新型核酸分子的制作方法
【专利说明】新型核酸分子 发明领域
[0001] 本发明尤其涉及新型核酸分子、含有它们的载体、用所述载体转化的真核宿主细 胞和宿主细胞系以及它们在蛋白质生产，尤其是含有非天然氨基酸的蛋白质的生产中的用 途。
[0002] II直
[0003] 已观察到，在古细菌的一个亚组（代谢甲基胺的产甲烷古细菌）中天然进化的一 个正交RS/tRNA对对于氨基酸吡咯赖氨酸具有特异性。吡咯赖氨酸使用天然进化成正交于 所有其他氨基酸和tRNA的第21氨基酰-tRNA合成酶。
[0004] 吡咯赖氨酸是由琥珀密码子可靠地指定的唯一一种天然氨基酸。布莱特（Blight) 等人，2004表明PylRS和tRNApyl在大肠杆菌（E. coli)中可在琥珀密码子处掺入吡咯赖氨 酸。他们还表明wt PyLRS是天然混杂的并且可掺入赖氨酸的类似物。
[0005] 横山（Yokoyama)等人（EP1911840)展示，PylRS/tRNA系统在真核细胞中是正交 的，并且显示出在细菌细胞中将若干nnAA掺入到由琥珀密码子编码的靶蛋白中。这些作者 还鉴定了 PylRS中形成氨基酸结合口袋且起到相对于其他典型氨基酸选择吡咯赖氨酸的 作用的关键氨基酸残基。此位点处的突变产生能够识别tRNApyl并且用AzZ-lys将tRNApyl 氨基酰化的突变体（柳泽（Yanagisawa)2008)。
[0006] 这种正交性延伸至细菌和真核细胞。
[0007] PylRS是天然混杂的合成酶，其天然进化成不包括赖氨酸，但是将在不突变的情况 下掺入赖氨酸类似物，包括叠氮化物、炔烃和烯烃（柳泽等人，2008;诺伊曼（Neumann)等 人，2008;向井（Mukai)等人，2008;阮（Nguyen)等人，2009)。这种特异性的基础取决于 在pylRS结合口袋的氨基酸残基与吡咯赖氨酸的吡咯环之间的疏水性相互作用，其使该氨 基酸稳定并且将该氨基酸正确地定位在该合成酶的活性位点中（卡佛兰（Kavran)等人， 2007)。此RS/tRNA对已通过瞬时转染引入到细菌、酵母和哺乳动物细胞中并且已显示出对 于将多个非天然氨基酸掺入靶蛋白中是有效的。
[0008] 例如，EP 1911840展示了在大肠杆菌细胞中将Ν-ε-boc-赖氨酸掺入靶蛋白中。
[0009] tRNA在真核细胞中的表达通过RNA聚合酶III( "PolIII"）来进行，需要2型基 因内启动子，该2型基因内启动子含有二分结构，在该结构中，通过一个可变序列将已知为 A-盒和B-盒的两个短的保守序列元件分开。与哺乳动物tRNA基因相反，原核tRNA基因由 基因外启动子元件调控。因此，许多原核tRNA不含在哺乳动物细胞中充当启动子的A-盒 和B-盒元件。对于甲烧八叠球菌（Methanosarcina)来源的tRNApyl来说即是如此。
[0010] 将tRNApyl编码序列连同PylRS -起引入哺乳动物细胞中不导致报告基因构建体 的琥珀型抑制，推测是由于保守性A-盒和B-盒元件的缺乏（向井等人，2008)。
[0011] 汉考克（Hancock)等人（汉考克等人，2010,美国化学学会期刊（JACS))尝试在来 自巴氏甲烧八叠球菌（Methanosarcina barkeri)的tRNApyl基因内重新构建功能性A-盒 和B-盒，并且未能证实突变型tRNA基因在酵母中的功能性琥珀型抑制，表明将A-盒和 B-盒元件引入tRNA序列中的任何修饰改变了 tRNA架构，从而阻碍其总体功能。Mm tRNApyl 的序列分析显示B-盒与共有B-盒具有显著的同源性，但是A-盒显示出显著的多样性。
[0012] 寻找在哺乳动物细胞中表达抑制型tRNA的最优条件的尝试追溯至1982年（胡德 齐亚克（Hudziak)等人，1982,拉斯基（Laski)等人，1982)，在产生用于遗传疾病的基因治 疗的无义抑制型tRNA的背景下，其中终止密码子导致关键蛋白质转录的提前终止。
[0013]弓丨入细胞中的DNA的量、tRNA基因的拷贝数以及驱动其表达的启动子元件已经被 鉴定为达到最优tRNA水平，例如，以允许有效活性而不导致对细胞的毒性的关键元件。
[0014] 通过加工双顺反子构建体实现的tRNA的表达已经显示存在于真核细胞中。 tRNAarg-tRNAasp 的基因组编码基因对（genomically encoded gene pair)已在酵母细 胞中有所描述（施密特（Schmidt)等人，1980)。此基因表达为单个前体RNA，该单个前体 RNA经过转录后修饰，以在体内和在卵母细胞提取物中产生两个成熟tRNA(施密特等人， 1980)。在这种情况下，tRNA基因通过由CTTTGTTTCT(SEQ ID No. 68)组成的短间隔区分 开。这种基因排列还已经用于表达在酵母中正常不表达的tRNA (弗朗西斯（Francis)等人， 1990)。此处，含有共有A-盒和B-盒元件，但是在酵母中不转录的人tRNAmet基因当置于 tRNAarg元件下游时在酵母细胞中成功表达。诸位作者表明，两个RNA基因的距离影响转 录效率。当两个tRNA通过在酵母Arg-Asp tRNA对之间存在的短的10bp富含胸腺嘧啶核 苷的间隔子分开时，实现了外源tRNA的表达。当居间序列的这种间隔子长度增加（最多至 92bp)时，也观察到tRNAmet基因的表达，但是效率较低（弗朗西斯等人，1990)。在另一个 例子中，斯特罗比（Straby) (1988)利用双顺反子酵母Arg-Asp tRNA基因对来表达正常地 转录沉默抑制型tRNAsup(tyr)。在一个构建体中，tRNAsup替代tRNAasp基因并且保留存 在于酵母Arg-Asp tRNA对之间的短的10 bp的富含胸腺嘧啶核苷的间隔子并且显示出有 效的tRNAsup表达。
[0015] tRNA还已经在外部启动子如U6启动子（库昆特拉（Koukuntla)等人，2013 ;向 井等人，2008)、T7RNA聚合酶启动子（向井等人，2008)、SNR52(王（Wang)和王，2012)下 表达，并且表达为由上游tRNA基因调控的双顺反子构建体的组分（汉考克等人，2010 ;弗 朗西斯等人，1990 ;斯特罗比，1988 ;施密特等人，1980 ;向井等人，2008);表达为多聚体如 tRNAser (布沃里等人，2000)。
[0016] 向井等人（也参见US 8, 168, 407)以及汉考克等人针对tRNApyl的表达对多 种基因外启动子进行了检验。这些包括作为双顺反子构建体的人tRNA，例如tRNAval或 tRNAarg。虽然双顺反子系统在酵母细胞中是有功能的（参见汉考克等人），但是向井等 人（2008)报道，在真核细胞中，将tRNApyl基因置于真核tRNA(tRNAval)基因下游导致 tRNApyl的次优表达，这并不理想，因为表达水平过低而不能在哺乳动物细胞中进行最优琥 珀型抑制。
[0017] 此外，向井等人（2008)和汉考克等人（2010)针对tRNApyl的表达测试了 PolII 依赖性CMV启动子以及噬菌体T7聚合酶启动子，并且针对小的核RNA U6测试了该基因的 PolIII/3型启动子。具体地，诸位作者表明，连接至tRNApyl的编码序列5'端的U6启动子 当连同PylRS、nnAA以及包括琥珀密码子的靶标一起引入真核细胞中时尤其有效地导致琥 珀型抑制。
[0018] snRNA基因的启动子U6和H1已广泛地用于哺乳动物细胞中RNA种类的表达。鉴 于这些启动子作为基因外启动子的功能，它们尤其适用作表达工具。此外，它们允许置于这 些元件下游的基因的非常高的表达。
[0019] 然而，U6和H1启动子近期已表明在用这些构建体转染的细胞中具有导致细胞毒 性的有害作用，据认为这是因为此启动子的高转录需求而发生的（埃勒特（Ehlert)等人， 2010)(捷林（Giering)等人，2008)(斯蒂格迈耶（Stegmeier)等人，2005)。此外，U6启动 子尤其显示出影响RNA产物的定位，从而导致其在核中的普遍积累，因此产生其被细胞质 机器利用的问题（保罗（Paul)等人，2003)。
[0020] 虽然上述基因外启动子的使用导致tRNApyl的高水平表达，但是可能的是，所表 达的大部分tRNA错误定位在细胞核区室中并且不可用于细胞溶胶中的氨基酰化作用。虽 然观察到有效的琥珀型抑制，但是可能的是，这是由逸出核的相对少部分的tRNA造成的。
[0021] 因此，希望将替代性tRNA启动子工程化，以允许tRNA的更好定位及其对于翻译机 器的可用性。
[0022] 还希望将消除了已针对外部启动子如U6和H1启动子元件所报道的细胞毒性作用 的tRNA启动子工程化，这些外部启动子在稳定表达所述tRNA构建体的细胞系中可有利于 低水平的蛋白表达和细胞活力的丧失。
[0023] RNA聚合酶III(有时在此称为"polIII"）转录机器专用于在真核生物中产生小 尺寸的非蛋白编码RNA(ncRNA)(由帝尔奇（Dieci)等人，2013综述）。
[0024] PolIII转录基因结合由此聚合酶选择性识别的转录因子并且通过这些转录因子 激活。这些因子以几种不同的组合作用，如同通过对应地不同的启动子架构所指定的。这 些已分成三大种类：1型启动子（如5SrRNA所用的启动子）含有基因内元件（启动子存在 于该基因的编码序列内）并且由再分成A-盒、C-盒和中间元件（IE)的内部控制区组成。 这些元件是转录所必需的，因为它们被基础转录因子TFIIIC和TFIIIA结合。2型启动子 由tRNA基因使用并且含有由已知为A-盒和B-盒的保守元件组成的基因内启动子。这些 是转录因子TFIIIC的结合位点，该转录因子TFIIIC继而募集相对于转录起始位点延伸直 到-40位的上游区域上的起始因子TFIIIB。3型启动子是基因外的上游定位的启动子并且 由远侧和近侧序列元件以及TATA-盒组成。用于U6snRNA和RNA酶P(HI)RNA的启动子是 这个启动子种类的成员。这些启动子通过转录因子SNAPc(PBP或PTF)唯一识别，该转录因 子SNAPc继而募集TFIIIB的特异性变体。有趣的是，PolIII/3型启动子已适于在真核细 胞中表达抑制性RNA和表达缺乏A-盒和B-盒元件的tRNA，例如哺乳动物细胞中的U6启动 子（向井等人，2008)和酵母中使用的SNR52启动子（王和王，2012)。
[0025] 若干ncRNA基因的表达通过置于转录区域上游的启动子元件，类似于3型启动子， 结合基因内启动子，例如tRNA基因所用的A-盒和B-盒进行调控。这些可视为杂合启动 子-称为"4型"启动子，这是由于既存在基因外控制元件，又存在基因内控制元件。由这些 启动子调控的基因包括7SL(SRP)RNA基因、穹窿体RNA基因、以及EB病毒（EpsteinBarr virus)编码的小RNA(EBER)。
[0026] 7SLRNA是信号识别颗粒（SRP)的RNA组分，该信号识别颗粒介导分泌蛋白共翻译 插入内质网的腔中。其启动子元件尤其表征于恩格勒特（Englert)等人，2004。
[0027] 穹窿体RNA是包含在参与大分子组装和运输的大的细胞质核糖核蛋白颗粒中的 小RNA。其启动子元件尤其表征于莫辛克（Mossink)等人，2002。
[0028] EBER基因是具有未知功能的小RNA。EBER由在哺乳动物细胞中有效表达且其调控 启动子元件被良好表征的EB病毒基因组编码（豪（Howe)和舒（Shu)，细胞（Cell)，1989)。EBER具有两种已知变体-EBER1和EBER2,EBER2以较高水平表达。
[0029]发明概沐
[0030] 发明人已将新型DNA构建体工程化，以用于在新的且改进的启动子系统下，在真 核细胞，尤其是哺乳动物细胞中表达tRNApyl基因。
[0031] tRNApyl基因序列具有两个类似于真核A盒和B盒的内部区域，其中B盒样区域更 加类似功能性B盒。
[0032] 尽管先前重构共有A-盒和B-盒的尝试是不成功的，如汉考克等人（2010)和向井 等人（US8, 168, 407)所报道，但是发明人现已惊讶地发现，可更改tRNApyl序列以实现功 能化基因内启动子并且获得能够与WTpylRS结合介导有效的琥珀型抑制的tRNApyl。
[0033] 这种新tRNApyl基因可用于产生高活性且稳定的细胞系，以用于将nnAA掺入到细 胞中。
[0034] 发明人还已经发现，含有功能性基因内启动子元件的新的修饰的tRNApyl基因可 进一步改进，这通过将它们置于在4型启动子下表达的基因的5'调控元件的下游，从而重 构含有基因外和基因内元件二者的功能性4型启动子元件来实现。
[0035] 发明人还惊讶地发现，当所述tRNAglu基因和/或tRNAasp基因置于tRNApyl基 因上游且被更改成缺乏转录终止序列以便有效地形成双顺反子信息时，WT tRNApyl基因可 在tRNAglu基因和/或tRNAasp基因的转录控制下表达。
[0036] 携带本发明的新型tRNApyl基因的串联重复序列的DNA构建体已显示出导致增大 的琥珀型抑制。
[0037] 附图简要说明：
[0038] 图 1.本发明的DNA构建体（SEQIDNo:69-71)。
[0039] 图2.来自马氏甲烧八叠球菌（Methanosarcinamazei)的野生型tRNApyl的推测 性A-盒和B-盒区域（SEQIDNo: 3)。
[0040] 图3.野生型和突变型马氏甲烷八叠球菌（M.mazei)和巴氏甲烷八叠球菌 (M.barkeri)tRNApyl基因（分别为SEQIDNo:72、3、73、以及74)之间的序列比对。
[0041] 图4.当通过H1启动子表达时，tRNA突变体保留功能，如通过琥珀型抑制依赖性 GFP表达所证明的。
[0042] 图5.由包括基因内polIII启动子的突变型tRNApyl的使用所显示的功能性tRNA 表达，如通过增大的琥珀型抑制依赖性GFP表达所证明的。
[0043] 图6.tRNA突变体在哺乳动物细胞中是功能性的并且保留正交性。
[0044] 图7.通过增加同一个构建体中的基因数增加基因剂量导致增大的琥珀型抑制依 赖性GFP表达。
[0045] 图8. 4型5'启动子元件允许含有功能性B-盒的tRNA的表达，如通过琥珀型抑制 依赖性GFP表达所确定的。
[0046] 图9. 4型5'启动子元件和仅tRNAB突变体实现比野生型tRNA更高水平的tRNA 功能。
[0047] 图10.通过增加同一个构建体中的基因数增加基因剂量导致增大的琥珀型抑制 依赖性GFP表达。
[0048] 图11.由上游tRNAglu和tRNAasp基因驱动的tRNApyl表达。
[0049] 序列表简沭:
[0050]SEQIDNo 1 :tRNApyl 巴氏甲烧八叠球菌（Methanosarcinabarkeri)，WT
[0051]SEQIDNo 2 :tRNApyl 乙酸甲烧八叠球菌（Methanosarcinaacetivorans)，WT
[0052] SEQIDNo 3 :tRNApyl 马氏甲烧八叠球菌（Methanosarcinamazei)，WT
[0053] SEQIDNo 4 :tRNApyl 布氏甲烧八叠球菌（Methanococcoidesburtonii)，WT
[0054] SEQIDNo 5 :tRNApyl 哈氏脱硫杆菌（Desulfobacteriumhafniense)，WT
[0055] SEQIDNo6 :用于野生型和突变型A-盒和/或B-盒tRNApyl构建体的终止子序 列
[0056] SEQIDNo 7 :tRNApyl 马氏甲烷八叠球菌 A10G突变，tRNA-Al
[0057] SEQIDNo 8 :tRNApyl 马氏甲烷八叠球菌 A10G、A52C突变，tRNA-AB
[0058] SEQIDNo 9 :tRNApyl 马氏甲烷八叠球菌 A52C突变，tRNA-B
[0059] SEQIDNo 10 :tRNApyl马氏甲烷八叠球菌A10G、T14A、A52C突变，tRNA-A2B
[0060] SEQIDNo 11 :tRNApyl马氏甲烷八叠球菌A10G、T14A突变，tRNA-A2
[0061] SEQIDNo 12 :7SL启动子5'区域序列
[0062]SEQIDNo 13 :7SL构建体中使用的间隔子
[0063] SEQIDNo 14 :7SLtRNA-WT构建体
[0064] SEQIDNo 15 :7SLtRNA-B构建体
[0065] SEQIDNo 16 :7SLtRNA-Al构建体
[0066] SEQIDNo 17 :7SLtRNA-AB构建体
[0067] SEQIDNo 18 :7SLtRNA-A2B构建体
[0068] SEQ ID No 19 :7SL、穹窿体、EBER构建体中使用的终止子序列
[0069] SEQIDNo 20 :穹窿体启动子5'区域序列
[0070] SEQ ID No 21 :用于穹窿体构建体的间隔子
[0071] SEQIDNo 22 :穹窿体tRNA-WT构建体
[0072]SEQIDNo 23 :穹窿体tRNA-B构建体
[0073] SEQIDNo 24 :穹窿体tRNA-AB构建体
[0074] SEQIDNo 25 :穹窿体tRNA_A2B构建体
[0075] SEQIDNo 26 :EBER2 启动子 5' 区序列
[0076] SEQIDNo27 :EBER构建体中使用的间隔子
[0077] SEQIDNo 28 :EBER2tRNA-WT构建体
[0078] SEQIDNo 29 :EBER2tRNA-B构建体
[0079] SEQIDNo 30 :EBER2tRNA-Al构建体
[0080] SEQIDNo 31 :EBER2tRNA-AB构建体
[0081] SEQIDNo32 :EBER2tRNA-A2B构建体
[0082]SEQIDNo 33 :H1 启动子序列
[0083] SEQIDNo 34 :H1tRNA-WT构建体
[0084] SEQIDNo 35 :H1tRNA-B构建体
[0085] SEQIDNo 36 :H1tRNA-Al构建体
[0086] SEQIDNo 37 :H1tRNA-A2 构建体
[0087] SEQIDNo 38 :H1tRNA-A2B构建体
[0088] SEQIDNo 39 :l-tRNA构建体中使用的终止子序列：
[0089] SEQIDNo 40 :小家鼠（M.Musculus)tRNAglu编码序列
[0090] SEQ ID No 41 :具有上游和下游区域的小家鼠tRNAglu编码序列
[0091] SEQIDNo 42 :tRNAglu-tRNApylDNA构建体
[0092] SEQIDNo 43 :3XtRNAglu-tRNApyl:包括双顺反子构建体的3个重复序列的DNA 构建体。
[0093] SEQIDNo 44 :用于tRNAglu-pyl构建体的前导序列
[0094] SEQIDNo 45 :tRNAglu_pyl构建体中使用的终止子序列
[0095] SEQIDNo 46 :tRNAglu_pyl构建体中使用的终止子序列
[0096] SEQIDNo 47 :tRNAglu_pyl构建体中使用的基因间序列
[0097] SEQIDNo 48 :小家鼠tRNAasp编码序列
[0098] SEQIDNo 49 :具有上游和下游区域的小家鼠tRNAasp编码序列
[0099] SEQIDNo5〇:tRNAasp_pylDNA构建体
[0100] SEQIDNo 51 :2XtRNAasp-pyl:包括双顺反子构建体的2个重复序列的DNA构建 体
[0101] SEQIDNo 52 :tRNAasp-pyl构建体中使用的前导序列
[0102] SEQIDNo 53 :tRNAasp_pyl构建体中使用的终止子序列
[0103] SEQIDNo 54 :tRNAasp_pyl构建体中使用的基因间序列
[0104] SEQIDNo 55 :人tRNAglu编码序列
[0105] SEQIDNo 56 :人tRNAasp编码序列
[0106] SEQIDNo 57 :7SL启动子变体：7SL-1
[0107] SEQIDNo 58 :7SL启动子变体：7SL-2
[0108] SEQIDNo 59 :7SL启动子变体：SL28
[0109] SEQIDNo 60 :7SL启动子变体：7L63
[0110] SEQIDNo 61 :7SL启动子变体：7L23
[0111] SEQIDNo 62 :7SL启动子变体：7L7
[0112] SEQIDNo 63:EBER启动子变体：EBER1
[0113] SEQIDNo 64 :穹窿体启动子变体：Hvg3
[0114] SEQIDNo 65 :穹窿体启动子变体：Hvg2
[0115] SEQIDNo 66 :马氏甲烷八叠球菌pylRS氨基酸序列
[0116] SEQIDNo 67 :马氏甲烷八叠球菌pylRS核苷酸序列
[0117] SEQIDNo 68 :短间隔区
[0118] SEQIDNo 69 :图1中所示的DNA构建体
[0119] SEQIDNo 70 :图1中所示的DNA构建体
[0120] SEQIDNo 71 :图1中所示的DNA构建体
[0121] SEQIDNo 72 :图3中所示的DNA序列
[0122] SEQIDNo 73 :图3中所示的DNA序列
[0123] SEQIDNo 74 :图3中所示的DNA序列
[0124] SEQ ID No 75 :穹窿体启动子的近侧序列元件
[0125] SEQID No 76 :EBER启动子的SP1结合位点
[0126] SEQID No 77 :EBER启动子的ATF结合序列
[0127] 本发明的实施方式
[0128] 根据本发明的第一方面，提供了一种DNA构建体，该构建体包含tRNApyl编码序列 和RNA聚合酶III启动子序列，该构建体能够在真核表达系统中起作用以表达足以支持无 义抑制（尤其是琥珀型抑制）的功能性tRNAPyl。
[0129] 适当地，本发明的tRNApyl编码序列缺乏最终的三个核苷酸CCA，这三个核苷酸在 真核细胞中在转录后添加。
[0130] 适当地，本发明的DNA构建体包含在tRNApyl编码序列下游的终止子序列。适当 地，终止子序列由tRNA编码序列3'的充当转录终止信号的4个或更多个胸腺嘧啶核苷核 苷酸的群组成。
[0131] 本发明的优选终止子序列鉴定为SEQIDNo6、19、39、45、46以及53,尤其是SEQ IDNo. 6。
[0132] 在一个实施例中，本发明的DNA构建体包含tRNApyl基因的2至60个重复序列。 优选地，该DNA构建体包含2至30个重复序列，更优选地8个重复序列。
[0133] 适当地，本发明的DNA构建体包含tRNApyl基因，该基因包含tRNApyl编码序列， 以及功能性基因内RNA聚合酶III启动子。所述基因内RNA聚合酶III启动子包含两个组 分-A盒和B盒。
[0134] 适当地，本发明提供一种DNA构建体，其中tRNApyl基因含有在基因内RNA聚合酶 III启动子的A盒和/或B盒中的1或2个核苷酸位置上的突变。
[0135] 例如，本发明提供一种DNA构建体，其中tRNApyl基因含有在B盒中的1或2 (例 如1)个核苷酸中的突变。
[0136] 在本发明的一个实施例中，该DNA构建体包含tRNApyl基因，该基因包含基因内 PolIII启动子，例如如图1