一种基于Ms30基因建立的玉米雄性不育系保持和繁殖的方法
【技术领域】
[0001]一般地，本发明属于分子生物学和植物基因工程领域。具体地，本发明涉及用于恢复雄性不育玉米育性的育性恢复基因的构建体、包含所述构建体的重组载体、以及用所述构建体或重组载体转化的宿主细胞、转基因植物细胞和转基因玉米制备方法，且由此产生的玉米雄性不育系种子和保持系种子。
【背景技术】
[0002]作物杂种优势利用和杂交育种技术是一种提高作物产量和品质、保障国家粮食安全的有效手段。玉米是杂种优势利用的典范，其中杂交育种和制种技术的关键均在于母本的去雄。人工去雄相对容易，还可以通过机械去雄、化学杀雄等途径，但是这些策略也存在一些问题:一方面，这些技术大大增加了制种的成本，另一方面，因人工去雄的不彻底或不及时，会降低杂交种的纯度，造成生产上大面积减产，最终导致很大的经济损失。因此，提高杂交种种子纯度是当前玉米生产上急待解决的问题，而利用雄性不育系制种是提高杂交种质量最为有效的途径之一。
玉米核雄性不育材料是一种宝贵的种质资源，对玉米杂交种生产具有极其重要的意义，但长期以来，由于纯合核雄性不育系无法繁殖保持等问题，这类材料在实际生产上几乎没有被有效地利用起来。随着新的核雄性不育材料的不断发现，玉米育种家对其进行了多方面的研究和利用尝试，如利用标记性状与不育性的紧密连锁关系，开发了粒色标记系统法、黄绿苗连锁标记法和多花丝连锁标记体系等，但是由于标记性状与不育性连锁不完全、标记性状鉴定困难、鉴定时期滞后等问题，这些方法和尝试在玉米生产上并没有得到推广应用。随着现代生物技术的迅速发展，部分玉米核雄性不育材料的不育机理逐渐明确，为分子设计创制稳定的玉米不育系奠定了理论基础。
本发明旨在将隐性核雄性不育材料的育性恢复基因表达元件、抑制雄配子体形成的基因表达元件、荧光蛋白筛选标记基因表达元件和除草剂抗性基因表达元件串联起来，构建高效的玉米多控不育遗传转化载体，导入相应的隐性核雄性不育材料中，获得玉米雄性不育系的保持系，从而有效地解决玉米隐性核雄性不育系的保持和繁殖问题，以实现高效的不育化杂交育种和杂交制种。
【发明内容】
[0003]本发明的目的在于提供一种基于堪因的能恢复雄性不育玉米生育力的多控不育载体(构建体)及其应用的方法。
本发明所述的多控不育载体是指用于恢复雄性不育玉米生育力的遗传转化载体，其含有多个功能元件(4种不同类型表达盒的元件)，这些功能元件的组装和表达，使转化植株得以可控地(通过雄性育性、种皮颜色和除草剂抗性)用于玉米雄性不育系的繁殖和保持。
本发明所述的多控不育载体的4种不同类型表达盒元件，包含玉米雄性育性相关基因的表达盒、抑制植物雄配子体形成或功能的表达盒、除草剂抗性基因表达盒和颜色标记基因表达盒。
(1)具体地，玉米雄性育性相关基因的表达盒中，从上游至下游依次包括雄性器官特异表达启动子或组成型表达启动子、育性相关基因和终止子。
进一步，上述育性相关基因即玉米ifeJi堪因。
上述启动子可以是雄性器官特异表达启动子5126、Ms30基因的启动子或组成型表达的Ubiquitin启动子。
5126启动子是玉米花药特异性启动子。
Ubiquitin启动子来自于玉米多聚泛素蛋白基因(maize poly ubi gene)，由Ubi基因的启动子区，5’非翻译区和第一内含子组成。
(2)抑制植物雄配子体形成或功能的表达盒中，从上游至下游依次包括花药或雄蕊器官特异启动子、抑制植物雄配子体形成或功能的基因以及终止子。
具体地，上述花药或雄蕊器官特异启动子可以为Pg47启动子或Zml3启动子；抑制植物雄配子体形成或功能的基因为玉米α淀粉酶基因或Dam甲基化酶基因；终止子为Ιη2_1终止子或Pin II终止子。
Pg47和Zml3都是花粉特异性启动子，Pg47启动子来自玉米花粉特异性聚半乳糖醛酸酶(Pg47)基因的 5’ 调节区(Allen 和 Lonsdale，Plant J(1993) 3:261-271) ο
玉米α淀粉酶基因，可以是玉米α淀粉酶-1基因，该基因在雄性组织表达时会导致花粉粒能量来源崩溃，从而遏制花粉发育。
Dam 甲基化酶基因(Brooks et al., Nucleic Acids Res (1983) 11: 837-851)白勺表达产物能催化植物DNA中腺嘌呤残基的甲基化，经甲基化的腺嘌呤会影响到细胞存活。
终止子为In2-1终止子(玉米In2-1基因的终止子)或Pin II终止子(马铃薯蛋白酶抑制剂 II 的终止子，An et al., Plant Cell (1989) 1: 115-122)。
(3)除草剂抗性基因表达盒为35S启动子驱动Bar基因的表达盒，终止子是35S终止子。
35S启动子来自花椰菜花叶病毒基因组的增强子区(Franck et al.，Cell(1980)21:285-294)。
(4)颜色标记基因表达盒为由Ltp2启动子、红色荧光蛋白DsRed2基因或mCherry基因以及pin II终止子依次串联构成的表达盒。
Ltp2启动子是大麦脂质转移蛋白基因的启动子，在种子的糊粉层特异表达(Kalla etal., Plant J(1994) 6: 849-860)0
上述含多基因表达盒的构建体是以来自pCambia系列载体的pCambia3301 (信息见网址:http://www.cambia.0rg/daisy/cambia)为骨架进行依次构建的。
利用本发明所述的构建体，本发明还提供了一种用于保持玉米雄性不育植株的纯合隐性状态，并能繁殖玉米雄性不育系的保持系植株的方法，其中还包括鉴定玉米保持系种子和植株的方法。
本发明提供的获得上述雄性不育系和保持系的培育方法是将恢复雄性不育玉米育性的多控不育构建体导入目的植物一玉米隐性核不育系中获得的。
上述导入目的植物的方法是通过花粉管或农杆菌导入植物细胞、愈伤组织、组织或器官中获得植株。
本发明所述的用于保持玉米雄性不育植株的纯合隐性状态的方法，包含:(a)提供第一植株，所述第一植株包含雄性不育基因的纯合隐性等位基因(且所述第一植株是雄性不育的；(b)向上述第一植株中引入权利要求1所述的构建体以获得第二植株，所述第二植株只在同源染色体的其中一条染色体上含有所述构建体，即所述构建体为半合子状态；半合子(hemizygote)指的是具有二组相同的染色体组，但有一个或多个基因是单价的，只存在于一个染色体组，另一个染色体组没有与之相对应的等位基因，这种合子称为半合子。所述第二植株包含与所述第一植株相同的雄性不育基因的纯合隐性等位基因，当其构建体中的玉米雄性育性控制基因康达时将恢复第二植株雄性生育力；当抑制植物雄配子体形成或功能的基因(如淀粉酶基因或细胞毒素基因)表达时，所述第二植株抑制产生携带构建体的可育雄性配子的形成或功能，从而使得在所述第二植株中只能产生不包含所述构建体的可育雄性配子，其基因型为Ms30' (c)用所述第二植株的雄性配子使所述第一植株受精，以保持并产生所述第一植株纯合隐性状态的后代种子。
本发明所述的用于繁殖玉米不育系的保持系植株的方法，包含:通过权利要求21所述的第二植株自花受精，产生50%的含有所述构建体的种子(即保持系种子);产生50%的正常不育系种子。
鉴定保持系种子和植株的方法，具体为:将所述第二植株的种子播种后，其产生的花粉作为供体(父本)，与其它正常育性植株(作为母本)杂交，所获得Fl种子全部是正常颜色种子(非焚光种子)。
将所述第二植株自交后产生的种子在荧光显微镜下观察，具有红色荧光的种子即为保持系种子。
种植所述第二植株自交后产生的种子，使所述种子长成待鉴定植株，用除草剂喷洒所述待鉴定植株，保持系植株与非保持系植株相比，没有植物损伤症状或具有的损伤症状程度更轻。
【附图说明】
[0004]图1所示为玉米多控不育载体pMCS3001构建流程图。
图2所示为玉米多控不育载体pMCS3001的T-DNA区域图谱；T_DNA的大小为12，660bp，其中包含4个表达盒，从T-DNA的左边界到右边界分别是除草剂抗性基因Bar的表达盒，雄性育性恢复基因Ms30的表达盒，抑制花粉形成的α淀粉酶基因表达盒，以及颜色标记基因DsRed2的表达盒。
图3所示为玉米多控不育载体PMCS3001的质粒图谱。
图4所示为玉米多控不育载体PMCS3001的酶切鉴定图；M为I kb plus DNA marker ；I，2，3分别为pMCS3001质粒用HindII1、BamHI和BglII进行酶切。
图5所示为玉米多控不育载体pMCS3002、pMCS3003构建流程图。
图6所示为玉米多控不育载体pMCS3002的T-DNA区域图谱；T_DNA的大小为11，906bp，其中包含4个表达盒，从T-DNA的左边界到右边界分别是除草剂抗性基因Bar的表达盒，抑制花粉形成的表达盒，雄性育性恢复基因Ms30的表达盒以及颜色标记基因DsRed2的表达盒。 图7所示为玉米多控不育载体PMCS3002的质粒图谱。
图8所示为玉米多控不育载体PMCS3002的酶切鉴定图；M为I kb plus DNA marker ；I，2，3分别为pMCS3002质粒用HindII1、EcoRI和XbaI进行酶切。
图9所示为玉米多控不育载体pMCS3003的T-DNA区域图谱；T_DNA的大小为13，474bp，其中包含5个表达盒，从T-DNA的左边界到右边界分别是除草剂抗性基因Bar的表达盒，2个抑制花粉形成的表达盒(α淀粉酶基因表达盒和Dam甲基化酶基因表达盒)，雄性育性恢复基因Ms30的表达盒，以及颜色标记基因DsRed2的表达盒。
图10所示为玉米多控不育载体PMCS3003的质粒图谱。
图11所示为玉米多控不育载体PMCS3003的酶切鉴定图；M为1 kb plus DNA marker ；I，2，3分别为pMCS3003质粒用HindII1、EcoRI和XbaI进行酶切。
图12所示为多控不育载体(pMCS3001，3002, 3003)的玉米转化流程和植株的再生。图13所示为多控不育转基因玉米植株的PCR阳性鉴定；M为DL2000 DNA marker，I至22为不同的转基因植株，P为质粒阳性对照。H2O为水对照。
图14所示为多控不育转基因玉米植株的RT-PCR检测结果；M为DL2000 DNA marker,I至8样品为随机取样的转基因植株。图A为植株DNA的PCR检测，图B、C为I至8样品的RT-PCR检测，检测基因分别为Bar和玉米actin基因。
图15所示为收获的转基因玉米植株穗子