用于控制基因表达的单链核酸分子的制作方法
【专利说明】
[0001] 本申请是中国专利申请201180027223. 1的分案申请，原申请的申请日为2011年 07月08日，发明名称为用于控制基因表达的单链核酸分子。
技术领域
[0002] 本发明涉及抑制基因表达的单链核酸分子、包含该单链核酸分子的组合物及其用 途。
【背景技术】
[0003] 作为抑制基因表达的技术，例如，已知RNA干扰（RNAi)(非专利文献1)。基于RNA 干扰的基因的表达抑制通常通过例如在细胞等中投与短的双链RNA分子来实施。上述双链 RNA分子通常被称为siRNA(小干扰RNA)。除此之外，还报道了一种环状的RNA分子，该RNA 分子通过分子内退火而部分地形成了双链，利用该RNA分子也能够抑制基因表达（专利文 献1)。但是，这些方法中，诱导基因的表达抑制的RNA分子存在以下问题。
[0004] 首先，在制造上述SiRNA的情况下，需要以下工序：在分别合成正义链和反义链之 后，最后将这些链杂交。因此，存在制造效率差的问题。另外，在细胞中投与上述siRNA时， 需要以抑制了其解离为单链RNA的状态投与至细胞中，因而，其操作条件的设定也需要劳 力。接着，在为环状的RNA分子的情况下，存在难以合成的问题。
[0005] 现有技术文献
[0006] 专利文献
[0007] 专利文献1 :日本特开2008-278784 [0008] 非专利文献
[0009]非专利文献 1:Fire等、Nature第 391 卷，p. 806-811，1998 年
【发明内容】
[0010] 因此，本发明的目的在于提供一种能够抑制基因表达的新的、能够容易且高效地 制造的核酸分子。
[0011] 为了达到上述目的，本发明的单链核酸分子的特征在于，其为包含抑制靶基因表 达的表达抑制序列的单链核酸分子，
[0012] 从5'侧至3'侧依次包含5'侦怄域（Xc)、内部区域⑵以及3'侦怄域（Yc)，
[0013] 上述内部区域（Z)由内部5'侧区域（X)和内部3'侧区域（Y)连结而构成，
[0014] 上述5'侧区域（Xc)与上述内部5'侧区域⑴互补，
[0015] 上述3'侧区域（Yc)与上述内部3'侧区域⑴互补，
[0016]上述内部区域（Z)、上述5'侧区域（Xc)以及上述3'侧区域（Yc)中的至少一者包 含上述表达抑制序列。
[0017] 本发明的组合物的特征在于，其为用于抑制靶基因表达的组合物，其包含上述本 发明的单链核酸分子。
[0018] 本发明的组合物的特征在于，其为药学组合物，其包含上述本发明的单链核酸分 子。
[0019] 本发明的表达抑制方法的特征在于，其为抑制靶基因表达的方法，其使用上述本 发明的单链核酸分子。
[0020] 本发明的疾病的治疗方法的特征在于，其包括将上述本发明的单链核酸分子投与 至患者的工序，上述单链核酸分子具有抑制成为上述疾病的原因的基因的表达的序列作为 上述表达抑制序列。
[0021] 根据本发明的单链核酸分子，能够进行基因的表达抑制，并且由于不是环状，因而 其合成容易，另外，由于是单链，因此不存在双链的退火工序，能够高效地制造。
[0022] 需要说明的是，本发明人首次发现了本发明的单链核酸分子的结构能够抑制基因 表达。本发明的单链核酸分子的基因的表达抑制效果被推测是与基于RNA干扰同样的现 象，但本发明中的基因表达抑制不限制和限定于RNA干扰。
【附图说明】
[0023] 图1是示出本发明的单链核酸分子的一例的示意图。
[0024] 图2是示出本发明的单链核酸分子的其他例子的示意图。
[0025] 图3是示出本发明的单链核酸分子的其他例子的示意图。
[0026] 图4是示出本发明的实施例中的GAPDH基因表达量的相对值的图表。
[0027] 图5是示出本发明的实施例中的GAPDH基因表达量的相对值的图表。
[0028] 图6是示出本发明的实施例中的A549细胞的GAPDH基因表达量的相对值的图表。
[0029] 图7是示出本发明的实施例中的293细胞的GAPDH基因表达量的相对值的图表。
[0030] 图8是示出本发明的实施例中的TGF-M基因表达量的相对值的图表。
[0031] 图9是示出本发明的实施例中的各投与组中单位重量的肺的TGF-M基因表达量 的图表。
[0032] 图10是示出本发明的实施例中的各投与组中的BAFL样品中的细胞数的图表。
[0033] 图11是示出本发明的实施例中的各投与组中的BALF样品中的中性粒细胞的细胞 数的图表。
[0034] 图12是示出本发明的实施例中的BALF样品中的细胞的吉姆萨染色结果的照片， 图12的（A)示出LPS(+)/RNA㈠的投与组4的结果，图12的⑶示出LPS(+)/阴性对照 NK-0035(+)的投与组6的结果，图12的（C)示出LPS(+)/NK-0033(+)的实施例投与组5的 结果。
[0035] 图13是示出本发明的实施例中的肺组织的HE染色结果的照片，图13的（A)示出 LPS(+)/RNA(_)的投与组4的结果，图13的（B)示出LPS(+)/阴性对照NK-0035(+)的投与 组6的结果，图13的（C)示出LPS(+)/NK-0033(+)的实施例投与组5的结果。
[0036] 图14的（A)示出本发明的实施例中的TGF-M基因的表达量的结果，图14的（B) 示出本发明的实施例中的IFN-a基因的表达量的结果，图14的（C)示出本发明的实施例 中的IFN-0基因的表达量的结果。
[0037] 图15是示出本发明的实施例中的TGF-M基因表达量的相对值的图表。
[0038] 图16是示出本发明的实施例中的TGF-M基因表达量的相对值的图表。
[0039] 图17是示出本发明的实施例中的各投与组中单位重量的肺的TGF-M表达量的 图表。
[0040] 图18的（A)是示出本发明的实施例中的各投与组的BALF样品中的TNF-a量的图 表，图18的（B)是示出本发明的实施例中的各投与组的BALF样品中的IFN-0量的图表。
[0041] 图19是示出本发明的实施例中的293细胞的LAMA基因的表达量的相对值的图 表。
[0042] 图20是示出本发明的实施例中的A549细胞的LMNA基因的表达量的相对值的图 表。
[0043] 图21是示出本发明的实施例中使用的ssRNA的图。
[0044] 图22是示出本发明的实施例中的GAPDH基因表达量的相对值的图表。
[0045] 图23是示出本发明的实施例中使用的ssRNA的图。
[0046] 图24是示出本发明的实施例中的GAPDH基因表达量的相对值的图表。
[0047] 图25是示出本发明的实施例中使用的ssRNA的图。
[0048] 图26是示出本发明的实施例中的GAPDH基因表达量的相对值的图表。
[0049] 图27是示出本发明的实施例中使用的ssRNA的图。
[0050] 图28是示出本发明的实施例中的GAPDH基因表达量的相对值的图表。
[0051] 图29是示出本发明的实施例中的GAPDH基因表达量的相对值的图表。
[0052] 图30是示出本发明的实施例中的HCT116细胞的GAPDH基因表达量的相对值的图 表。
[0053] 图31是示出本发明的实施例中的核糖核酸酶耐受性的电泳照片。
[0054] 图32是示出本发明的实施例中的S7核酸酶耐受性的电泳照片。
【具体实施方式】
[0055] 只要没有特别提及，则本说明书中使用的用语能够以该技术领域中通常所用的含 义使用。
[0056] LssNc分子
[0057] 如上所述，本发明的单链核酸分子的特征在于，其为包含抑制靶基因表达的表达 抑制序列的单链核酸分子，
[0058] 从5'侧至3'侧依次包含5'侧区域（Xc)、内部区域⑵以及3'侧区域（Yc)，
[0059] 上述内部区域（Z)由内部5'侧区域（X)和内部3'侧区域（Y)连结而构成，
[0060] 上述5'侧区域（Xc)与上述内部5'侧区域⑴互补，
[0061] 上述3'侧区域（Yc)与上述内部3'侧区域⑴互补，
[0062]上述内部区域（Z)、上述5'侧区域（Xc)以及上述3'侧区域（Yc)的至少一者包含 上述表达抑制序列。
[0063] 本发明中，"靶基因的表达抑制"例如是指阻碍上述靶基因的表达。上述抑制的机 理没有特别限制，例如，可以为下降调节或沉默。上述靶基因的表达抑制能够通过例如由上 述靶基因的转录产物的生成量的减少、上述转录产物的活性的减少、由上述靶基因的翻译 产物的生成量的减少或者上述翻译产物的活性的减少等来确认。上述蛋白质可以举出例如 成熟蛋白或者接受加工或翻译后修饰之前的前体蛋白。
[0064] 以下，将本发明的单链核酸分子也称为本发明的"ssNc分子"。本发明的ssNc分子 例如在体内（invivo)或体外（invitro)中能够用于革E1基因的表达抑制，因而也称为"革巴 基因的表达抑制用ssNc分子"或"靶基因的表达抑制剂"。另外，本发明的ssNc分子例如 通过RNA干扰而能够抑制上述靶基因的表达，因而也称为"RNA干扰用ssNc分子"、"RNA干 扰诱导分子"、"RNA干扰剂"或"RNA干扰诱导剂"。另外，本发明的ssNc分子能够抑制例如 干扰素诱导等副作用。
[0065] 本发明的ssNc分子的5'末端和3'末端未连结，还能够称为线状单链核酸分子。 本发明的ssNc分子例如在上述内部区域（Z)中，上述内部5'区域（X)和上述内部3'区域 (Y)直接连结。
[0066] 本发明的ssNc分子中，上述5'侧区域（Xc)与上述内部5'侧区域⑴互补，上述 3'侧区域（Yc)与上述内部3'侧区域⑴互补。因此，对于5'侧而言，上述区域（Xc)向上 述区域（X)折回，上述区域（Xc)与上述区域（X)能够通过自退火形成双链，另外，在3'侧， 上述区域（Yc)向上述区域（Y)折回，上述区域（Yc)与上述区域（Y)能够通过自退火形成 双链。本发明的ssNc分子能够这样地在分子内形成双链，例如，与以往的RNA干扰中使用 的siRNA那样的、由分离的两条单链RNA通过退火形成的双链RNA是明显不同的结构。
[0067] 在本发明的ssNc分子中，例如，本发明的ssNc分子以体内或体外的方式导入到 细胞内的情况下，上述表达抑制序列为显示抑制上述靶基因的表达的活性的序列。上述 表达抑制序列没有特别限制，能够根据目标靶基因的种类适宜设定。上述表达抑制序列例 如能够适宜适用基于siRNA的RNA干扰的相关序列。RNA干扰通常为下述现象：长的双链 RNA(dsRNA)在细胞内被切酶切断成3'末端突出的19~21碱基对左右的双链RNA(siRNA: 小干扰RNA)，其中一个单链RNA与靶mRNA结合，分解上述mRNA，由此抑制上述mRNA的翻译。 与上述靶mRNA结合的上述siRNA中的单链RNA的序列例如根据靶基因的种类被报道了各 种种类。本发明可以使用例如上述siRNA的单链RNA的序列作为上述表达抑制序列。
[0068] 需要说明的是，本发明的关键点不在于对于上述靶基因的上述表达抑制序列的序 列信息，而是涉及用于在例如细胞内使上述表达抑制序列所产生的上述靶基因的表达抑制 活性发挥功能的核酸分子的结构。因此，本发明中，例如，除了申请时公知的上述siRNA的 单链RNA序列之外，还能够利用将来所获知的序列作为上述表达抑制序列。
[0069] 上述表达抑制序列例如相对于上述靶基因的规定区域优选具有90%以上的互补 性、更优选为95%、进一步优选为98%、特别优选为100%。通过满足这样的互补性，例如， 能够充分减轻脱靶。
[0070] 作为具体例，在靶基因为GAPDH基因的情况下，上述表达抑制序列能够使用例如 序列号1所示的19碱基长的序列；在靶基因为TGF-M的情况下，上述表达抑制序列能够 使用例如序列号16所不的21喊基长的序列；在革E1基因为LAMA1基因的情况下，上述表达抑 制序列能够使用例如序列号5所不的19喊基长的序列；在革E1基因为LMNA基因的情况下，能 够使用例如序列号6所不的19喊基长的序列。
[0071] 5' -GUUGUCAUACUUCUCAUGG-3'（序列号 1)
[0072] 5' -AAAGUCAAUG