、CXCL-13、CCL-2、CCL-3、CCL-4、CCL-5、CCL-21、IP-10、嗜酸性细胞 活化趋化因子（Eotaxin)、RANTES、PF4、GR0相关肽、IL-8 ;促凋亡配体，如TNF超家族的那 些，包括？&此、了陬、？〇-1^1;抗微生物肽，如€ [和0防卫素以及凯萨林菌素让37/1^4?18、 富组蛋白、组织蛋白酶G、azurocidin、糜蛋白酶、嗜酸性细胞衍生的神经毒素、高速泳动族 1核蛋白、HMGB1、乳铁蛋白；R0S和RNS产生酶如NADPH氧化酶（Ν0Χ)的成员、氧化氮合酶 NOS、IN0S)、嗜中性粒蛋白（包括蛋白酶，如弹性蛋白酶和组织蛋白酶）、Azurocidin(也称 为CAP37或HBP)、髓过氧化物酶、穿孔素、粒酶。
[0345] 在一个实施例中，靶蛋白是抗-Her-2抗体。
[0346] 在一个实施例中，靶蛋白是抗-IL6抗体。
[0347] 在一个实施例中，靶蛋白是抗-PSMA抗体。
[0348] 在一个优选的实施例中，抗-PSMA抗体是scfv。
[0349] 在一个优选的实施例中，FGF21经过修饰以在位置R131处包含非天然氨基酸 lys-叠氮化物或炔丙基赖氨酸并且通过三唑接头缀合至PEG部分。
[0350] PEG部分
[0351] 靶蛋白可缀合至PEG部分。可将PEG部分掺入抗体药物缀合物中。PEG部分可典 型地具有范围在5kDa与40kDa之间的分子量。更优选地，PEG部分可具有20kDa左右 的分子量。PEG部分可为直链或支链的。
[0352] 抗体药物缀合物（ADC)
[0353] 根据本发明的细胞系尤其适用于抗体药物缀合物（通过合成接头共价结合至指 定药物，典型地为细胞毒性药物，或甚至蛋白质或PEG基团的重组抗体）的制备，这些细胞 系本质是均匀的，其中每个抗体的药物（或其他缀合分子）的数量和那些药物在抗体上的 位置被明确地控制，由此获得含有掺入的非天然氨基酸的单克隆抗体并且通过正交化学将 其位点特异性地缀合至携带药物部分（或其他缀合分子）的接头。
[0354] 适当地，本发明提供一种用以获得ADC的方法，包括以下步骤：
[0355] 1.向本发明的稳定细胞系中引入携带编码全长抗体的DNA序列的一个或多个质 粒，由此在该序列的特定位置处引入终止密码子。
[0356]2.将具有非天然氨基酸（nnAA)装配在期望位置的修饰抗体纯化。
[0357] 3.通过正交化学使被修饰成包括与装配在抗体中的nnAA互补的官能团的细胞毒 素-接头衍生物与含有互补的反应性基团的修饰抗体反应。
[0358] 4.纯化所得的ADC。
[0359] 因此，本发明还提供ADC，由此抗体组分被修饰成在期望位置掺入携带独特反应性 官能团的非天然氨基酸，由此这种官能团允许缀合至药物部分（或蛋白质或PEG基团）。
[0360] 在一个实施例中，本发明提供一种包含抗-Her-2抗体的抗体缀合物，该抗体缀合 物通过包含三唑部分的接头缀合至选自蛋白质、药物以及PEG部分的一个或多个部分（例 如，一个、两个、三个或四个，优选地一个或两个，尤其是一个）。
[0361] 具体地，三唑部分可通过掺入抗-Her-2抗体的序列中的非天然氨基酸侧链中的 叠氮或炔部分和附接至蛋白质、药物或PEG部分的炔或叠氮部分的反应形成。
[0362] 在一个实施例中，三唑部分通过掺入抗-Her-2抗体的序列中的非天然氨基酸侧 链中的叠氮或炔部分和附接至蛋白质、药物或PEG部分的炔或叠氮部分在Cu(I)催化条件 下的反应形成。
[0363] 在另一个实施例中，抗体缀合物包含通过包含三唑部分的接头缀合至选自药物和 PEG部分的一个或多个部分的抗体，其中三唑部分通过掺入抗体的序列中的非天然氨基酸 侧链中的叠氮部分和附接至药物或PEG部分的炔部分的反应形成并且其中炔部分为环辛 炔部分。
[0364] 在另一个实施例中，抗体缀合物包含通过包含三唑部分的接头缀合至选自药物和 PEG部分的一个或多个部分的抗体，其中三唑部分通过掺入抗体的序列中的非天然氨基酸 侧链中的炔部分和附接至药物或PEG部分的叠氮部分的反应形成并且其中炔部分为端炔、 取代炔烃或环辛炔部分。
[0365] 环辛炔部分可例如为双环[6. 1.0]壬-4-炔、二苯并环辛炔、以及二氟环辛炔部 分。
[0366] 掺入抗体的序列中的非天然氨基酸适当地为PylRS的非天然氨基酸底物，尤其是 非天然赖氨酸类似物，如（S)-2-氨基-6 ((2-叠氮基乙氧基）羰基氨基）己酸。
[0367] 抗体
[0368] 在本发明中，ADC包括全长抗体以及抗体片段例如但不限于Fab、Fab2以及单链抗 体片段的使用。
[0369] 适于缀合至细胞毒素的抗体包括针对以下的那些：抗-Her2、抗-IL-6、TR0P-2、 SSTR3、B7Sl/B7x、PSMA、STEAP2、PSCA、PDGF、RaSL、C35D3、EpCam、TMCC1、VEGF/R、连接 蛋白-30、CA125 (Mucl6)、信号素-5B、ENPP3、EPHB2、SLC45A3 (PCANAP)、ABCC4 (M0AT-1)、 TSPAN1、PSGRD-GPCR、⑶2、EGFR(Herl)、TMEFF2、CD74、CD174(leY)、Muc-1、CD340(Her2)、 Mucl6、GPNMB、Cripto、EphA2、5T4、间皮素、TAG-72、CA9 (IX)、a-v-整联蛋白、FAP、Tim-1、 NCAM/CD56、α叶酸受体、CD44v6、硫酸软骨素蛋白聚糖、CD20、CA55. 1、SLC44A4、R0N、CD40、 HM1. 24、CS-1、β2 微球蛋白、CD56、CD105、CD138、LewisY、GRNMP、Tomoregulin、CD33、FAP、 CAIX、FasL受体、MMP基质金属蛋白酶。
[0370] 感兴趣的一个具体抗体为抗-Her-2抗体。
[0371] 感兴趣的另一个具体抗体为抗-PSMA抗体，尤其是scfv。
[0372] 所述scfv可例如缀合至奥瑞斯他汀、紫杉醇、多柔比星、或鹅膏蕈碱衍生物。
[0373] 本发明的实例:
[0374]实例1 :
[0375] 基因内启动子元件的产生
[0376] 利用定点诱变在tRNApyl基因中产生以下突变：将位置52处的A(是指WT马氏甲 烷八叠球菌tRNApyl序列，SEQIDNo3)突变成C;将位置10处的A突变成G并且将位置 14处的T突变成A。
[0377] 具体地，制备含有单个突变A52C(称为tRNA-B的构建体，SEQIDNo9)、所有上述 突变即A52C、A10G以及T14A(tRNA-A2B，SEQIDNo10)或仅A盒中的突变（A10G和T14A， tRNA-A2，SEQIDNo11 或A10G，tRNA-Al，SEQIDNo7)的构建体。
[0378] 具有基因内启动子的tRNApyl的功能性表达的展示
[0379] 为了评估tRNA变体的功能，建立体外测定，其中将细胞用tRNA构建体和编码含 有中断其阅读框的琥珀密码子的GFP(GFPY40)的报告基因构建体瞬时转染。将稳定表达 pylRS的HEK293细胞用多种tRNA构建体（lug)和GFPY40报告基因（lug)瞬时转染。在 不存在支持琥珀型抑制的元件的情况下，产生截短的GFP蛋白并且细胞不是荧光性的。然 而，功能性tRNA的引入和支持琥珀型抑制的nnAA的存在允许制备产生荧光性细胞的全长 GFP。GFP的表达水平反映了琥珀型抑制的效率并且通过流式细胞术来定量。通过定点诱变 产生全部在H1启动子的控制下的编码野生型tRNApyl(WTtRNA)、或在B-盒（BtRNA-SEQ IDNo9)、在A盒和B盒二者（A2BtRNA-SEQIDNo10)、或在A盒（A1tRNA-SEQIDNo7; 或A2tRNASEQIDNo11)中含有突变的tRNA基因并且对其进行测定。HI启动子确保变 体被表达并且允许我们检验引入tRNA基因中的突变的功能性作用。此外，制备仅用GFPY40 转染的样品，以建立背景GFP水平。使转染的细胞在氨基酸类似物lys叠氮化物（2mM)的 存在下生长并且孵育18小时。然后通过流式细胞术测定GFP荧光并且测定每个样品的平 均荧光强度。用FCSExpress分析数据并且使用标志物测定每个样品的平均荧光强度，这 些标志物将数据集合限制至显示出高于阴性对照的荧光的细胞。如图4中所示，数据表明， 在A-盒位点（Hl-AltRNA和HIA2tRNA)处引入突变就其支持琥珀型抑制的能力而言相 对于野生型H1WTtRNA不影响tRNA的活性。编码BtRNA和A2BtRNA的构建体支持琥珀 型抑制，尽管以低于WTtRNA的水平。构建体因此是功能性的并且可含有必要的遗传序列 以使得tRNA还能够在不存在上游启动子元件如H1启动子的情况下表达。
[0380] 为了开始评估tRNA突变是否可以支持tRNA的表达，我们在不存在H1启动子的情 况下测定了编码野生型tRNA的tRNA构建体。使用我们的上述体外琥珀型抑制测定对编码 野生型tRNApyl(WTtRNA)或在B-盒（BtRNA-SEQIDNo9)或在A盒和B盒二者（A2B; A2BtRNA-SEQIDNo10)中含有突变的构建体进行测定。使用在HI启动子的控制下的WT tRNA(Hl-tRNA)作为阳性对照，此外，将一个样品仅用GFPY40报告基因转染，以示出在不存 在tRNA的情况下的背景琥珀型抑制。将转染的细胞暴露于2mMlys-叠氮化物nnAA并且 将细胞孵育三天。通过流式细胞术检验GFP表达并且测定平均荧光强度。将这些数据作 图并且在图5中示出。Hl-tRNA构建体先前已显示出能够进行有效的琥珀型抑制（MFI= 1，004, 228. 00)。然而，在缺乏tRNA的样品中没有观察到GFP荧光（GFPY40;MFI= 65, 929) 并且在含有wttRNA的样品中观察到低水平的GFP荧光（MFI= 114, 478. 1)。tRNA突变体 BtRNA(MFI= 410, 131. 1)和A2BtRNA(MFI= 242, 747. 9)相对于wttRNA构建体实现了 高4倍和2. 5倍的GFP表达。此数据表明，B和A2B突变重构了功能性基因内启动子并且 所表达的tRNA是功能性的，因为它可介导nnAA至靶蛋白的递送。
[0381] 鉴于已经建立了引入pyltRNA序列中的B突变实现了支持琥珀型抑制的tRNA的 表达，我们接着提出这种突变是否影响tRNA的正交性并且导致天然氨基酸的掺入的疑问。 为此，将3H7细胞用编码WT-tRNA、B-tRNA、Hl-tRNA以及Hl-BtRNA的表达构建体连同 GFPY40报告基因瞬时转染。使转染细胞如图所指示（图6)的那样在2mMlys叠氮化物的 存在下和nnAA的不存在下生长，并且三天后通过流式细胞术评估GFP表达。此外，检验仅 用GFPY40转染的样品，以确定在不存在tRNA情况下的背景琥珀型抑制水平。图3显示出， 在lys-叠氮化物的存在下，Hl-tRNA(MFI= 347, 958)、Hl-BtRNA(MFI= 313, 386)以及 B-tRNA(MFI= 232, 505)均支持稳定的琥珀型抑制以及全长GFP高于背景水平的表达（MFI =23, 487)。在不存在nnAA的情况下，在含有这三种构建体的细胞中观察到背景水平的 GFP表达（对应地，MFI= 33, 452 ;36, 217 ;42, 104)。这些数据表明，BtRNA是正交性的并 且在不存在包括先前所示的构建体的nnAA的情况下，不促进高于背景的琥珀型抑制水平， 以支持高水平的表达（Hl-tRNAB)。在WTtRNA(MFI33, 781)与缺乏基因外启动子元件的 tRNAB(232, 505)之间的GFP表达的比较证实了B突变产生功能性基因内启动子。实际上， BtRNA构建体使得与WTtRNA相比，琥珀型抑制依赖性GFP表达水平增大7倍。
[0382] 实例 2
[0383] 拷贝数和琥珀型抑制
[0384] 为了增加由tRNA-B构建体进行的琥珀型抑制的效率，我们评估了拷贝数增加是 否导致活性增加。
[0385] 将两个拷贝的WT、B、或A2BtRNA串联克隆以产生含有两个拷贝的WT、B、或A2B tRNA的单个载体。为了评估这些构建体对增加的基因剂量的影响，将表达WTpylRS的细胞 用tRNA构建体和GFPY40报告基因构建体瞬时转染并且在两天后测定GFP表达。图7中 的数据显示，8〇\^1 = 67,489)和厶28七1?熟(]\^1=61，950)可支持高于由町七1?熟(]\^1 =18, 002)支持的琥珀型抑制水平，证实了B和A2BtRNA含有功能性启动子元件的观察。 此外，我们观察到，B(MFI= 110,941)和A2BtRNA(MFI= 96, 158)的串联拷贝导致琥珀 型抑制效率的同时增加，如通过GFP表达所确定的。基因剂量不提高WTtRNA琥珀型通读 (readthrough)(MFI= 20,617)〇
[0386] 实例 3
[0387] tRNApyl在基因外启动子和杂合（4型）启动子下的表达
[0388] H1启动子已在此处和由其他人表明支持tRNApyl的表达。然而，通过在哺乳动物 细胞中使用polIII/3型（例如H1和U6)启动子，观察到显著的有害作用。因此，为了克服 这些缺陷，针对其表达tRNApyl的能力，对已知控制RNA表达的一组基因外启动子元件进行 评估。基因外启动子元件已知调控人穹窿体、EBER以及7SLRNA的表达（恩格勒特等人， 2004 ;Kickhoefer等人，2003 ;豪和舒，1989)。这些启动子中的每一个已经显示出募集转录 因子TFIIIc，而不是SNAPc(由U6和H1使用）（Moqtaderi等人，2010)(费尔顿-埃德金 斯（Felton-Edkins)等人（2006)生物化学杂志（JBiolChem)281:33871)。有趣的是，由 这些启动子进行的有效转录需要基因内和基因外调控序列二者（恩格勒特等人，（2004); Kickhoefer等人，（2003);以及豪和舒（1989))。含有共有A-盒和B-盒的功能性tRNApyl的 鉴定开启了它们用于表达tRNApyl之门。由先前所述的序列构建已知调控穹窿体、7SL、以 及EBER2RNA的启动子元件（恩格勒特等人，2004 ;Kickhoefer等人，2003 ;豪和舒，1989)。 我们测试了人穹窿体和7SLRNA基因的启动子以及EB病毒EBER基因的基因外启动子元 件，这通过将它们置于编码WTtRNA、BtRNA、A2BtRNA的基因、以及含有A10G和A52C(AB tRNA;SEQIDNo. 8)或含有在A10G处的单个突变（A1tRNA;SEQIDNo. 7)的另外变体的 5'来实现。
[0389] 每个构建体的活性通过与如上所述的GFPY40报告基因一起瞬时转染到稳定表达 WTpylRS的细胞中来评估。对于这个实验，使用lug的编码所指示的构建体中的每一个的 PCR产物。在每种情况下，将细胞于lys叠氮化物nnAA中暴露三天并且通过流式细胞术测 定GFP水平。测定每个样品的平均荧光强度并且作图（图8)。使用仅用GFPY40 (无tRNA) 转染的样品建立在不存在tRNA的情况下（无tRNA，MFI= 137, 589)的背景琥珀型抑制。 此外，用Hl-WTtRNA转染的样品限定GFP的高表达水平和tRNA的功能（H1WTtRNA，MFI = 828,503)并且通过缺乏基因内启动子的tRNA确定低水平的琥珀型抑制（WTtRNA，MFI =117, 626)。如图7中所示，基因外启动子的使用（EBER、穹窿体以及7SL)显示出与具有 EBER、穹窿体以及7SL启动子的WTtRNA相比提高的GFP报告基因表达水平。然而，这些启 动子中的每一个的改善的性能需要基因内tRNA元件。实际上，用7SLWTtRNA转染的细胞 显示出最小的琥珀型抑制（7SLWTtRNA，MFI= 106,075)。然而，使用含有保守性A-盒和 B-盒元件的tRNA提高了相对琥珀型抑制效率（7SLtRNAA1，MFI= 114,393 ;7SLAB，MFI =210, 380 ;7SLA2B，MFI= 245, 120)。有趣的是，在仅含有功能性B-盒的tRNA构建体的 情况下观察到最高的琥珀型抑制水平（7SLBtRNA，MFI= 265, 396)。在穹窿体RNA启动子 的情况下也观察到这种总体趋势。含有功能性B盒（穹窿体BtRNA，MFI= 170,838)的构 建体显示出与含有共有A盒和B盒二者的那些（穹窿体A2BtRNA，MFI= 154,445)和具有 野生型tRNA的构建体（穹窿体WTtRNA，MFI= 102, 415)相比改善的性能。当tRNA含有保 守性A-盒和B-盒元件时，EBER启动子功能最佳（EBERA2BtRNA，MFI= 136, 196)。这种 构建体性能优于含有B突变的tRNA(EBERBtRNA，MFI= 113, 496)和含有单个B-盒和部 分重构的A盒的tRNA(EBERABtRNA，MFI= 119,719)以及未修饰的tRNA(EBERWTtRNA， MFI= 99, 393)。我们的数据表明，穹窿体snRNA、7SLRNA以及EBERRNA的基因外RNA启 动子可支持tRNApyl的表达和功能。琥珀型抑制的效率取决于功能性B-盒的存在。
[0390] 我们接着测试了琥珀型抑制活性，以直接比较各种功能性tRNA表达构建体之间 的tRNA依赖性琥珀型抑制的水平（图9)。在该测定中，将稳定表达WTpylRS的细胞用lug 的GFPY40报告基因和lug的tRNA表达质粒（Hl-tRNA、穹窿体BtRNA、7SLBtRNA、EBERB tRNA、BtRNA或WTtRNA)中的一个瞬时转染。图 9 显示 7SL-BtRNA(MFI= 167,024)和穹 窿体-BtRNA(MFI= 168,298)可支持与在Hl-tRNA(MFI= 241,901)构建体的情况下所观 察到的相当的琥珀型抑制活性，从而导致与tRNA-B构建体（MFI= 89, 869)和WTtRNA(MFI =25, 459)相比，相对于Hl-tRNA的活性的提高（图8)。
[0391] 为了增高在BtRNA的情况下由基因外7SL启动子支持的琥珀型抑制水平，我们检 验了相对于HltRNA，7SL-tRNA-B的串联重复序列的作用。为此，将两个拷贝的7SL-tRNA-B 构建体克隆到单个载体中并且使用稳定表达WTpylRS连同GFPY40的细胞的瞬时转染来评 估琥珀型抑制水平。将细胞用lys叠氮化物孵育三天并且通过流式细胞术将GFP水平定 量。图10显示，7SL-BtRNA以及Hl-tRNA的增加的基因拷贝导致提高的琥珀型抑制效率 和GFP表达水平。在该实验中，使用仅用GFP转染的细胞作为阴性对照（MFI=0)。用串联 拷贝的町38嫩(2\!11七8嫩，1^1 = 629)转染的细胞导致6??￥40报告基因构建体的表达比 单个拷贝的HltRNA(MFI= 453)增加了 28%。在缺乏外部启动子但是含有功能性B盒的 tRNA的串联重复序列的情况下观察到相同效果。此处，tRNAB的串联重复序列（2XtRNA B，MFI366)显示出比单个基因拷贝（tRNAB，MFI= 329)提高10%。串联拷贝的7SLtRNA B(2X7SLtRNAB，MFI= 568)也显示出比在单个基因（7SLtRNAB，MFI= 520)的情况下 所观察到的信号增大了 8. 5%。在7SL启动子的控制下编码缺乏功能性B盒的野生型tRNA 的构建体先前已显示出不如7SLtRNAB有效。该前一个构建体包括在这个分析中以验证 这种效果（7SLtRNAWT，MFI= 312)。实际上，该数据证实了B突变改善了 7SL-tRNA构建 体的性能的先前实验。这些数据表明，增加的基因数可提高抑制性tRNA的效率。此外，这 些数据还表明，7SL启动子在促进tRNApyl的表达方面与H1启动子等效。
[0392] 实例 4
[0393] tRNApyl作为双顺反子信息的部分的表达
[0394] 我们还针对其表达tRNApyl的能力测试了双顺反子tRNA表达构建体的效用。此 处，利用了鼠tRNAGlu和tRNAAsp。在每种情况下，制备构建体的多个重复序列，以增加活 性（3XGlu-pyl和2XAsp-pyl)。此处，将3H7细胞用lug的报告基因构建体GFPY40和lug 的所指示的tRNA表达载体瞬时转染（图11)并且用lys-叠氮化物孵育三天。通过流式细 胞术收集数据，并且将每个样品的平均荧光强度作图。我们观察到，相对于Hl-tRNA阳性对 照，双顺反子构建体实现了高水平的琥珀型抑制。由鼠tRNAglu和pyltRNA对的三个串联 重复序列（3XGlu，MFI= 419)和鼠tRNAasp-pyltRNA对的两个串联重复序列（2XAsp， MFI= 419)组成的tRNA表达盒显示出>90%的由Hl-tRNA(MFI= 453)产生的信号，表明 它们有效地产生功能性tRNA的能力。此外，7SLtRNAB(MFI= 520)还展示了有效的tRNA 表达。由7SLWTtRNA(MFI= 312)组成的构建体被包括在内作为低效率的量度。此外，使 用仅含有GFPY40报告基因的细胞系作为阴性对照（MFI= 0)。这个数据表明，双顺反子构 建体是用于表达缺乏功能性A-盒和B-盒元件的tRNA的有效方法并且还表明哺乳动物细 胞可加工这些RNA分子以产生成熟且功能性的tRNA。
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