专利名称：核酸分子MIP3αANA6及其在制备免疫抑制药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物药物领域。具体涉及一些能抑制人MIP3CI表达的核酸分子及其 在制备免疫抑制药物中的应用。
背景技术：
目前免疫排斥反应是各种组织器官移植失败的首要原因，免疫排斥通过树突状细 胞和效应细胞起作用，应用免疫抑制剂是其主要的治疗方法，皮质类固醇、环孢素A和他可 莫司是较常用的药物，是在免疫应答反应时发挥作用，只能针对效应细胞起作用，因此虽有 一定的治疗效果但却效果不佳，对于高危患者，激素治疗常常无效。同时与MIP3CI相关的 全身其它免疫性疾病银屑病、类风湿性关节炎、肾小球肾炎、肾小管肾炎、克罗恩氏病和溃 疡性结肠炎等的治疗尚未找到特效药。本研究设计并合成的核酸分子，能特异性地有效抑 制人MIP3ci基因表达，在免疫应答启动阶段及效应阶段，针对树突状细胞和效应细胞同时 起作用，以阻断组织器官的免疫排斥反应，并制备免疫抑制相关药物，有效地治疗与ΜΙΡ3 α 相关的全身其它免疫性疾病。核酸分子ΜΙΡ3 α ΑΝΑ6是参考GenBank数据库人CCL20 mRNA (NM_004591)序列，利用美国 Ambion公司网站提供的 siRNA Target Finder (http:// www. Ambion. com/tehlib/misc/siRNA_finder hml)，根据RNAi设计原则设计，由北京赛百盛生 物试剂公司化学合成。
发明内容
本发明的目的是提供了一些用于抑制人MIP3 α基因表达的核酸分子。本发明的另一个目的是提供了上述核酸分子的应用。本发明的目的是提供了一些用于抑制人ΜΙΡ3 α基因表达的核酸分子，它们具有 特异性抑制人MIP3CI的表达从而达到免疫抑制的作用，所述核酸分子为双链核酸分子，其 DNA序列如下
正义链 Sl :5，-ATATATTGTGCGTCTCCTC-3，； 反义链 S2 :5’ -GAGGAGACGCACAATATAT-3，。上述核酸分子在本发明中被称为ΜΙΡ3 α ΑΝΑ6。其中A、T、G、和C分别是腺嘌呤核苷酸、胸腺嘧啶核苷酸、鸟嘌呤核苷酸和胞嘧啶 核苷酸。在本发明中，术语“核酸分子ΜΙΡ3 α ΑΝΑ6”指具有抑制人ΜΙΡ3 α基因表达，并且含 有与Sl或/和S2序列高度同源的核酸序列。该术语还包括与Sl或/和S2序列的同源性 至少70%，较佳地至少80%，更佳地至少90%的核苷酸序列。该术语还包括Sl或S2的核酸序列变异形式。这些变异形式包括(但并不限于) 若干个(通常为1-15个，较佳地1-10个，更佳地1-5个)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以 及在5’和/或3’端添加数个(通常为10个以内，较佳地为5个以内)核苷酸。例如，Sl或 S2后(3’端)加入若干dT (脱氧胸苷)后形成的序列。
3
在发明中，MIP3 α ΑΝΑ6的序列是Sl或/和S2。或者，在发明中，ΜΙΡ3αΑΝΑ6的序列包括Sl或/和S2。本发明还提供了一种重组载体，它含有序列中含有Sl和/或S2的核酸分子。在本发明中，可选用本领域已知的各种载体，如市售的载体。例如，选用市售的载 体，然后将含有本发明ΜΙΡ3 α ΑΝΑ6核酸序列中含有Sl和/或S2，可操作地连接于表达调控 区域序列，形成重组载体。例如，可以采用慢病毒、腺病毒及PSUPER等表达载体系统。慢病 毒属于逆转录病毒亚属，不仅具有感染分裂靶细胞并整合其基因组中，尤其具有感染多种 非分裂细胞能力，因而，慢病毒载体已作为基因转移的有效工具，被广泛应用于基因功能尤 其是基因治疗的研究。本发明中还提供了一种宿主细胞，它含有序列包括中含有Sl和/或S2的核酸分子。在本发明中，术语“宿主细胞”主要是真核哺乳动物细胞。常用的有293FT细胞， HaCaT细胞，HIEC细胞等。另一方面，本发明还提供了上述的核酸分子MIP3CIANA6的制备方法，即按照 MIP3 α ΑΝΑ6的序列，将各个核糖核酸分子依次脱水缩合。本发明的核酸分子ΜΙΡ3 α ΑΝΑ6可以采用各种常规的制备方法制备。本发明的核 酸分子ΜΙΡ3 α ΑΝΑ6序列通常可以用人工合成或酶解法的方法获得。本发明还提供了上述的核酸分子MIP3ciANA6在制备抑制人MIP3ci的表达的药物 中的应用以及在制备免疫抑制药物中的应用。体内和体外结果均验证，本发明的ΜΙΡ3αΑΝΑ6可明显削弱ΜΙΡ3α的表达。实验 证明，ΜΙΡ3 α (GeneBank, ΝΜ_004591)通过趋化抗原提呈细胞和T细胞的迁移以促使免疫 反应的发生，因此，削弱ΜΙΡ3 α的表达就同时从免疫应答的启动阶段和效应阶段发挥抑制 降低免疫反应的作用。本发明的核酸分子ΜΙΡ3 α ΑΝΑ6及其类似物，在治疗给药时，可有不同的效果。通 常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中。配制好的药物 组合物可以通过包括(但并不限于)局部给药、口服、皮下或皮内的常规途径进行给药。本发明中，所述的免疫抑制药物是含有效治疗量的核酸分子ΜΙΡ3 α ΑΝΑ6和药学 上可接受的载体介质联用。这类药物组合含有治疗有效剂量的化合物和药学上可接受的赋 形剂或载体介质。这类载体介质包括但不限于盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其 组合。给药方式应与药物制剂相匹配。本发明的核酸分子MIP3ciANA6可以被制成霜剂、缓 释片、胶囊和针剂形式，其药物组合物可通过常规或特定的方法进行制备。药物组合物如霜 剂、片剂、胶囊、针剂和溶液宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量为lOng/cm2 10 μ g/ cm2 (局部外用)和1 μ g/kg 20mg/kg体重，是治疗的有效量。此外，本发明的MIP3 α ΑΝΑ6 还可与其他治疗剂一起使用。本发明中，所述药物可以是霜剂、缓释片、胶囊和针剂。本发明为全身其它免疫性疾病的治疗和缓解提供了新的途径和手段。
图 1 为 GAPDH 的 RT-PCR 产物；图2为MIP3 α的RT-PCR产物；其中图1、图2中的NI为对照组，1为浓度为IOnmol的 ΜΙΡ3 α ΑΝΑ6短发夹RNA，2为浓度为20nmol的MIP3 α ΑΝΑ6短发夹RNA，3为浓度为IOOnmol 的 ΜΙΡ3 α ΑΝΑ6 短发夹 RNA ；
图3为慢病毒感染人角质形成细胞荧光及可见光X 100 ； 图4为ΜΙΡ3 α稳定干扰细胞克隆荧光及可见光X 200 ； 图5为人胚肾细胞荧光及可见光X 100 ；
图6为HaCaT及各阳性细胞克隆的荧光定量PCR反应曲线，其中A组为引物是GAPDH 的反应扩增曲线；B组为ΜΙΡ3 α稳定干扰细胞克隆的CCL20反应扩增曲线C组为HaCaT 的CCL20反应扩增曲线；X轴表示PCR反应的循环数，Y轴表示荧光信号的强度。
具体实施例方式实施例1 ΜΙΡ3 α ΑΝΑ6短发夹RNA转染人角质形成细胞抑制ΜΙΡ3 α mRNA的表达
1.选择生长状态良好的HaCaT细胞，按3.0 X IO4细胞/cm2接种于24孔板中，经24 h 培养，待细胞密度约60%-80%时用于转染，用PBS缓冲液洗两次，加900 μ L的新鲜无血清DK
培养基·
2.取4yLLipofectamine 2000 Reagent到无血清DK培养基中终体积为50 μ L，室 温孵化5min，分别取浓度为20um的经上海生物工程有限公司合成的短发夹RNA (shRNA) 结构的核酸分子MIP3 α ΑΝΑ6正反义双链(10 nmol/L -100 nmol/L)加入到50uL无血清DK 培养基中。将上述两种溶液混合，室温静置20min后加入铺有细胞的24孔板。3.于37°C及5%C02条件中培养6_8h后，将培养基改为含有终浓度均为lOOng/ml 的TNF- α和IL-I β的新鲜DK培养基继续于37°C及5%C02条件中培养。4. 24h后，收集细胞RNA。紫外分光光度计检测RNA浓度，1. 0%琼脂糖凝胶电泳检 测RNA纯度。5.分别取Iug的RNA行20uL体系的逆转录反应，再分别取2uL的逆转录cDNA进 行PCR反应，设置GAPDH为内参，对MIP3 α mRNA进行半定量。结论以人角质形成细胞系(HaCaT)为对照，转染了 MIP3 α ANA6_shRNA片段的 HaCaT细胞MIP3 α mRNA水平均有下调，其MIP3 α mRNA抑制率高达73. 4% 85. 3%。这种细 胞可作为制备具有抑制人MIP3 α的表达的皮肤的生物材料
实施例2 pSUPER-MIP3 α ΑΝΑ6对人胚肾细胞表达ΜΙΡ3 α的干扰效益 实验步骤
1.标准6孔板中，将人胚肾细胞(293FT)每孔按3 X IO4细胞/cm2接种，培养24h后用 于转染，转染时细胞密度为60%-80%，用PBS缓冲液洗两次，加1700 μ L的新鲜含10%小牛 血清的DMEM培养基；将4. 0 μ g质粒DNA (含核酸分子MIP3 α ΑΝΑ6 DNA片段)加入150mM NaCl 中终体积为 150 μ L,另取 8 μ L jetPEI transfection reagent 到 150mM NaCl 中终 体积150 μ L，室温孵化5min ；将上述两种溶液混合，室温静置20min后加入铺有细胞的6孔 板，于37°C及5%C02条件中培养。共转染2孔细胞，设置3组重复实验。并以未转染质粒 的293细胞为对照组。2. 24h后倒置显微镜下观察荧光表达情况，并去除原培养基，1孔中加入新鲜的含 10%小牛血清的DMEM培养基2ml，另一孔中加入含100ug/ml的TNF- α和IL-1 β的总体积
5为2ml的含10%小牛血清的DMEM培养基，继续于37°C及5%C02条件中培养。3. 24h后收集细胞上清，用于MIP3aELISA实验检测ΜΙΡ3α蛋白表达的变化情况； 并提取细胞总RNA，行荧光定量PCR (以GAPDH为内参)检测ΜΙΡ3 a mRNA相对表达量的变 化情况。结论
A.质粒转染293FT细胞的转染率达80%左右，荧光显微镜下可见大量表达GFP荧光的 293FT细胞。B.经荧光定量PCR检测转染后的293FT细胞MIP3 a mRNA表达水平较未转染细 胞显著降低，抑制率约80%以上。C.经MIP3a ELISA实验检测转染后的293FT细胞MIP3 α蛋白表达水平较未转 染细胞明显下降，抑制率约75%以上。实施例3 MIP3 α稳定干扰细胞克隆的体外效应 实验步骤
1.选择生长状态良好的人角质形成细胞，按3.OXlO4细胞/cm2接种于24孔板中，经 24 h培养，待细胞密度约60%-80%时用于转染，用PBS缓冲液洗两次；
2.用含核酸分子MIP3aANA6DNA片段的慢病毒pHSER上清500 μ L及终浓度8mg/ L Ploybrene感染24孔板中人角质形成细胞，于37°C及5%C02条件培养；48h后更换新鲜 RMPI1640 (10%CS),于37°C及5%C02条件培养。第6天观察GFP (绿色荧光)荧光，计算转 染效率。3.G418压力培养5-8周后筛选出得到MIP3ci稳定干扰细胞克隆，将阳性克隆扩增培养。4.阳性克隆扩增培养于6孔板中，3. OX IO4细胞/cm2的密度，培养48h后加入细 胞因子浓度均为100 μ g/L的细胞因子TNF- a、IL-I β，培养24h后，收集RNA，用于MIP3 a 实时荧光定量PCR检测。培养48h后，收集细胞上清，用于MIP3 a ELISA检测和体外趋化朗 格汉斯细胞(LC)实验。结论
A.慢病毒感染6 d后大量人角质形成细胞表达GFP荧光，阳性率达90.0%。B. G418压力筛选出得到MIP3 α稳定干扰细胞克隆表达较强的GFP荧光。C.经荧光定量PCR检测阳性细胞克隆的MIP3 a mRNA表达水平较未转染细胞显 著降低，抑制率约77. 2% 81. 3%。D.经MIP3a ELISA实验检测阳性细胞克隆的MIP3 α蛋白质水平的变化较未转 染细胞明显降低，抑制率约70. 0% 90. 7%。E.实验组阳性细胞克隆48h上清体外趋化2h后，趋化朗格汉斯细胞迁移到下室 的细胞数约为0. 3X 104，对照组则为2X104，表明核酸分子MIP3aANA6具有显著下调趋化 朗格汉斯细胞迁移的效应。与本申请有关的序列表
<110>中国人民解放军第三军医大学第一附属医院
<120> Title 核酸分子MIP3a ANA6及其在制备免疫抑制药物中的应用
<160> 2
6<210> 1
<211> Length:19
SequenceName :ΜΙΡ3 α ΑΝΑ6 <212> Type :DNA <213> OrganismName !Artificial <400> MIP3αANA6
5’ -ATATATTGTGCGTCTCCTC-3’19
<210> 2
<211> Length:19
SequenceName :MIP3 α ANA6 <212> Type :DNA <213> OrganismName !Artificial <400> MIP3αANA6
5’ -GAGGAGACGCACAATATAT-3'19
权利要求
具有特异性抑制人MIP3α的表达的核酸，为双链核酸分子，其DNA序列如下 正义链S15’ ATATATTGTGCGTCTCCTC 3’；反义链S25’ GAGGAGACGCACAATATAT 3’。
2.—种核酸分子，其特征在于，它的序列中含有Sl和/或S2。
3.—种重组载体pSUPER，其特征在于，它的序列中含有Sl和/或S2。
4.一种重组载体pHSER，其特征在于，它的序列中含有Sl和/或S2。
5.一种细胞HaCaT，它的序列中含有Sl和/或S2。
6.权利要求1或2任一种核酸分子的制备方法，其特征在于，按权利要求1或2任一核 酸分子的序列，将各核糖核酸基团或者脱氧核糖核酸基团依次脱水缩合。
7 权利要求1或2所述的核酸分子在制备抑制人MIP3α的表达的药物中的应用。
8.权利要求1或2所述的核酸分子在制备免疫抑制药物中的应用。
9.权利要求3或4所述的重组载体在制备免疫抑制药物中的应用。
10.权利要求5所述的细胞在用于制备具有免疫抑制的生物材料中的应用，所述生物 材料为人在皮肤。
全文摘要
本发明属于反义核酸药物领域，涉及MIP3αANA6及其在制备免疫抑制药物中的应用。机体的免疫应答在自身免疫性疾病、组织器官移植排斥反应中发挥着关键作用。本发明提供了一种用于制备免疫抑制药物的反义核酸分子MIP3αANA6，为双链核酸分子，其DNA序列的正义链为5′-ATATATTGTGCGTCTCCTC-3′，反义链为5′-GAGGAGACGCACAATATAT-3′。在加有炎性细胞因子的培养条件下，MIP3αANA6可以显著减少多种细胞表达MIP3αmRNA和产生MIP3α蛋白质，它通过阻止抗原提呈细胞和T细胞的迁移发挥免疫抑制作用。本发明为治疗MIP3α相关性免疫疾病提供了一种新的反义核酸药物。
文档编号C07H21/02GK101979561SQ201010525039
公开日2011年2月23日 申请日期2010年10月29日 优先权日2010年10月29日
发明者彭代智, 王丽华, 董征学 申请人:中国人民解放军第三军医大学第一附属医院