专利名称：转基因水稻tt51-1转化事件外源载体整合位点全序列及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物工程技术领域中转基因水稻的安全评估和检测，具体地说， 涉及一种转基因水稻TT51-1转化事件外源载体整合位点全序列及其应用。
背景技术：
近年来，玉米、大豆、棉花、油菜和番茄等转基因作物已在很多国家获准种 植和生产，有的被加工成食品、饲料或用作食品添加剂。由于转基因产品的生态 安全和食用安全一直备受争议，30多个国家和地区相继实施转基因产品标识制 度。转化事件包含的转化载体的序列、编码基因序列、重组方式、插入位点等序 列信息是进行转基因安全评价的基础。根据这些信息，可以获得该转基因品系编 码的蛋白的序列、完整性、编码蛋白的组织和时间特异性，并进一步分析其潜在 的毒理特征、致敏性等安全性问题。同时，根据外源载体插入的位点，判断宿主 基因组插入失活和缺失的情况，可以推测该转化事件对宿主的影响和导致的安全 性问题。同时，序列资料也是转基因产品身份验证和检测的基础。只有建立了有效的 检测方法，才能对转基因产品的研究和生产进行有效的管理和监督。根据转基因 产品中外源基因的序列信息，外源基因在转基因构建体上的组合方式，以及构建 体在基因组上的整合位点，可以采用基因特异性、载体特异性和事件特异性的检 测方法。1、 基因特异性检测方法由于大量的转基因载体使用了相同的外源基因，因此基因特异性检测方法并 不适合当前转基因产品不断涌现的现实。2、 载体特异性检测方法载体特异性检测方法利用基因元件之间的边界序列特征，能够有效鉴定使用 类似基因元件的不同构建体，而且存在序列信息容易获得的特点，因此被很多研 宄者所使用。但是，由同一构建体可能获得不止一个不同特性的转化株，甚至可 能被转化到不同的物种中，而这些转化株未必全部经过了安全评估。因此载体特 异性检测方法不能识别不同的转基因品系，也不能判别该转基因品系是否己经过 安全评估。
3、事件特异性的检测方法
事件特异性检测的基础是转基因构建体在基因组DNA序列上的整合位点具 有高度特异性，即使是相同的载体多次转化，整合的位置和整合位点特征也是不 可重复的。因此，根据不可重复的整合位点特征序列，开发出了事件特异性的检 测方法。与前两种方法相比，事件特异性检测具有最高的特异性，最适合做转基 因产品的定性和定量检测。但转基因构建体的完整信息通常难以获得，而已知序 列基因元件可能距边界有相当的距离，而且在整合的过程中，载体和基因组之间 可能发生复杂的重组，因此，分离旁侧序列成为事件特异性检测的关键。2000 年2月，欧盟为此资助了 Qpcrgmofood European Project项目，该项目现已成 功分离获得多个品种旁侧序列并用于建立事件特异性检测方法。当前，事件特异 性检测方法已经被用于转基因Roundup Ready soybean, Mon810 maize等一系列 转基因商品化品种的检测。
经对现有专利和其他文献的检索，尚未发现任何关于转基因水稻TT51-1事 件外源插入载体全序列及两侧旁侧序列和利用此序列建立事件特异性定性、定量 PCR (聚合酶链式反应)检测的报道。
发明内容
本发明的目的就在于克服现有技术在转基因水稻TT51-1事件和转基因水稻 TT51-1衍生品种安全评估和检测工作中存在的不足，提供一种转基因水稻 TT51-1转化事件外源载体整合位点全序列及其应用。
本发明的目的是这样实现的
一、转基因水稻TT51-1转化事件外源载体整合位点全序列 本发明以转基因水稻品种TT51-1为材料，提取基因组DNA，并利用引物FraglF : 5，AAAAGTTGMTTTGGGMTAGTCAGCCA 3， 和引物FraglR : 5， CTCACCCAGAAACGCTTTACGG 3'扩增出包含TT51-1事件5'端673bp水稻基因序 列和部分TT51-1事件的全长3403bp的片段1;利用片段1内部引物Frag2F: 5' AATATAMCCATGCTCACTCA3，和引物Frag2R: 5， CGGTTTCMTGCGTTCTCCACCAAGTA 3'扩增出包含TT51-1事件的长2202bp的片段2;利用片段2内部引物Frag3F: 5， MTCCCTCAGCATTGTTCATCG 3， 和引物 Frag3R: 5， AGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGT 3'扩增出包含TT51-1事件的长3043bp的片段 3;利用片段3内部引物Frag4F: 5， AGAGGTGGCGMACCCGACAGGACTAT 3，和引 物Frag4R: 5， ATCTATTTGTTAGATACGTATGTTTATAGATCAC 3，扩增出包含TT51-1 事件的长2659bp的片段4;根据分离获得的4个片段，拼接出一种转基因水稻 TT51-1转化事件外源载体整合位点全序列(简称本序列)，该系列包含TT51-1 事件及其两侧水稻基因组序列的长10536bp的全长序列，如SEQ NO. 1。转基因水稻TT51-1事件外源插入载体全序列及其两侧旁侧序列，其特征是1、 碱基序列如SEQ NO. 1所示，由来源于水稻基因组的第1至673个碱基， 来源于载体序列的第674至9364个碱基和来源于水稻基因组的第9365至10536 个碱基共同组成；2、 由来源于外源插入载体的第1至673个碱基和来源于油菜基因组序列的 第674至9364个碱基共同组成的DNA序列，转基因水稻TT51-1事件外源插入载 体5'端边界旁侧序列；3、 由来源于油菜基因组序列的第674至9364个碱基和来源于外源插入载体 的第9365至10536个碱基共同组成的DNA序列，转基因水稻TT51-1事件外源插 入载体3'端边界旁侧序列；4、 以上所述序列是转基因水稻TT51-1事件的特征序列，可以用于区分转基 因水稻TT51-1和其他转基因和非转基因水稻，以及转基因水稻TT51-1的定性检 测和定量分析。二、转基因水稻TT51-1转化事件外源载体整合位点全序列的应用 1、利用该序列特征设计的转基因水稻外源基因整合事件TT51-1的事件特异 性定性PCR检测方法合成引物序列如下TT511G: 5， GCGTCCAGAAGGAMAGGAATA 3，和TT511V:5， AGAGACTGGTGATTTCAGCGGG 3，；提取样品总DNA，分别利用TT511G/TT511V 引物组合进行PCR扩增；PCR产物以琼脂糖凝胶电泳分离，EB染色后鉴定是否存 在扩增产物，如存在扩增产物则说明样品中含有TT51-1来源的成分。
2、利用该序列特征设计的转基因水稻外源基因整合事件TT51-1的事件特异 性定量PCR检测方法
合成引物序列如下TT511G: 5， GCGTCCAGAAGGAAAAGGAATA 3，和TT511V: 5， AGAGACTGGTGATTTCAGCGGG 3，； 合成TaqMan探针序列如下TT511P: 5， FAM —ATCTGCCCCAGCACTCGTCCG —朋Q1 3，;提取样品总DNA，分别利用上述引物 TT511G/TT511V和探针TT511P组合进行荧光定量PCR扩增；转基因水稻TT51-1 基因组DNA被相同浓度非转基因水稻基因组DNA稀释至不同含量，以20ng的混 和水稻基因组DNA为模板，进行荧光定量PCR反应并建立标准曲线；以标准曲线 为参照测定含有TT51-1基因组DNA的混和水稻基因组DNA样品中TT51-1基因组 DNA的量。
与现有技术相比，本发明具有下列优点和积极效果
1、 本发明首次公布转基因水稻TT51-1转化事件全序列；
2、 本发明首次公布转基因水稻TT51-1转化事件基因组插入位点的旁侧序
列；
3、 本发明首次确认转基因水稻TT51-1转化事件基因组插入位点的旁侧序列 中不同碱基的来源，并确定外源插入载体序列和水稻基因组序列的接合位点；
4、 利用本发明发现的序列特征，首次建立转基因水稻TT51-1事件特异性定 性和定量PCR检测方法；
5、 本发明适用于对转基因水稻TT51-1 (包括亲本、杂种Fl和后代)及其 制品(包括植株、组织、稻谷、大米及其制品)实施检测、监测和安全管理。
图1是转基因水稻TT51-1事件及其两侧旁侧序列结构图。 图2是转基因水稻TT51-1事件定性定量检测引物及其位置图。 图3是转基因水稻TT51-1事件特异性定性PCR扩增图；其中 M:分子量Marker;1— 双蒸水模板；2— 非转基因水稻基因组DNA模板；3— 转SCK基因水稻基因组DNA模板； 4一转基因水稻TT51-1基因组DNA模板；5— 转基因大豆RBS基因组DNA模板；6— 转基因油菜RT73基因组DNA模板；7— 转基因油菜MS8RF3基因组DNA模板；8— 玉米基因组DNA模板；9— 棉花转基因组DNA模板。图4是转基因水稻TT51-1事件特异性定量PCR扩增图。
具体实施方式
1、转基因水稻TT51-1转化事件外源载体整合位点全序列的PCR扩增 先将20% SDS预热到65° C，取15 ml SDS抽提buffer (0. lTrisHCl, 0. 05M EDTA, 1M NaCl pH8. 0)加入到50ml离心管，再加入2.5 e-巯基乙醇，混 匀；液氮研磨3g左右的叶片，将粉末转至50ml含抽提buffer的50 ml离心管 中，在振荡器上振荡混匀，加入2 ml预热的20%SDS，混匀，65° C水浴至少 30分钟，其间要轻轻摇动试管；水浴后，迅速将离心管置于冰上，加入3ml 3M KAc， 混匀，在冰上放置30分钟；4° C 5000g离心5min;将上清转移到新的50 ml 离心管中，加入2/3体积的异丙醇，混匀，-20° C放置30min以上；6000g ， 4 ° C离心15min ，倒掉上清，用75%乙醇洗一遍，真空干燥，用超纯水溶解DNA， 溶解后，将溶液转移到15ml的离心管中；按DNA溶解体积的W加蛋白酶K， 55 ° C水浴30min;加入等体积苯酚，混匀，轻摇30min， 8000g离心10min;转移 上清至新的tube中，加等体积的苯酚-氯仿-异戊醇(25: 24: 1)，轻摇20min， 8000g离心15min;转移上清至新的tube中，加等体积的氯仿-异戊醇(24:1)， 轻摇20min， 8000g离心15min;吸取上清，每管加入RNase，混匀，37° C 水浴lhr降解RNA;用等体积的苯酚抽提一次，轻摇20min , 8000g离心15 min; 转移上清至新的离心管中，加等体积的氯仿-异戊醇(24:l),轻摇20min， 8000g 离心15min;吸上清加入1/10体积3MNaAC，混匀，加入等体积异丙醇，-20°C放置30min，沉淀DNA; 6000g， 4° C离心15min ，倒掉上清，用75%乙醇洗2 遍，离心去掉75%乙醇，真空干燥；干燥后，用超纯水溶解DNA备用。合成引物序列如下FraglF: 5' AMAGTTGAATTTGGGAATAGTCAGCCA 3'; FraglR : 5， CTCACCCAGAMCGCTTTACGG3， ； Frag2F : 5，AATATAAACCATGCTCACTCA3， ； Frag2R: 5， CGGTTTCAATGCGTTCTCCACCAAGTA 3 ，； Frag3F : 5， AATCCCTCAGCATTGTTCATCG3， ； Frag3R : 5，AGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGT 3，； Frag4F : 5，AGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTAT 3'; Frag4R : 5'ATCTATTTGTTAGATACGTATGTTTATAGATCAC 3'。以提取的转基因水稻TT51-1基因组DNA为模板，利用PCR技术分4段扩增 转基因水稻TT51-1转化事件外源载体整合位点全序列。在50ul反应体系中，取 Oxy-235基因组DNA 100ng，其他各组分终浓度为，KOD Plus Buffer lx， dNTPs 每种200uM， MgS04lmM,引物各100nM， KOD Plus酶lu。反应条件为，94° C2 分钟预变性，94° C15秒，60° C30秒，68° C3分钟，循环35次，68° C保 温7分钟。其中，利用引物FraglF和引物FraglR可以扩增出包含TT51-l事件 5'端水稻基因序列和部分TT51-1事件的片段1。利用片段1内部引物Frag2F 和引物Frag2R可以扩增出包含TT51-l事件的片段2。利用片段2内部引物Frag3F 和引物Fmg3R可以扩增出包含TT51-l事件的片段3。利用片段3内部引物Frag4F 和引物Frag4R可以扩增出包含部分TT51-1事件和TT51-1事件3'端水稻基因 组序列的片段4。分别进行PCR扩增后，琼脂糖电泳分离DNA， EB染色鉴定。以QIAGEN公司QIAquick PCR Purification Kit纯化PCR产物。将PCR产物与EcoRV酶切的pZero2 (Invitrogen)载体连接。连接体系 ■ mixture 22 u 1; 2. 5 P 1 10XT4腿Ligase Buffer with ImM ATP; 0. 5 u 1 T4 DNA Ligase(NEB)。 22° C连接至少lhr。根据《分子克隆实验指南》提供的方法制备大肠杆菌TOPIO (Invitrogen)感 受态细胞，并以连接产物转化。挑取单克隆，以突变位点特异引物进行菌落PCR 检测重组子。将筛选出的克隆扩大培养，小量制备质粒，酶切验证。将筛选出的克隆送测序公司测序。将获得的序列信息，利用NCBI提供的 Blastn软件，分析不同部分序列的来源，从而判断基因组和载体的结合位点。2、应用方法
1) 利用本发明中所提供的序列进行转基因水稻TT51-1事件及其衍生品种的 安全性分析
利用NCBI提供的Blastn软件，分析不同部分序列的来源，可以发现TT51-1 事件中包含了氨苄青霉素和潮霉素抗性基因片段。在包含的2个抗虫基因中，有 1个因为启动子的断裂导致其可能无法正常表达。同时，根据两侧旁侧序列，可 以发现TT51-1事件中外源基因的整合导致水稻宿主基因组片段的缺失和插入失 活，可能会影响到宿主的正常发育。
2) 利用本发明中所提供序列设计转基因水稻TT51-1事件及其衍生品种的事 件特异性定性PCR检测方法
合成引物序列如下TT511G: 5， GCGTCCAGAAGGAAMGGAATA 3'和TT511V: 5， AGAGACTGGTGATTTCAGCGGG 3，。
分别取非转基因水稻基因组DNA模板，转SCK基因水稻基因组DNA模板，转 基因水稻TT51-1基因组DNA模板，转基因大豆RBS基因组DNA模板，转基因油 菜RT73基因组DNA模板，转基因油菜MS8RF3基因组DNA模板，玉米基因组DNA 模板，棉花转基因组DNA模板，分别利用TT511LG/TT511LV引物组合进行PCR 扩增。在25ul反应体系中，以100ng不同来源基因组DNA为模板，其他各组分 终浓度为，PCR Buffer lx (含10mM Tris'HCl pH8. 3， KC1 50mM)， dNTPs每 种200uM， MgCl2 2.5mM，引物各250nM， Hot Start Taq酶lu。反应条件为， 94° C2分钟预变性，94° C15秒，60° C30秒，72° C30秒，循环35次，72° C 保温2分钟。PCR产物以琼脂糖凝胶电泳分离，EB染色后鉴定是否存在扩增产物。
3) 利用本发明中所提供序列设计转基因水稻TT51-1事件及其衍生品种的事 件特异性定量PCR检测方法
合成TaqMan探针序列如下TT511P: 5， FAM—ATCTGCCCCAGCACTCGTCCG— 朋Q1 3'。
针对转基因水稻TT51-1事件外源插入载体3'端旁侧序列的引物、探针组 合被用于荧光定量PCR分析。荧光定量PCR分析在一台MJR DNA Engine Opticon 2 Continuous Fluorescence Detector上进行，检测及分析软件为Opticon Monitor 2 Version 2.02。TT51-l事件定量检测反应体积25ul，含模板DNA20ng，其他组分含量为 lx TaqMan Universal Master,引物TT511G和TT511V 800uM,探针TT511P 400uM。TaqMan反应条件为50° C 2分钟和95° C 10分钟预变性以后，进行50 次PCR循环95° C 15秒变性，60° C 1分钟退火及延伸，收集荧光信号。转基因水稻TT51-1基因组DNA被相同浓度非转基因水稻DNA稀释至不同含 量，以20ng的混和水稻基因组DNA为模板，进行荧光定量PCR反应。不同稀释 倍数，分别含20， 4.7， 0.47， 0.047， 0. 0047ng TT51-1基因组DNA的混和DNA 样品被用于建立标准曲线。所有的荧光定量反应都重复4次。根据标准曲线优化的结果，利用与建立标准曲线相同的PCR反应条件，以标 准曲线为参照测定含有TT51-1基因组DNA的混和水稻基因组DNA样品中TT51-1 基因组DNA的量。取20ng基因组DNA为模板，利用不同含量标准样品做标准曲 线，根据获得的标准曲线和转基因样品的Ct值,计算TT51-1基因组DNA的质量， 从而计算出TT51-1在样品中的含量。所有荧光定量反应都重复4次。3.实验结果1)转基因水稻TT51-1事件外源插入载体全序列及其两侧旁侧序列的PCR 扩增和测序分析利用引物FraglF和引物FraglR扩增出3403bp的片段1，测序和序列比对 分析结果表明其中包含TT51-1事件5'端673bp水稻基因序列和部分TT51-1事 件。利用片段1内部引物Frag2F和引物Frag2R扩增出包含TT51-1事件的长 2202bp的片段2。利用片段2内部引物Frag3F和引物Frag3R扩增出包含TT51-1事件的长 3043bp的片段3。利用片段3内部引物Frag4F和引物Frag4R扩增出长2659bp的片段4，测 序和序列比对结果表明其中包含部分TT51-1事件和TT51-1事件3'端1172bp 水稻基因组序列。拼接以上片段，可以获得转基因水稻TT51-1事件全序列及其两侧旁侧序列。 根据以上分析，本发明分离获得的序列包含转基因水稻TT51-1事件外源插入序列全序列及其两侧旁侧序列，其特征如图1所示。
2) 利用本发明中所提供序列设计转基因水稻TT51-1事件及其衍生品种的事 件特异性定性PCR检测方法
以不同来源转基因和非转基因作物基因组DNA为模板，利用TT51-1事件外 源插入载体3，端旁侧序列特异性引物组合TT511G/TT511V (图2)，进行PCR扩 增，结果如图3。只有TT51-1基因组DNA可以扩增出特异的PCR产物，而其他 转基因和非转基因水稻基因组DNA做模板时都没有扩增产物可观察到。同时以其 他非水稻转基因和非转基因植物基因组DNA为模板，也没有可见的PCR扩增产物。 因此，我们认为，该引物组合具有良好的特异性，适合用于事件特异性的检测。
3) 利用本发明中所提供序列设计转基因水稻TT51-1事件及其衍生品种的事 件特异性定量PCR检测方法
利用如图2所示的引物探针组合，进行TT51-1事件特异性的荧光定量PCR 反应。根据梯度稀释模板，4次重复获得的荧光曲线信息，针对TT51-1事件的 特异性荧光定量PCR反应标准曲线被建立起来，如图4所示，其1 2值为0.997， 表明外源基因的拷贝数与荧光强度都具有良好的对应关系，适合用于外源基因的 精确定量。
为了验证本研究中建立的定量方法的精确性，我们使用了从标准转基因水稻 TT51-1产品中提取的基因组DNA用非转基因水稻基因组DNA稀释至一定含量， 并以不含转基因水稻TT51-1基因组DNA的相同量基因组DNA做对照，作为实时 荧光定量PCR反应的模板，并根据相同条件下获得的标准曲线，计算不同样品中 转基因水稻基因组DNA的含量。
以不含转基因水稻TT51-1的非转基因水稻基因组DNA为模板，没有扩增产 物被检测到。对于混和实验样品，用本研究中建立TT51-1事件特异性荧光定量 检测方法来检测，都和理论值非常接近，误差小于15%。
以上结果可以看出，本发明为转基因水稻TT51-1事件及其衍生品种的定量 检测分析提供了基于简单、可靠的测定方法，可以用于不同来源、不同含量的混 和产品中转基因油菜0xy-235事件以及转基因油菜品种0xy-235的定量。本发明 为转基因标识提供了一种有用的参考，对转基因产品的控制提供了必要的手段。序列表〈110〉中国农业科学院油料作物研究所〈120〉转基因水稻TT51-1转化事件外源载体整合位点全序列及其应用〈160〉1〈210〉1〈211〉10536〈212〉DNA〈213〉水稻((2zyza sa〃ra cv. TT51-1) 〈400〉aaaagttgaa tttgggaata gtcagccaag gttttgtagc tactttggaa gctaaaccta 60ctctgtttga tcaaattaga gaagctcaag tgaatgatcc tgatatccag gaaataaaga 120agaacatgag aaggggtaaa gccatcggtt ttgtagaaga tgagcaggga actgtgtggt 180taggagaaag aatttgcgtc ccag犯aata aggagttgaa ggatactatc atgaaagaag 240ctcatgaaac tctgtattcc attcaccctg gaagcactaa gatgtaccaa gacttaaagc 300agcaattttg gtgggctagt atgcgacgtg agctagcaga atacgtggct ctatgtgatg 360tatgtcagcg ggtcaaagca gaacatcaga agccagctgg actattacaa ccattgaaga 420ttccagagtg gaagtgggaa gaaataggaa tggattttat aaccggtcta cccagaacgt 480cagcaggacs tgattctatt tgggtagtgg ttgatcggtt gacaaaagtc gctcacttca 540taccggtcaa aacaacctat acgggacata agcttgcaga gttata/tatg gctagagtgg 600tatgtttgca tggtgttcct aagaagatag tgtcagatag aggtagccag tttacttcga 660agttttggca gaagacttga gcgtcgattt ttgtgatgct cgtcaggggg gcggagccta 720tggaaaaacg ccagcaacgc ggccttttta cggttcctgg ccttttgctg gccttttgct 780cacatgttct ttcctgcgtt atcccctgat tctgtggata accgtattac cgcctttgag 840tgagctgata ccgctcgccg 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gggatttgta taagsaatat ctttaaaaaa acccstatgc taatttgaca 4320taatttttga gaaaaatata tattcaggcg aattctcaca atgaacaata ataagattaa 4380aatagctttc ccccgttgca gcgcatgggt attttttcta gtaaaaataa aagataaact 4440tagactcaaa acatttacaa aaacaacccc taaagttcct aaagcccaaa gtgctatcca 4500cgatccatag caagcccagc ccaacccaac ccaacccaac ccaccccagt ccagccaact 4560
ggacaatagt ctccacaccc ccccactatc accgtgagtt gtccgcacgc accgcacgtc 4620
tcgcagccaa aaaaaaaaaa agaaagaaaa aaaagaaaaa gaaaaaacag caggtgggtc 4680
cgggtcgtgg gggccgg犯a cgcgagg鄉atcgcgagcc agcgacgagg ccggccctcc 4740
ctccgcttcc aaagaaacgc cccccatcgc cactatatac ataccccccc ctctcctccc 4800
atccccccaa ccctaccacc accaccacca ccacctccac ctcctccccc ctcgctgccg 4860
gacgacgagc tcctcccccc tccccctccg ccgccgccgc gccggtaacc accccgcccc 4920
tctcctcttt ctttctccgt tttttttttc cgtctcggtc tcgatctttg gccttggtag 4980
tttgggtggg cg卿ggcgg cttcgtgcgc gccc卿tcg gtgcgcggga ggggcgggat 5040
ctcgcggctg gggctctcgc cggcgtggat ccggcccgga tctcgcgggg aatggggctc 5100
tcggatgtag atctgcgatc cgccgttgtt gggggagatg atggggggtt taaaatttcc 5160
gccatgctaa 3caagatcag gaagsgggga a犯gggcact atggtttata tttttatatEL 5220
tttctgctgc ttcgtcaggc ttagatgtgc tagatctttc tttcttcttt ttgtgggtag 5280 aatttgaatc cctcagcatt gttcatcggt agtttttctt ttcatgattt gtgacaaatg
cagcctcgtg cggagctttt ttgtaggtag acgataagct tgatatcgaa ttcctgcagc 5400
cccatggaca actgcaggcc atacaactgc ttgagtaacc cagaagttga agtacttggt 5460
ggagaacgca ttgaaaccgg ttacactccc atcgacatct ccttgtcctt gacacagttt 5520
ctgctcagcg agttcgtgcc aggtgctggg ttcgttctcg gactagttga catcatctgg 5580
ggtatctttg gtccatctca atgggatgca ttcctggtgc aaattgagca gttgatcaac 5640
cagaggatcg aagagttcgc caggaaccag gccatctcta ggttggaagg attgagcaat 5了00
ctctacca3a tctatgcaga gagcttcaga gagtgggaag ccgatcctac taacccagct 5760
ctccgcgagg aaatgcgtat tcaattcaac gacatgaaca gcgccttgac cacagctatc 5820
ccattgttcg cagtccagaa ctaccaagtt cctctcttgt ccgtgtacgt tcaagcagct 5880
aatcttcacc tcagcgtgct tcgagacgtt agcgtgtttg ggcaaaggtg gggattcgat 5940
gctgcaacca tcaatagccg ttacaacgac cttactaggc tgattggaaa ctacaccgac 6000
cacgctgttc gttggtacaa cactggcttg gagcgtgtct ggggtcctga ttctagagat 6060
tggattagat acaaccagtt caggagagaa ttgaccctca cagttttgga cattgtgtct 6120
ctcttcccga actatgactc cagaacctac cctatccgta cagtgtccca acttaccaga 6180
gaaatctata ctaacccagt tcttgagaac ttcgacggta gcttccgtgg ttctgcccaa 6240
ggtatcgaag gctccatcag gagcccacac ttgatggaca tcttgaacag cataactatc 6300
tacaccgatg ctcacagagg agagtattac tggtctggac accagatcat ggcctctcca 6360
gttggattca gcgggcccga attcaccttt cctctctatg gaactatggg aaacgccgct 6420
ccacaacaac gtatcgttgc tcaactaggt cagggtgtct acagaacctt gtcttccacc 6480
ttgtacagaa gacccttcaa tatcggtatc aacaaccagc aactttccgt tcttgacgga 6540
acagagttcg cctatggaac ctcttctaac ttgccatccg ctgtttacag aaagagcgga 6600
accgttgatt ccttggacga aatcccacca cagaacaaca atgtgccacc caggcaagga 6660
ttctcccaca ggttgagcca cgtgtccatg ttccgttccg gattcagcaa cagttccgtg 6720
agcatcatca gggctcctat gttctcttgg atacaccgta gtgctgagtt caacaacatc 6780
atcgcatccg atagtattac tcaaatccct gcagtgaagg gaaactttct cttcaacggt 6840
tctgtcattt caggaccagg attcactggt ggagacctcg ttagactcaa cagcagtgga 6900
aacaacattc agaatagagg gtatattgaa gttccaattc acttcccatc cacatctacc 6960
agatatagag ttcgtgtgag gtatgcttct gtgaccccta ttcacctcaa cgttaattgg 7020
ggtaattcat ccatcttctc caatacagtt ccagctacag ctacctcctt ggataatctc 7080
caatccagcg atttcggtta ctttgaaagt gccaatgctt ttacatcttc actcggtaac 7140atcgtgggtg ttag犯actt tsgtgggact gctggagtga ttatcgacag attcgagttc 了200
attccagtta ctgcaacact cgaggctgaa taagtcgagg taccgagctc gaatttcccc 7260
gatcgttc犯acatttggca at犯agtttc ttaagattga atcctgttgc cggtcttgcg 7320
atgattatca tataatttct gttgaattac gttaagcatg taataattaa catgtaatgc 7380
atgacgttat ttatgagatg ggtttttatg attagagtcc cgcaattata catttaatac 7440
gcgatagaaa acaaaatata gcgcgcaaac taggataa^t tatcgcgcgc ggtgtc已tct 7500
atgttactag atcgggaatt catcgatgat atcagatctg ccggtctccc tatagtgagt 7560
cgtattaatt tcgataagcc aggttaacct gcattaatga atcggccaac gcgcggggag 7620
aggcggtttg cgtattgggc gctcttccgc ttcctcgctc actgactcgc tgcgctcggt 7680
cgttcggctg cggcgagcgg tatcagctca ctcaaaggcg gtaatacggt tatccacaga 7740
atcaggggat aacgcagg犯agaacatgtg 3gca^aaggc cagcaaaagg ccaggaaccg 7800
taaaaaggcc gcgttgctgg cgtttttcca taggctccgc ccccctgacg agcatcacaa 7860
aaatcgacgc tcaagtcaga ggtggcgaaa cccgacagga ctataaagat accaggcgtt 7920
tccccctgga agctccctcg tgcgctctcc tgttccgacc ctgccgctta ccggatacct 7980
gtccgccttt ctcccttcgg gaagcgtggc gctttctcat agctcacgct gtaggtatct 8040
cagttcggtg taggtcgttc gctccaagct gggctgtgtg cacgaacccc ccgttcagcc 8100
cgaccgctgc gccttatccg gtaactatcg tcttgagtcc aacccggtaa gacacgactt 8160
atcgccBctg gcELgcagcca ctggtaacag gattagcaga gcgaggtatg taggcggtgc 8220
tacagagttc ttgaagtggt ggcctaacta cggctacact agaagaacag tatttggtat 8280
ctgcgctctg ctg犯gccag ttaccttcgg aaaaagagtt ggtagctctt gatccggcaa 8340
ac犯accacc gctggtagcg gtggtttttt tgtttgcaag cagcagatta cgcgcagaaa 8400
aaaaggatct caagaagatc ctttgatctt ttctacgggg tctgacgctc agtggaacga 8460
aaactcacgt taagggattt tggtcatgag attatcaa^a aggatcttca cctagatcct 8520
tttaaattaa aaatgaagtt ttaaatcaat ctaaagtata tatgagtaaa cttggtctga 8580
cagttaccaa tgcttaatca gtgaggcacc tatctcagcg atctgtctat ttcgttcatc 8640
catagttgcc tgactccccg tcgtgtagat aactacgata cgggagggct taccatctgg 8700
ccccagtgct gcaatgatac cgcgagaccc acgctcaccg gctccagatt tatcagcaat 8760
犯accagcca gccgg犯ggg ccgagcgcag aagtggtcct gcaactttat ccgcctccat 8820
ccagtctatt aattgttgcc gggaagctag agtaagtagt tcgccagtta atagtttgcg 8880
caacgttgtt gccattgcta caggcatcgt ggtgtcacgc tcgtcgtttg gtatggcttc 8940
attcagctcc ggttcccaac gatcaaggcg agttacatga tcccccatgt tgtgc犯aaa 9000
agcggttagc tccttcggtc ctccgatcgt tgtcagaagt aagttggccg cagtgttatc 9060
actcatggtt atggcagcac tgcataattc tcttactgtc atgccatccg taagatgctt 9120
ttctgtgact ggtgagtact caaccaagtc attctgagaa tagtgtatgc ggcgaccgag 9180
ttgctcttgc ccggcgtcaa tacgggataa taccgcgcca catagcagaa ctttaacccc 9240
cgaacatcgc ctcgctccag tcaatgaccg ctgttatgcg gccattgatt tgtagagaga 9300
gactggtgat ttcagcgggc atgcctgcag gtcgactcta gaggatcccg gacgagtgct 9360
ggggcagata agcagtagtg gtggggctac gaacatattc cttttccttc tggacgctac 9420
cactcatatg ttccaaaatt acaaatttgt cctttgtatt tgttgcaatt ttcatgtaag 9480
aaatccaacg aggctctgtt tttttttatt ggccttgttt ggatcctcag agctattaaa 9540
tagccctgca gaatcttact atttaggagt attaaacgta gattaccgac aaaaccgatt 9600
ccataaccct aggctatttt gcaagacaaa tctaatgatg tatattaatc catgattagc 9660
gactgattac tgtagcatca ctgtagcaaa tcatggatta atatacctcg ttagattcgt 9720
ctcgtaaaat agcctatggg ttttgtcatt aatctacgtt taatacttct aaatagcaag 9780attccggagg gctatttaat agccctccgg atccaaacag agccattgat catgtcgacg 9840 gaactctaac ttctcaattt aacttacttt acactttcta tcactttcta ttttcttggt 9900 gtcctaagaa aaccctacat ctttctgggt atatcataat acaagtggat tttctttttc 9%0 cttttttggc aacgctaccc ctgtaaactc agcatagcca tgctgcattt gtgcatgttg 10020 gtatatacac catcatccat gtcagagtac tgtattgcaa aacacatcta ttatctatct 10080 attataatac tacaagtcca ttaaatttcc tacaaacact tctaagctgc cacttggcgc 10140 tctaataaat tagagaaatc aaagaaattc taaggaaaaa gcatatattc taacactttg 10200 catgctacca acaatcgtga aatattatag aacaatttaa tatgttgatt atgctaccat 10260 acatttattc catcctaa犯tat犯acata tttagaaaag tgctaagtca aacattttaa 10320 ctttaattat ttatagtgaa aataaataaa agatcaatca tataaaaatg atattaaata 10380 caatgtcact cttctatcta gaacaattta ttttttataa atataaatat tattagtcaa 10440 agtagtatcc taaagaccgt tccaaaataa aacaaacgta tatttttagg acagaatgtg 10500 gagtgatcta taaacatacg tatctaacaa atagat 1053权利要求
1、一种转基因水稻TT51-1转化事件外源载体整合位点全序列，其特征是碱基序列如SEQ NO.1所示，由来源于水稻基因组的第1至673个碱基，来源于载体序列的第674至9364个碱基和来源于水稻基因组的第9365至10536个碱基共同组成；由来源于外源插入载体的第1至673个碱基和来源于油菜基因组序列的第674至9364个碱基共同组成的DNA序列，转基因水稻TT51-1事件外源插入载体5’端边界旁侧序列；由来源于油菜基因组序列的第674至9364个碱基和来源于外源插入载体的第9365至10536个碱基共同组成的DNA序列，转基因水稻TT51-1事件外源插入载体3’端边界旁侧序列；以上所述序列是转基因水稻TT51-1事件的特征序列，可以用于区分转基因水稻TT51-1和其他转基因和非转基因水稻，以及转基因水稻TT51-1的定性检测和定量分析。
2、 按权利要求1所述的转基因水稻TT51-1事件外源插入载体旁侧序列的应 用，其特征是利用该序列特征设计的转基因水稻外源基因整合事件TT51-1的事 件特异性定性PCR检测方法合成引物序列如下TT511G: 5， GCGTCCAGMGGAAAAGGAATA 3，和TT511V: 5， AGAGACTGGTGATTTCAGCGGG 3，；提取样品总DNA，分别利用TT511G/TT511V 引物组合进行PCR扩增；PCR产物以琼脂糖凝胶电泳分离，EB染色后鉴定是否存 在扩增产物，如存在扩增产物则说明样品中含有TT51-1来源的成分。
3、 按权利要求1所述的转基因水稻TT51-1事件外源插入载体旁侧序列的应 用，其特征是利用该序列特征设计的转基因水稻外源基因整合事件TT51-1的事 件特异性定量PCR检测方法合成引物序列如下TT511G: 5， GCGTCCAGAAGGAMAGGMTA 3'和TT511V: 5， AGAGACTGGTGATTTCAGCGGG 3，； 合成TaqMan探针序列如下TT511P: 5， FAM 一ATCTGCCCCAGCACTCGTCCG —BHQ1 3，;提取样品总DNA，分别利用上述引物TT511G/TT511V和探针TT511P组合进行荧光定量PCR扩增；转基因水稻TT51-1 基因组DNA被相同浓度非转基因水稻基因组DNA稀释至不同含量，以20ng的混 和水稻基因组DNA为模板，进行荧光定量PCR反应并建立标准曲线；以标准曲线 为参照测定含有TT51-1基因组DNA的混和水稻基因组DNA样品中TT51-1基因组 DNA的量。
全文摘要
本发明公开了一种转基因水稻TT51-1转化事件外源载体整合位点全序列及其应用，涉及生物工程技术领域中转基因水稻的安全评估和检测。本发明以转基因抗虫水稻品种TT51-1为材料，提取基因组DNA为模板，分四段扩增出包含旁侧水稻基因组序列的TT51-1事件全序列，如SEQ NO.1所示，由来源于水稻基因组的第1至673个碱基，来源于载体序列的第674至9364个碱基和来源于水稻基因组的第9365至10536个碱基共同组成；本发明适用于对转基因水稻TT51-1(包括亲本、杂种F1和后代)及其制品(包括植株、组织、稻谷、大米及其制品)实施检测、监测和安全管理。
文档编号C12Q1/68GK101302520SQ20081004824
公开日2008年11月12日 申请日期2008年7月1日 优先权日2008年7月1日
发明者卢长明, 刚 吴, 曹应龙, 均 李, 武玉花, 玲 肖 申请人:中国农业科学院油料作物研究所