性状均属于数量性状，由多基闪控制。在生ll的性状改良上，过去的近30年中，通过对生长性状中达IOOKg体重日龄和平均日增重(Averagedailygain,ADG)邻表荆的选择，猪生长速度取得了较人的遗传进展，但随着表荆值的提高，通过直接表型选择进一步提高猪生长速度取得的遗传进展有限，而且表型选择存在遗传改良时距长的缺点，抑制了猪生K:速度改良的遗传进展。另外，有研究表明，随着猪生长速度的提高，猪肉品质存在下降的趋势，主要表现在肌内脂肪含量下降、水分含量上升，猪生长速度和肌肉品质性状存在负相关。闪此，优质猪育种已将提高肌肉品质列为猪育种目标之一。当前对猪肉质性状度呈上，衡呈指标较多，包括了肉色、pH值、系水力、肌内脂肪含量、嫩度等多个指标。但对这些性状的度量均须居宰后才能度量，不仅加人了选择的成本，而且也限制了其遗传进展。如何在遗传上进一步提高猪生L〈速度的同时，使肌肉品质保持在一定水平，是摆在我们面前的一项课题。随着分子生物学技术的发展，人们可以通过寻找控制生L〈或肉质性状的主基闪(majorgene)或与其连锁的分子标记，从而通过分子标记实施早期选择及间接选择。同时，基冈的多效性也决定了通过基因型的选择达到选择猪生长速度的同时，使肉质性状保持在一定的水平贝有可行性。在猪生长性状相关候选基冈的鉴定方面，最成功的例子就是氟垸基闪(又称兰尼定受体1基因，即RYR1基因)的发现并用于育种实践。另外，生K;激素(GH)基闲和胰岛素样生长因于(IGF-2)基因由于在生长轴中调控地位的重耍性而被作为肌肉生长性状的候选基闪。抑肌素基冈(MSTN)也被确定为影响肌肉生长的重耍候选基冈。此外，肌细胞生成素基冈(MYOG)也被认为和生K速度及痩肉率相关。同时，猪IGF-1、PIT-1、L印tin基因等均被认为与猪的生长有关。关于.肉质性状相关候选基ra的鉴定方面，除氟烷基冈被发现勾PSE(PaleSoftExudative)肉产生有关外，酸肉基KRN(又名PRKAG3)的鉴定也是成功的例子之一。钙蛋白酶抑制蛋白基因(CAST)作为影响嫩度的一个标记在生产中也得到应W。心脏脂肪酸结合蛋A基闪(heartfattyacidbindingproteingene，H-FABP)和脂肪组织脂肪酸结合蛋A基K(adipocytefattyacidbindingproteingene，A-FABP)也被证明是影响肌内脂肪含量(intramuscularfat，IMF)的候选基闪。由上可知，尽管在猪肌肉生长和肉质性状相关候选基因鉴定和应用方面取得了一些进展，但能够真正用于育种实践的影响生L(和肉质的分于标记还很有限，进一步寻找猪产肉和肉质相关的候选基丙及分子标记是非常必要的。JHDM1A(JmjC-domain-containinghistonedemethylases1A)基l刃是编码JHDMl蛋A的，是JHDMl基因家族成员之一，乂名FBXL11。通过甲基化酶的阵列分析并结合色谱分析技术首次纯化得到了JHDM1蛋白(Tsukada，Y.,J.Fang,H.Erdjument-Bromage,M.E.Warren,etal."HistonedemethylationbyafamilyofJmjCdomain-containingproteins."Nature,2006，439(7078):811-6.)。该蛋白含有Jmjc结构域，能使组蛋白H3K36位点的单甲基或双甲基化位点去甲基化。该基因家族成员除含有Jmjc结构域外，还含有两个重要的功能域，即F-box和CXXC锌指结构域。F-box己知能与S期激酶相关蛋白lA(S-phasekinase-associatedprotein1A，SKPl)结合形成SKP1-Cullin-F-Box(SCF)E3泛素连接酶复合体，从而将组蛋白的去甲基化与蛋A的泛素化相联系起来，参与细胞周期调节；CXXC锌指结构域能勾非甲基化的CpG二核苷酸序列结合，提示JHDM1A介导的去甲基化可能与DNA的甲基化状态有关。该家族中另外一个成员JHDM1B(乂名FBXL10)在线虫中的同源基闪T26A5.5的RNAi试验结果表明该基闪是一个调控生L(的基因(Pothof，J.，G.vanHaaften，K.Thijssenetal."IdentificationofgenesthatprotecttheC.elegansgenomeagainstmutationsbygenome-wideRNAi.〃GenesDev,2003，17(4):443-448.)。同时，在小鼠中研究表明JH函IB对细胞人小和增殖起负调控作MJ，其下调表达与一些癌症的发生密切相关(Frescas,D.，D.Guardavaccaro，F.Bassermannetal."JHDM1B/FBXL10isanucleolarproteinthatrepressestranscriptionofribosomalRNAgenes."Nature2007，450(7167):309-313.)。胚胎期骨骼肌细胞的增殖与分化决定了猪生后生长速度和肉质。通过以上资料可以看出JHDMIA基因在调节组蛋A甲基化修饰方面发挥功能，还与^gA降解、细胞增殖和分化密切相关。JHDMIA基闪可能是影响猪肌肉生长和肉质的一个重耍候选基冈。闪此，研究该基闪在猪生长和肉质中的作用，并发现与猪生长和肉质相关的DNA分子标记具有重要的意义。申请人从人源/MW"基因得到一段与猪生长性状和肉质性状关联的cDNA序列，利用该cDNA序列进行多态性与关联分析等，以期得到一种作为猪的生长性状和肉质性状相关的分子标记。
发明内容本发明的目的在于克隆与猪生长性状和肉质性状相关的分子标记的及其作为猪标记辅助育种的应用。同时本发明还包含克隆所述的分子标记的方法。本发明通过以下技术方案实现一种克隆的与猪生长和肉质性状相关的分子标记，它的核苷酸序列如序列表SEQIDNO:2所示。所述的分子标记，在该序列的第213位碱基处有一个C213-G213的碱基替换，并导致Mbo1-RFLP酶切多态性(见附图5所示)。检测SEQIDNO:2所述的碱基突变的引物对的DNA序列如下所示PL5'-CCCAGACTGAGCAGGAACC-3'，PR5'-GGACACCACGAGGAGAACC-3'。一种实现所述的分子标记的制备方法，按照以下步骤制备用人JHDMlA基冈cDNA为信息探针，作同源序列筛选，获得同源性80%以上的表达序列标签(EST)或Trace-WGS序列；然后拼接猪EST-重叠群；根据人鼠同源序列、EST-重叠群和Traces-WGS序列设计的三对引物，扩增得到二个DNA片段；以该二个DNA片段克隆测序获得的序列及搜漆'得到的EST进行序列组装，获得如序列表SEQIDNO.l所述的cDNA序列。更详细的技术方案参见《具体实施方式》。序列表SEQIDNO:1是本发明克隆的猪生长与肉质相关的基闪JHDM1A的cDNA序列；序列表SEQIDNO:2是本发明克隆的作为猪生长与肉质相关基闪JHDM1A的3'UTR部分序列；图1:是本发明的技术流程图2:是本发明设计的引物对PI克隆的猪./〃/￥^1基因Exon2到Exon8之间的部分cDNA序列，该段序列包含了起始密码子，用标有下划线的斜体字母表述，引物对P1的止:反引物序列川下化线标示山来；图3:是本发明设计的引物对P2克隆的猪/〃ZWM基闪Exon8到Exonl5之间的部分cDNA序列，引物对P2的正反引物序列用下化线标示出来；图4:是本发明设计的引物对P3克隆的猪_77朋/7/!基因Exonl5到Exonl8之间的部分cDNA序列，引物对P3的正反引物序列用下化线标示出来；图5:是本发明设计的引物对P4克隆的猪/ZfflJft4基冈3'UTR区的部分序列，其中一位于212bp处的多态位点用黑体标示出来，引物对P4的正反引物序列用下化线标示出来；图6:是本发明中猪基闪JHDM1A编码区二个片段的RT-PCR扩增结果，琼脂糖胶浓度为2%。图中M泳道DNA分子量标记(DL2000ladder);1泳道Pl引物扩增片段，片段长度670bp;2泳道P2引物扩增片段，片段长度1258bp;3泳道P3引物扩增片段，片段长度1049bp。图7:是本发明中猪/ffiMM基闪3'UTR区C213G多态位点测序峰图。图8:是本发明中猪JHDM1A基H3'UTR区的Mbo1-RFLPs的二种基闪型(GG,GC，CC)电泳结果。M:DNA分子量标准(DL2000ladder)具体实施例方式实施例1基因的克隆(1)引物设计用人JHDMlA基丙cDNA(GenBank收录号NMJ)12308)为信息探针，利用NCBI中的BLAST工具在GenBank猪EST数据库中做同源序列筛选，获得一系列同源性为80。/。以上的ESTs(片段长度人于100bp),将这些ESTs的收录号在NCBI中用ENTREZ(http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/Web/Search/index.html)杳询相应序列，然后用DNAstar中的SeqMan程序构建猪的EST-重叠群；同时，利兩人NMJ)12308序列在GenBank中搜索猪Trace-WGS序列，并根据同源性推测可能为猪对应基闪相应外显子的部分序列信息。根据人鼠同源序列、EST拼接序列及JHDMlA基因Traces-WGS序列设计扩增JHDMlA基闪cDNA序列的二对引物Pl，P2和P3，扩增得到二个片段；为获得猪JHDM1A基闪的完整编码区序列，分别将扩增得到的二个片段经测序获得的序列及比对获得的EST序列经SeQMan程序进一步拼接获得了包含完整JHDMlA基闵编码区和3'UTRR的信息。表l用于分离JHDMlA基McDNA序列的引物<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>(2)反转录PCR扩增反应:利用TRIzoL试剂盒(美国GIBC0公巧)从成年通城猪肌肉组织中提取总KNA,具体操作依照试剂盒说明书进行。cDNA第一链的的合成反应总体积为50u1，首先将2ng总RNA与oligod(T)M混合于一Ependorff管中，7CTC温育5rain以解除RNA的二级结构，、'/;即置于冰上冷却以避免二级结构的重新牛成，经短暂离心后按照表2的加样条件加入其余组分，于37'C温育1h后将温度升至95'C灭活反转录酶，置于一20'C保存备用。PCR反应反应总体积为20u1,各组分的加样体积及终浓度如表3所述。PCR扩增程序是94t:3min，94°C3Gs,退火45s,72'C1rain，循环35次，最后72'C延伸5rain,退火温度见表1。PCR反应产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测。(3)PCR产物的纯化、克隆和测序PCR产物的纯化用凝胶冋收纯化试剂盒通过切胶纯化PCR产物，按照试剂盒说明书操作，具体歩骤是在紫外灯下从琼脂糖凝胶上切下含目的片段的凝胶，放入1.5mL离心管中，称重，然后向胶块中加入3倍体积的溶胶液，7(TC水浴放置10分钟至胶完全溶解。将所得溶液加入一个吸附柱中，12,000rpra离心30秒，弃废液。吸附杵放冋收集管并加入700uL漂洗液，12000rpm离心30秒'弃废液。再次向吸附柱中加入500uL漂洗液，12000rpra离心30秒，倒掉废液后将吸附柱放冋收集管中，12,000rpm离心1分钟。将吸附柱放入一干净的离心管中，向吸附柱膜中间加入洗脱缓冲液，室温放置2分钟后，12,000rpm离心1分钟收集纯化产物。连接反应将纯化PCR产物与pMD18-T载体的连接，连接反应总体积是5uL其中包括2.5n12Xbuffer，0.5ul的T载体，0.5u1的纯化PCR产物，0.5y1的L迮接酶，最后加入1u1灭菌水置4'C水浴过夜。感受态细胞的制备从37'C培养了16-20h的新鲜平板上挑取一个UH5a单菌落接种于2mlLB中，于37'C振荡培养3h，转接1ml齒液丁'含有30mlLB的盐水瓶中，继续在37。C振荡培养约4h，待0D,达到0,3-0.4时将盐水瓶从摇床取出置冰浴冷却10-15min，然后将菌液转入离心管中于4°C4，OOOg离心10min以收集细胞，将离心管倒置以弃净培养液，用10nil冰预冷的0.1mol/L的CaCh重悬沉淀，冰浴30min，重复4'C4，000g离心10min—次，用4ml冰预冷的0.1mol/L的CaCl2重悬沉淀，置4'C保存备用。转化无菌状态下取100-120"1感受态细胞T1.5nilEpendorff管中，将5U1的连接产物加入混匀，在冰上放置30min,42°C热激90s，其间不要摇动Ependorff管，取出后冰浴3-4min，加入400"1无抗生素的LB液体培养基，37'C振荡培养45min。取100yl涂布于己提前4h涂布了IPTG(Is叩ropylthio-P-D-galactoside,异丙基硫代一e-D—半乳糖苷)和X-gal的琼脂平板上，37°C平放lh后倒置培养。阳性克隆鉴定序列测定策略是毎个片段均同时采fflPCR产物直接测序和克隆测序两种方法。克隆测序是挑取单个克隆子用T测序，序列测定由上海博亚生物技术公司完成，每个基闪片段至少测两个克隆子。(4)DNA序列同源性检索鉴定:通过美国国家生物技术信息中心(NCBI,NationalCenterforBiotechnologyInformation,http:/7www:ncbi:nlra:nih:gov)网站的BLAST(BasicLocalAlignmentSearchTool)软件，将测序后获得的DNA序列与GenBank数据库中公布的己知生理功能基肉进行序列同源性比较，以鉴定和获得该DNA序列的功能信息。(5)猪JHDMIA基因的克隆结果以成年通城猪的肌肉组织提取总RNA反转录合成的cDNA为模板，分别用表l所列的二对引物Pl、和P3进行PCR扩增，扩增产物经2喊脂糖凝胶电泳检测结果显述均为特异的PCR产物(如图6所述)。将PCR产物回收纯化后克隆测序，测序结果显述二对引物扩增片段火小分别为670bp,1258bp和1049bp。将以上获得的二个片段及获得的EST序列用DNAstar软件中的S叫Man程序进行拼接，得到一条长度为6122bp的cDNA整合序列。将这段cDNA序列在GenBank中进行同源性检索，检索结果该序列与人JHDMIA基因cDNA(GenBank收录号NM—012308)的同源性达96%，序列分析表明该cDNA序列具有3489bp(nt51-3539)的开放阅读框，编码一个由1162个氨基酸组成的蛋白质。实施例2基因的物理定位(1)用于物理定位的引物序列是P4:PL5'_CCGCTGCGACCTTTGATGAC-3'inintron20PR5'-AAGGTGACGTTGGCGATGC-3'ine丽21该引物扩增片段长度为498bp。(2)用于物理定位的实验材料-用猪x啮齿类体细胞杂种板(PigXrodentsomaticcellhybridpanel,SCHP)进行染色体区域定位，用美国Minnesota火学共同构建的猪辐射杂种板(INRA—Minnesotaporcineradiationhybridpanel,IMpRH)进行染色体精确定位，两套体细胞杂种板均由由法国他rtinYerle博士(Za力orato^eofe6^7"&〃eCeWwJaire，皿A，Castanet-Tolosan，France)翻曾。IMp朋使用的辐射剂呈是7，000-rad。IMpRH包括118个猪x仓鼠辐射杂种细胞系，以及仓鼠和猪基因组DNA阳性对照，用757个标记的鉴定结果表明顶pRH中的平均标记存留率为29:3%，包含有128个连锁群，覆盖了18对常染色体及X染色体，用于估计标记间距离的kb/cR比值是70kb/cR(lRay=100cR)，理论分辨率是145kb。(3)PCR分观条件进行扩增的PCR反应总体积为10ix1，其中模板DNA为25ng,含1Xbuffer(Promega)，1.5ramol/LMgCl2，dNTP终浓度为150ymol/L，引物终浓度为0.4umol/L，2UTaqDNA聚合酶(购自Promega公司)。PCR扩增程序是94°C3min，循环35次94°C30s，60°C40s，然后72°C30s，最后72°C延伸5min。PCR反应产物用2y。琼脂糖凝胶电泳检测。(4)猪JHDM1A基因的定位结果用P4引物在IMpRH分型结果是1100001001OlOOOO0000101101010000111101001000000000010000000000000000001111001011000011010001101110110011011110(其中"0"和"1"分别表述扩增结果为阴性和阳性，"？"表示扩增结果不确定)。统计分析结果表明JHDM1A基因与猪2号染色体上的标记SW2623紧密连锁，LOD值为8.24，RH图距是49cR。根据与其连锁标记SW2623在染色体上所处位置，进一步推测该基闪位于猪2号染色体p17区域。实施例3PCR-RFLP诊断方法建立(1)引物序列P5:PL5'-CCCAGACTGAGCAGGAACC-3'PR5'-GGACACCACGAGGAGAACC-3'该引物扩增片段长度453bp。(2)PCR扩增条件PCR反应总体积20y1，其中猪基冈组DNA约100ng，含1Xbuffer(Promega)，1.5mmol/LMgCh，dNTP终浓度为150wmol/L,引物终浓度为0.2yirol/L，2U7^DNA聚合酶(购QPromega公司)。PCR扩增程序是94°C5min，然后再循环34次94'C45s,57°C45s，72°C30s,最后72°C延伸5min。PCR反应产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测并拍照。(3)RFLP检测条件PCR产物酶切反应体积是10u1，其中10Xbufferl"1，PCR产物3-5u1，限制性内切酶MboI为0.5ul(5U)，用双蒸水补足至10ul，将样品混匀后离心，37'C水浴6-8h，用2%琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果，记录基因型，在紫外灯下拍照。(4)RFLP检测的结果用P5引物对扩增猪基闪组DNA得到JHDM1A基因3'UTR区453bp特异扩增片段，(详见图8)。测序的结果发现在该453bp片段中在第213bp处存在1个改变Mbol酶切位点(GATC)的突变(祥见附图7)，另在24位和372位还存在两个l古l定的切点。当第213bp位置是G213时，则该Mbol酶切位点不存在，MbolI不能将该片段的213处切开；当第213bp位置是C213时，经Mbol酶切后有产生4个片段，长度是23bp，189bp，159bp和82bp;二种基因型GG，GC和CC如附图8所述。实施例4本发明克隆的分子标记在与猪生长和肉质性状关联分析的应用在一个由纯种中国地方血缘猪通城猪、外来血缘的大白猪和长白猪及其二元杂种猪大x(长x通)和长X(大X通)人白猪共167头个体组成的群体中进行了JHDM1A基因3'UTR区MboI-RFLP与部分生产性状进行关联分析，所分析性状包括了出生至上市日增重、服肌面积、服肌高、服肌宽、被膘厚度、肌内脂肪含量、滴水损失、肉色、剪切力等生L《、胴体和肉质性状。基W荆检测结果表明在167个个体中，GG基闪艰最少，有37个个体，GC和CC基冈型占多数，各有65个个体。不同基因型间性状的简单均数和标准差分析结果总结r表2,分析结果表明，GC与CC基因型个体在出生至上市日增重」V:.极显著性差异(P<0.01)，且GC与GG基闪型个体间在山生至上市日增重的差异接近显著性水平(p=0.054))。同时，JHDM1A基R该位点多态还丄」肉色(p=0.031)、剪切力(p<0.01)和滴水损失(p=0.095)等肉质性状存在关联。_表2/〃ZM^基因3，UTR区Mbo1-RFLP多态与部分性状的关联分析<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>注*表示？<0.05，括号中显示的检测到的该基W型个体数；表中性状值为平均数士标准差。Note:^indicatesP<0.05，andthenumbersofeachgenotypeindicatedinparentheses;andvaluesoftraitswereMeans±SD.实施例5PCR—RFLP—MboI多态性在各猪品种中的分布情况在7个猪品种中检测猪JHDMlA基闪PCR—RFLP—MboI多态性，检测结果如表3所述，表3的数据分析显述，在所检测的这儿个猪品种中在国内地方猪种清平猪、玉山黑猪、二花脸猪、火花白猪中均是C等位基因占优势，频率分别达到0.892，0.829，0.942，0.737;而在所检测的二个国外品种中，杜落洛克猪品种中G等位基冈占优势，达到0.793，且G等位基K在K:A猪中所占的比例相对于在所检测的国内品种中所占的比例要高，达到0.433(表3)表3J说M/J基因3'UTR区C224G多态在不同猪品种中基因型和基因频率<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>对猪JHDM1A基因MboI-RFLP多态性位点基冈频率在不同品种中的分布差异进行检验，差异显著性结果见表4。根据表4的分析结果表明该位点基冈频率在所检测的这六个猪品种中存在较大程度的差异，尤其是两生长快速瘦肉型品种杜洛克和长白猪与国内生长缓慢的肥胖型猪间差异均达到极显著性水平(p〈0.01)。表4猪不同品种/A2MW基因3'UTR区C224G多态基因型频率分布卡方检验<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>序列表〈110〉华中农业大学<120〉与猪生长和肉质性状相关的分于标记的克隆及应用<130〉<141>2008-07-12160〉3<170〉Patentlnversion3.1<210>1<211〉3489<212〉■<213>猪(Susscrofa)<220〉<221〉CDS<222〉(1)..(3489)<223><400〉1atgg犯cccgaag肌gaaaggattcgttacagecagagattgcgtggt48MetGluProGluGluGluArglieArgTyrSerGinArgLeuArgGly151015accatgcgacgacgctatg犯gatgatggcattteagat糾gaaatt96ThrMetArgArgArgTyrGluAspAspGlylieSerAspAspGlulie202530gaagggaaa卿acttttgacttggaagagaaaetccacaccaacaaa144GluGlyLysArgThrPheAspLeuGluGluLysLeuHisThrAsnLys354045tataatgcaaattttgttacttttatggaaggaaaagattttaatgta192TyrAsnAlaAsnPheValThrPheMetGluGlyLysAspPheAsnVal505560gagtatatecagcgtggtggctta卿gaccctctgattttcaagaat240GluTyrlieGinArgGlyGlyLeuArgAspProL>euliePheLysAsn65707580tctgatggacttggaata38g￡itgccagatccagacttcactgtgaat288SerAspGlyLeuGlylieLysMetProAspProAspPheThrValAsn859095gatgtcaaaatgtgtgtggggagtcgtcgtatggtggatgtcatggat336AspValLysMetCysValGlySerArgArgMetValAspValMetAsp100105nogtgaacacacagaaaggcattgaaatgactatggetcagtggacacgc384ValAsnThrGinLysGlylieGluMetThrMetAlaGinTrpThrArg115120125tsctstg站accccag恥g兆gagcgsg認肌aetctst犯tgtcate432TyrTyrGluThrProGluGluGluArgGluLysLeuTyrAsnVallie130135140ageetagagttcagecataccaggctggagaacatggtgcagaggccg480SerLeuGluPheSerHisThrArgLeuGluAsnMetValGinArgPro145150155160tecacggtggatttcattgactgggtagacaacatgtggccaaggcat528SerThrValAspPhelieAspTrpValAspAsnMetTrpProArgHis165170175ttgaaggaaagtcagaccgaateaacaaacgcgatettggagatgcag576LeuLysGluSerGinThrGluSerThrAsnAlalieLeuGluMetGin180185190taccctaaagtgcagaagtactgtctgatgagtgttcgaggctgctat624TyrProLysValGinL>ysTyrCysLeuMetSerValArgGlyCysTyr195200205actgacttccatgtggattttggtggtacttctgtttggtatcacate672ThrAspPheHisValAspPheGlyGlyThrSerValTrpTyrHislie210215220catcaagggggaaaggtcttctggetcateccccctacagcccacaac720HisGinGlyGlyLysValPheTrpLeulieProProThrAlaHisAsn225230235240ctggagctgtacgagaattggctg'ctgteaggga犯cagggagacate768LeuGluLeuTyrGluAsnTrpLeuLeuSerGlyLysGinGlyAsplie245250255tttctgggtgacegggtgteagat.tgccagcgcatt.gagetc鄉cag816PheLeuGlyAspArgValSerAspCysGinArglieGluLeuLysGin260265270ggctataccttcgtcattcccteaggctggattcatgetgtgtatact864GlyTyrThrPheVallieProSerGlyTrplieHisAlaValTyrThr275280285cccacagacacattagtgtttggaggc组tttUgcatagettcaat912ProThrAspThrLeuValPheGlyGlyAsnPheLeuHisSerPheAsn290295300atecccatgcagttaaaaatetataacattgaagateggacaegggtt960lieProMetGinLeuLyslieTyrAsnlieGluAspArgThrArgVal305310315320ccaaataagttccgctatccgttctactatgagatgtgttggtatgtg1008ProAsnLysPheArgTyrProPheTyrTyrGluMetCysTrpTyrVal325330335ctggagcgctatgtgtactgcataaceaaccgtteccacetaactaag1056LeuGluArgTyrValTyrCyslieThrAsnArgSerHisLeuThrLys340345350gaatttcagaaagagteccttageatggatttggagttaaatgggttg1104GluPheGinLysGluSerLeuSerMetAspLeuGluLeuAsnGlyLeu355360365gagtecgga组ggggatgaggaagcggtagatcgaggaccceggcgc1152GluSerGlyAsnGlyAspGluGluAleiValAspArgGlyProArgArg370375380ttgageaataggcgttctgttetcactagecctgtagccaatggggtc1200LeuSerAsnArgArgSerValLeuThrSerProValAlaAsnGlyVal385390395400aacctggattatgatggactgggtacctgccgaagtcttccaagt1248AsnLeuAspTyrAspGlyLeuGlyLysThrCysArgSerLeuProSer405410415ctgaagaaaactttgtctggggatteaacctctgactctageeggggc1296LeuLysLysThrLeuSerGlyAspSerThrSerAspSerSerArgGly420425430teccacaatggacaagtgtgggatteccaatgtageccceggaagga_c1344SerHisAsnGlyGinValTrpAspSerGinCysSerProArgLysAsp435440445aggcaggtgcatctgacccattttgagcttgaaggcc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hrProPro745GinGluLysGluSer825ProGluGlyAspLeu905TyrArgGinLeuAla985ProAla730SerLeuAsnlieLeu810SerAlaGluGlyGlu890SerLysCysProThr970GlyPro715SerAspLeuAsnArg795HisAlaArgGluAla875SerArgTrpLysVal955TrpCys700ProProHisArgPro780GlyGlyAsnThrGlu860AlaTrpArgCysAla940SerLeuSerHisArgHisLeu765SerSerThrLeuPro845GluArgMetGluCys925lieLeuValTrpSerGlySer750GinGlyTyrSerArg830GinGluLeuGinLeu910AspValAspAsnSer990ProVal735AlaAlaLysLeulie815HisArgGluAsnArg895CysLysProLeuArg975AlaThr720ValSerThrLysThr800ValSerGlyGluGly880GluGluArgGinSer960LeuValLeuSerThrSerSerCysProLeuLeuArgThrLeuAspLeu99510001005ArgTrpAlaValGlylieLysAspProGinlieArgAspLeuLeu101010151020ThrProProAlaAspLysProGlyGinAspAsnArgSerLysLeu102510301035ArgAsnMetThrAspPheArgLeuAlaGlyLeuAsplieThrAsp104010451050AlaThrLeuArgLeulielieArgHisMetProLeuLeuSerArg105510601065LeuAspLeuSerHisCysSerHisLeuThrAspGinSerSerAsn107010751080LeuLeuThrAlaValGlySerSerThrArgTyrSerLeuThrGlu108510901095LeuAsnMetAlaGlyCysAsnLysLeuThrAspGinThrLeulie110011051110TyrLeuArgArglieAlaAsnValThrLeulieAspLeuArgGly111511201125CysLysGinlieThrArgLysAlaCysGluHisPhelieSerAsp113011351140LeuSerlieAsnSerLeuTyrCysLeuSerAspGluLysLeulie114511501155GinLyslieSer1160<210>3〈211〉453<212>DNA<213>猪(Susscrofa)〈220〉〈221〉<222〉(l)..(453)<223〉<220〉〈221〉primer—bind<222>(435)..(453)<223〉<220〉〈221〉primer—bind<222>(1)…(19)<223><220〉<221>mutation<222>(213)..(213)<223><220〉〈221〉3'UTR<222>(l)..(453)〈223〉<400〉3cccagactgagcaggaacccgatcttccctgaccccccgccgggagaggtctctctccgc60tcctgcacaggctctggggccagtgtcacactccctctctgctctcctgccccttgagcc120CttCCCtgElC郷CggggC3g卿gggtggccctcct卿g3g卿gg兆tggc卿ttgtcacggtgcct,gctcgcttgctctcccaccgctctcagtttggggtgtctgcgcagccgtccatccatgatccccagcagtgcctggttctgtgtccgtggccaggttctcctcgtggtgtggax:3ccaggcttccctgcccgctcctct180atcgggg3a3gcac3ggctgtgtgttg240tgcctgcccgctcgcctgccg卿ggcc观300catctgcactgggccctggggcccccctcc360tg3gC3犯Ctcccagg,g犯3gCggCCC420tec45权利要求1、一种克隆的与猪生长和肉质性状相关的分子标记，它的核苷酸序列如序列表SEQIDNO2所示。2、根据权利要求1所述的分子标记，其特征在于，序列表SEQIDNO:2所示序列的第213位碱基处有一个C213-G213的碱基替换，导致MboI-RFLP酶切多态性。3、检测权利要求2所述碱基突变的引物对的DNA序列如下所示PL5'-CCCAGACTGAGCAGGAACC-3'，PR5'-GGACACCACGAGGAGAACC-3'。4、一种实现权利要求1或2所述的分子标记的制备方法，其特征按照以下步骤用人JHDMlA基因cDNA为信息探针，作同源序列筛选，获得同源性80%以上的表达序列标签(EST)或Trace-WGS序列；然后拼接猪EST-重叠群；根据人鼠同源序列、EST-重叠群和Traces-WGS序列设计的三对引物，扩增得到三个DNA片段；以该三个DNA片段克隆测序获得的序列及搜索得到的EST进行序列组装，获得如序列表SEQIDNO:1所述的cDNA序列。5、权利要求1或2所述的分子标记在猪标记辅助选择中的应用。全文摘要本发明属于家畜基因工程
技术领域：
，具体涉及一种作为猪标记辅助选择应用的与猪生长和肉质性状相关的分子标记及其应用。所述的分子标记由JHDM1A基因克隆得到，它的cDNA序列如序列表SEQIDNO1所述。在序列表SEQIDNO2的第213bp处有一个有一个C213-G213的碱基替换，该替换导致MboI-RFLP酶切多态性。本发明还公开了扩增JHDM1A基因部分cDNA序列所用的引物以及用于多态性检测方法，为猪的标记辅助选择提供了一个新的分子标记。文档编号C12N15/11GK101348832SQ20081004841公开日2009年1月21日申请日期2008年7月16日优先权日2008年7月16日发明者梅余,榜刘,彭中镇,彭勇波,徐学文,朱猛进,斌樊申请人:华中农业大学