专利名称：用于控制基因表达的单链核酸分子的制作方法
技术领域：
本发明涉及抑制基因表达的单链核酸分子、包含该单链核酸分子的组合物及其用途。
背景技术：
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作为抑制基因表达的技术，例如，已知RNA干扰(RNAi)(非专利文献I)。基于RNA干扰的基因的表达抑制通常通过例如在细胞等中投与短的双链RNA分子来实施。上述双链RNA分子通常被称为siRNA (小干扰RNA)。除此之外，还报道了一种环状的RNA分子，该RNA分子通过分子内退火而部分地形成了双链，利用该RNA分子也能够抑制基因表达(专利文献I)。但是，这些方法中，诱导基因的表达抑制的RNA分子存在以下问题。首先，在制造上述SiRNA的情况下，需要以下工序在分别合成正义链和反义链之后，最后将这些链杂交。因此，存在制造效率差的问题。另外，在细胞中投与上述siRNA时，需要以抑制了其解离为单链RNA的状态投与至细胞中，因而，其操作条件的设定也需要劳力。接着，在为环状的RNA分子的情况下，存在难以合成的问题。现有技术文献专利文献专利文献I :日本特开2008-278784非专利文献非专利文献I Fire 等、Nature 第 391 卷，p. 806-811,1998 年
发明内容
因此，本发明的目的在于提供一种能够抑制基因表达的新的、能够容易且高效地制造的核酸分子。为了达到上述目的，本发明的单链核酸分子的特征在于，其为包含抑制靶基因表达的表达抑制序列的单链核酸分子，从5’侧至3’侧依次包含5’侧区域(Xe)、内部区域(Z)以及3’侧区域(Yc)，上述内部区域(Z)由内部5’侧区域⑴和内部3’侧区域⑴连结而构成，上述5’侧区域(Xe)与上述内部5’侧区域⑴互补，上述3’侧区域(Yc)与上述内部3’侧区域⑴互补，上述内部区域(Z)、上述5’侧区域(Xe)以及上述3’侧区域(Yc)中的至少一者包含上述表达抑制序列。本发明的组合物的特征在于，其为用于抑制靶基因表达的组合物，其包含上述本发明的单链核酸分子。本发明的组合物的特征在于，其为药学组合物，其包含上述本发明的单链核酸分子。本发明的表达抑制方法的特征在于，其为抑制靶基因表达的方法，其使用上述本发明的单链核酸分子。本发明的疾病的治疗方法的特征在于，其包括将上述本发明的单链核酸分子投与至患者的工序，上述单链核酸分子具有抑制成为上述疾病的原因的基因的表达的序列作为上述表达抑制序列。 根据本发明的单链核酸分子，能够进行基因的表达抑制，并且由于不是环状，因而其合成容易，另外，由于是单链，因此不存在双链的退火工序，能够高效地制造。需要说明的是，本发明人首次发现了本发明的单链核酸分子的结构能够抑制基因表达。本发明的单链核酸分子的基因的表达抑制效果被推测是与基于RNA干扰同样的现象，但本发明中的基因表达抑制不限制和限定于RNA干扰。
图I是示出本发明的单链核酸分子的一例的示意图。图2是示出本发明的单链核酸分子的其他例子的示意图。图3是示出本发明的单链核酸分子的其他例子的示意图。图4是示出本发明的实施例中的GAPDH基因表达量的相对值的图表。图5是示出本发明的实施例中的GAPDH基因表达量的相对值的图表。图6是示出本发明的实施例中的A549细胞的GAPDH基因表达量的相对值的图表。图7是示出本发明的实施例中的293细胞的GAPDH基因表达量的相对值的图表。图8是示出本发明的实施例中的TGF-β I基因表达量的相对值的图表。图9是示出本发明的实施例中的各投与组中单位重量的肺的TGF-β I基因表达量的图表。图10是示出本发明的实施例中的各投与组中的BAFL样品中的细胞数的图表。图11是示出本发明的实施例中的各投与组中的BALF样品中的中性粒细胞的细胞数的图表。图12是示出本发明的实施例中的BALF样品中的细胞的吉姆萨染色结果的照片，图12的(A)示出LPS(+)/RNA(_)的投与组4的结果，图12的⑶示出LPS(+)/阴性对照NK-0035 (+)的投与组6的结果，图12的(C)示出LPS (+) /NK-0033 (+)的实施例投与组5的结果。图13是示出本发明的实施例中的肺组织的HE染色结果的照片，图13的㈧示出LPS (+) /RNA (-)的投与组4的结果，图13的⑶示出LPS (+) /阴性对照NK-0035 (+)的投与组6的结果，图13的(C)示出LPS (+)/NK-0033 (+)的实施例投与组5的结果。图14的⑷示出本发明的实施例中的TGF-β I基因的表达量的结果，图14的(B)示出本发明的实施例中的IFN-α基因的表达量的结果，图14的(C)示出本发明的实施例中的IFN-β基因的表达量的结果。图15是示出本发明的实施例中的TGF-β I基因表达量的相对值的图表。图16是示出本发明的实施例中的TGF-β I基因表达量的相对值的图表。图17是示出本发明的实施例中的各投与组中单位重量的肺的TGF-β I表达量的图表。图18的(A)是示出本发明的实施例中的各投与组的BALF样品中的TNF-α量的图表，图18的(B)是示出本发明的实施例中的各投与组的BALF样品中的IFN-β量的图表。图19是示出本发明的实施例中的293细胞的LAMA基因的表达量的相对值的图表。图20是示出本发明的实施例中的A549细胞的LMNA基因的表达量的相对值的图表。图21是示出本发明的实施例中使用的ssRNA的图。图22是示出本发明的实施例中的GAPDH基因表达量的相对值的图表。图23是示出本发明的实施例中使用的ssRNA的图。图24是示出本发明的实施例中的GAPDH基因表达量的相对值的图表。图25是示出本发明的实施例中使用的ssRNA的图。图26是示出本发明的实施例中的GAPDH基因表达量的相对值的图表。图27是示出本发明的实施例中使用的ssRNA的图。图28是示出本发明的实施例中的GAPDH基因表达量的相对值的图表。图29是示出本发明的实施例中的GAPDH基因表达量的相对值的图表。图30是示出本发明的实施例中的HCT116细胞的GAPDH基因表达量的相对值的图表。图31是示出本发明的实施例中的核糖核酸酶耐受性的电泳照片。·图32是示出本发明的实施例中的S7核酸酶耐受性的电泳照片。
具体实施例方式只要没有特别提及，则本说明书中使用的用语能够以该技术领域中通常所用的含义使用。I. ssNc 分子如上所述，本发明的单链核酸分子的特征在于，其为包含抑制靶基因表达的表达抑制序列的单链核酸分子，从5’侧至3’侧依次包含5’侦彳区域(Xe)、内部区域(Z)以及3’侦彳区域(Yc)，上述内部区域(Z)由内部5’侦彳区域⑴和内部3’侧区域⑴连结而构成，上述5’侧区域(Xe)与上述内部5’侧区域⑴互补，上述3’侧区域(Yc)与上述内部3’侧区域⑴互补，上述内部区域(Z)、上述5’侧区域(Xe)以及上述3’侧区域(Yc)的至少一者包含上述表达抑制序列。本发明中，“靶基因的表达抑制”例如是指阻碍上述靶基因的表达。上述抑制的机理没有特别限制，例如，可以为下降调节或沉默。上述靶基因的表达抑制能够通过例如由上述靶基因的转录产物的生成量的减少、上述转录产物的活性的减少、由上述靶基因的翻译产物的生成量的减少或者上述翻译产物的活性的减少等来确认。上述蛋白质可以举出例如成熟蛋白或者接受加工或翻译后修饰之前的前体蛋白。以下，将本发明的单链核酸分子也称为本发明的“ssNc分子”。本发明的ssNc分子例如在体内(in vivo)或体外(in vitro)中能够用于祀基因的表达抑制，因而也称为“革巴基因的表达抑制用ssNc分子”或“靶基因的表达抑制剂”。另外，本发明的ssNc分子例如通过RNA干扰而能够抑制上述靶基因的表达，因而也称为“RNA干扰用ssNc分子”、“RNA干扰诱导分子”、“RNA干扰剂”或“RNA干扰诱导剂”。另外，本发明的ssNc分子能够抑制例如干扰素诱导等副作用。本发明的ssNc分子的5’末端和3’末端未连结，还能够称为线状单链核酸分子。本发明的ssNc分子例如在上述内部区域(Z)中，上述内部5’区域(X)和上述内部3’区域(Y)直接连结。本发明的ssNc分子中，上述5’侧区域(Xe)与上述内部5’侧区域⑴互补，上述3’侧区域(Yc)与上述内部3’侧区域⑴互补。因此，对于5’侧而言，上述区域(Xe)向上述区域(X)折回，上述区域(Xe)与上述区域(X)能够通过自退火形成双链，另外，在3’侧，上述区域(Yc)向上述区域⑴折回，上述区域(Yc)与上述区域⑴能够通过自退火形成双链。本发明的ssNc分子能够这样地在分子内形成双链，例如，与以往的RNA干扰中使用的siRNA那样的、由分离的两条单链RNA通过退火形成的双链RNA是明显不同的结构。
在本发明的ssNc分子中，例如，本发明的ssNc分子以体内或体外的方式导入到细胞内的情况下，上述表达抑制序列为显示抑制上述靶基因的表达的活性的序列。上述表达抑制序列没有特别限制，能够根据目标靶基因的种类适宜设定。上述表达抑制序列例如能够适宜适用基于siRNA的RNA干扰的相关序列。RNA干扰通常为下述现象长的双链RNA(dsRNA)在细胞内被切酶切断成3’末端突出的I扩21碱基对左右的双链RNA(siRNA :小干扰RNA)，其中一个单链RNA与靶mRNA结合，分解上述mRNA，由此抑制上述mRNA的翻译。与上述靶mRNA结合的上述siRNA中的单链RNA的序列例如根据靶基因的种类被报道了各种种类。本发明可以使用例如上述siRNA的单链RNA的序列作为上述表达抑制序列。需要说明的是，本发明的关键点不在于对于上述靶基因的上述表达抑制序列的序列信息，而是涉及用于在例如细胞内使上述表达抑制序列所产生的上述靶基因的表达抑制活性发挥功能的核酸分子的结构。因此，本发明中，例如，除了申请时公知的上述siRNA的单链RNA序列之外，还能够利用将来所获知的序列作为上述表达抑制序列。上述表达抑制序列例如相对于上述靶基因的规定区域优选具有90%以上的互补性、更优选为95%、进一步优选为98%、特别优选为100%。通过满足这样的互补性，例如，能够充分减轻脱靶。作为具体例，在靶基因为GAPDH基因的情况下，上述表达抑制序列能够使用例如序列号I所示的19碱基长的序列；在靶基因为TGF-β I的情况下，上述表达抑制序列能够使用例如序列号16所不的21喊基长的序列；在祀基因为LAMAl基因的情况下,上述表达抑制序列能够使用例如序列号5所不的19喊基长的序列；在祀基因为LMNA基因的情况下,能够使用例如序列号6所示的19碱基长的序列。5，-GUUGUCAUACUUCUCAUGG-3’(序列号 I)5’-AAAGUCAAUGUACAGCUGCUU-3，(序列号 16)5’-AUUGUAACGAGACAAACAC-3’(序列号 5)5’-UUGCGCUUUUUGGUGACGC-3’(序列号 6)本发明的ssNc分子所产生的上述靶基因的表达抑制被推测是由于以下原因通过为例如上述内部区域(Z)、上述5’侧区域(Xe)以及上述3’侧区域(Yc)中的至少一者配置有上述表达抑制序列的结构，从而产生RNA干扰或与RNA干扰类似的现象(RNA干扰样的现象)。需要说明的是，本发明并不限定于该机理。本发明的ssNc分子并不是如例如所谓的siRNA那样以由两条单链RNA构成的dsRNA的形式导入细胞等中，并且，在细胞内未必需要上述表达抑制序列的切出。因此，本发明的ssNc分子也可以说例如还具有RNA干扰样的功能。本发明的ssNc分子中，如上所述，上述表达抑制序列包含在上述内部区域(Z)、上述5’侧区域(Xe)以及上述3’侧区域(Yc)的至少一者中。本发明的ssNc分子例如可以具有I个上述表达抑制序列，也可以具有2个以上的上述表达抑制序列。为后者的情况下，本发明的ssNc分子例如可以具有2个以上的对于相同靶基因的相同表达抑制序列，也可以具有2个以上的对于相同靶基因的不同表达抑制序列，还可以具有2个以上的对于不同靶基因的不同表达抑制序列。本发明的ssNc分子具有2个以上的上述表达抑制序列的情况下，各表达抑制序列的配置部位没有特别限制，可以为上述内部区域(Z)、上述5’侦彳区域(Xe)以及上述3’侧区域(Yc)中的任意一个区域，也可以为不同区域。本发明的ssNc分子具有2个以上的对于不同靶基因的上述表达抑制序列的情况·下，例如，通过本发明的ssNc分子，能够抑制2种以上的不同靶基因的表达。如上所述，上述内部区域(Z)由上述内部5’区域⑴和上述内部3’区域⑴连结而成。上述区域(X)和上述区域(Y)例如可以直接连结，期间不具有间插序列。为了表示上述内部区域(Z)与上述5’侧区域(Xe)和上述3’侧区域(Xe)的序列关系，上述内部区域⑵定义为“上述内部5’侧区域⑴和上述内部3’侧区域⑴连结而构成”，上述内部区域(Z)中，上述5’侧区域(Xe)和上述3’侧区域(Xe)在例如上述ssNc分子的使用中不限于各自独立的区域。即，例如，上述内部区域(Z)具有上述表达抑制序列的情况下，上述内部区域(Z)中，可以跨越上述区域(X)和上述区域(Y)而配置上述表达抑制序列。本发明的ssNc分子中，上述5’侧区域(Xe)与上述内部5’侧区域⑴互补。此处，上述区域(Xe)只要具有与上述区域(X)的全部区域或其部分区域互补的序列即可，具体而言，例如，优选的是，包含与上述区域(X)的全部区域或其部分区域互补的序列，或者由上述互补的序列构成。上述区域(Xe)与上述区域(X)的互补的上述全部区域或互补的上述部分区域例如可以完全互补，也可以I碱基或数碱基非互补，但优选完全互补。本发明的ssNc分子中，上述3’侧区域(Yc)与上述内部3’侧区域(Y)互补。此处，上述区域(Yc)只要具有与上述区域(Y)的全部区域或其部分区域互补的序列即可，具体而言，例如，优选的是，包含与上述区域(Y)的全部区域或其部分区域互补的序列，或者由上述互补的序列构成。上述区域(Yc)与上述区域(Y)的互补的上述全部区域或互补的上述部分区域例如可以完全互补，也可以I碱基或数碱基非互补，但优选完全互补。上述I碱基或数碱基例如为1 3碱基、优选为I碱基或2碱基。本发明的ssNc分子中，上述5’侧区域(Xe)与上述内部5’侧区域⑴例如可以直接连结，也可以间接连结。为前者的情况下，直接连结可以举出例如基于磷酸二酯键的连结。为后者的情况下，例如可以举出以下形态在上述区域(Xe)与上述区域(X)之间具有连接子区域(Lx)，介由上述连接子区域(Lx)连结了上述区域(Xe)和上述区域(X)。本发明的ssNc分子中，上述3’侧区域(Yc)与上述内部3’侧区域⑴例如可以直接连结，也可以间接连结。为前者的情况下，直接连结可以举出例如基于磷酸二酯键的连结。为后者的情况下，例如可以举出以下形态在上述区域(Yc)与上述区域(Y)之间具有连接子区域(Ly)，介由上述连接子区域(Ly)连结了上述区域(Yc)与上述区域(Y)。本发明的ssNc分子例如可以具有上述连接子区域(Lx)和上述连接子区域(Ly)两者，也可以具有任意一者。为后者的情况下，例如，在上述5’侧区域(Xe)与上述内部5’侧区域(X)之间具有上述连接子区域(Lx)，在上述3’侧区域(Yc)与上述内部3’侧区域(Y)之间不具有上述连接子区域(Ly)，S卩，可以举出上述区域(Yc)与上述区域(Y)直接连结的形态。另外，为后者的情况下，例如，在上述3’侧区域(Yc)与上述内部3’侧区域(Y)之间具有上述连接子区域(Ly)，在上述5’侧区域(Xe)与上述内部5’侧区域(X)之间不具有上述连接子区域(Lx)，S卩，可以举出上述区域(Xe)和上述区域(X)直接连结的形态。上述连接子区域(Lx)和上述连接子区域(Ly)优选为各自在其自身的区域内部中不产生自退火的结构。关于本发明的ssNc分子，将不具有上述连接子区域的ssNc分子的一例示于图I的示意图。图I的(A)是示出上述ssNc分子的从5’侧至3’侧的各区域的顺序的概要的 示意图，图I的(B)是示出上述ssNc分子在上述分子内形成了双链的状态的示意图。如图I的(B)所示，对于上述ssNc分子，上述5’侧区域(Xe)折回，在上述5’侧区域(Xe)与上述内部5’侧区域⑴之间形成了双链，上述3’侧区域(Yc)折回，在上述3’侧区域(Yc)与上述内部3’侧区域(Y)之间形成了双链。图I仅为示出各区域的连结顺序和形成双链的各区域的位置关系的图，例如，各区域的长度等不限于此。关于本发明的ssNc分子，将具有上述连接子区域的ssNc分子的一例示于图2的示意图。图2的(A)是作为一例示出上述ssNc分子的从5’侧至3’侧的各区域的顺序的概要的示意图，图2的(B)是示出上述ssNc分子在上述分子内形成了双链的状态的示意图。如图2的⑶所示，关于上述ssNc分子，上述5’侧区域(Xe)和上述内部5’侧区域⑴之间形成双链，上述内部3’侧区域(Y)和上述3’侧区域(Yc)之间形成双链，上述Lx区域和上述Ly区域呈环结构。图2仅为示出各区域的连结顺序和形成双链的各区域的位置关系的图，例如，各区域的长度等不限于此。本发明的ssNc分子中，上述5’侧区域(Xe)、上述内部5’侧区域(X)、上述内部3’侦怄域(Y)以及上述3’侦彳区域(Yc)的碱基数没有特别限制，例如，如下所示。本发明中，“碱基数”例如指“长度”，也可以称为“碱基长”。如上所述，上述5’侧区域(Xe)例如可以与上述内部5’侧区域⑴的全部区域互补。该情况下，优选上述区域(Xe)例如与上述区域(X)为相同碱基长，由与上述区域(X)的从5’末端至3’末端的全部区域互补的碱基序列构成。上述区域(Xe)更优选与上述区域(X)为相同碱基长且上述区域(Xe)的全部碱基与上述区域(X)的全部碱基互补，即，优选例如完全互补。需要说明的是，并不限于此，例如，如上所述，可以I碱基或数碱基非互补。另外，如上所述，上述5’侧区域(Xe)例如可以与上述内部5’侧区域⑴的部分区域互补。该情况下，优选上述区域(Xe)例如与上述区域(X)的部分区域为相同碱基长，即，由比上述区域(X)短I碱基以上的碱基长的碱基序列构成。上述区域(Xe)更优选与上述区域(X)的上述部分区域为相同碱基长且上述区域(Xe)的全部碱基与上述区域(X)的上述部分区域的全部碱基互补，即，优选例如完全互补。上述区域(X)的上述部分区域例如优选为由上述区域(X)中的从5’末端的碱基(第I位的碱基)起连续的碱基序列构成的区域(片段)。
如上所述，上述3’侧区域(Yc)例如可以与上述内部3’侧区域⑴的全部区域互补。该情况下，优选上述区域(Yc)例如与上述区域(Y)为相同碱基长，由与上述区域(Y)的从5’末端至3’末端的全部区域互补的碱基序列构成。上述区域(Yc)更优选与上述区域(Y)为相同碱基长且上述区域(Yc)的全部碱基与上述区域(Y)的全部碱基互补，即，优选例如完全互补。需要说明的是，并不限于此，例如，如上所述，可以I碱基或数碱基非互补。另外，如上所述，上述3’侧区域(Yc)例如可以与上述内部3’侧区域⑴的部分区域互补。该情况下，优选上述区域(Yc)例如与上述区域(Y)的部分区域为相同碱基长，即，由比上述区域(Y)短I碱基以上的碱基长的碱基序列构成。上述区域(Yc)更优选与上述区域(Y)的上述部分区域为相同碱基长且上述区域(Yc)的全部碱基与上述区域(Y)的上述部分区域的全部碱基互补，即，优选例如完全互补。上述区域(Y)的上述部分区域例如优选为由上述区域(Y)中的从3’末端的碱基(第I位的碱基)起连续的碱基序列构成区域(片段)。 本发明的SSNc分子中，上述内部区域(Z)的碱基数(Z)与上述内部5’侧区域(X)的碱基数⑴以及上述内部3’侧区域⑴的碱基数⑴的关系、上述内部区域(Z)的碱基数⑵与上述内部5’侧区域⑴的碱基数⑴以及上述5’侧区域(Xe)的碱基数(Xe)的关系例如满足下述式(I)和(2)的条件。Z=X+Y…(I)Z 彡 Xc+Yc··· (2)本发明的ssNc分子中，上述内部5’侧区域⑴的碱基数⑴与上述内部3’侧区域(Y)的碱基数(Y)的长度的关系没有特别限制，例如，满足下述式中的任一条件。X=Y…(19)X < Y... (20)X > Y... (21)本发明的ssNc分子中，上述内部5’侧区域⑴的碱基数(X)、上述5’侧区域(Xe)的碱基数(Xe)、上述内部3’侧区域(Y)的碱基数(Y)以及上述3’侧区域(Yc)的碱基数(Yc)的关系例如满足下述(ar(d)中的任一条件。(a)满足下述式(3)和⑷的条件。X > Xe …(3)Y=Yc... (4)(b)满足下述式(5)和(6)的条件。X=Xc- (5)Y > Yc... (6)(c)满足下述式(7)和⑶的条件。X > Xe …(7)Y > Yc …(8)(d)满足下述式(9)和(10)的条件。X=Xc... (9)Y=Yc... (10)上述(ar(d)中，上述内部5’侧区域⑴的碱基数⑴与上述5’侧区域(Xe)的碱基数(Xe)之差，上述内部3’侦彳区域(Y)的碱基数(Y)与上述3’侦彳区域(Yc)的碱基数(Yc)之差例如优选满足下述条件。(a)满足下述式(11)和(12)的条件。X-Xc=I 10，优选为 1、2、3 或 4，更优选为1、2 或 3··· (11)Y-Yc=O... (12)(b)满足下述式(13)和(14)的条件。
X-Xc=O... (13)Y-Yc=I 10，优选为 1、2、3 或 4，更优选为1、2 或 3··· (14)(c)满足下述式(15)和(16)的条件。X-Xc=I 10，优选为 1、2 或 3，更优选为I或2··· (15)Y-Yc=I 10，优选为 1、2 或 3，更优选为I或2··· (16)(d)满足下述式(17)和(18)的条件。X-Xc=O... (17)Y-Yc=O... (18)关于上述(ar(d)的ssNc分子，将各结构的一例示于图3的示意图。图3是包含上述连接子区域(Lx)和上述连接子区域(Ly)的ssNc，(A)是上述(a)的ssNc分子，(B)是上述(b)的ssNc分子，(C)是上述(C)的ssNc分子，⑶是上述(d)的ssNc分子的例子。图3中，虚线表示通过自退火而形成了双链的状态。图3的ssNc分子将上述内部5’侧区域(X)的碱基数⑴和上述内部3’侧区域⑴的碱基数⑴表示为上述式(20)的“X<Y”，并不限于此，如上所述，可以为上述式(19)的“Χ=Υ”，也可以为上述式(21)的“Χ>Υ”。另夕卜，图3仅为示出上述内部5’侧区域⑴与上述5’侧区域(Xe)的关系、上述内部3’侧区域(Y)与上述3’侧区域(Yc)的关系的示意图，例如，各区域的长度，形状等并不限于此，另夕卜，有无连接子区域(Lx)以及连接子区域(Ly)也不限于此。上述(a) (c)的ssNc分子例如为如下结构通过上述5’侧区域(Xe)和上述内部5’侧区域(X)、以及上述3’侧区域(Yc)和上述内部3’侧区域(Y)分别形成双链，在上述内部区域(Z)中具有与上述5’侧区域(Xe)和上述3’侧区域(Yc)均无法对齐的碱基，也称为具有不形成双链的碱基的结构。以下，在上述内部区域(Z)中，将上述无法对齐的碱基(也称为不形成双链的碱基)称为“自由碱基”。图3中，用“F”表示上述自由碱基的区域。上述区域(F)的碱基数没有特别限制。关于上述区域(F)的碱基数(F)，例如，在上述(a)的ssNc分子的情况下，为“X-Xc”的碱基数；在上述(b)的ssNc分子的情况下，为“Y-Yc”的碱基数；在上述(c)的ssNc分子的情况下，为“X-Xc”的碱基数与“Y-Yc”的碱基数的总数。另一方面，上述(d)的ssNc分子例如为上述内部区域(Z)的全部区域与上述5’侧区域(Xe)和上述3’侧区域(Yc)对齐的结构，也可称为上述内部区域(Z)的全部区域形成双链的结构。需要说明的是，上述(d)的ssNc分子中，上述5’侧区域(Xe)的5’末端与上述3’侧区域(Yc)的3’末端未连结。关于本发明的ssNc分子，以下例示出各区域的长度，但本发明不限于此。本发明中，碱基数的数值范围例如公开了属于其范围的全部正整数，例如，“广4碱基”的记载是指“1、2、3、4碱基”的全部公开(以下同样)。上述5’侧区域(Xe)、上述3’侧区域(Yc)以及上述内部区域(Z)中的上述自由碱基(F)的碱基数的合计例如为上述内部区域(Z)的碱基数。因此，上述5’侧区域(Xe)和上述3’侧区域(Yc)的长度例如可以根据上述内部区域(Z)的长度、上述自由碱基的数(F)及其位置而适宜决定。上述内部区域(Z)的碱基数例如为19碱基以上。上述碱基数的下限例如为19碱基、优选为20碱基、更优选为21碱基。上述碱基数的上限例如为50碱基、优选为40碱基、更优选为30碱基。上述内部区域(Z)的碱基数的具体例例如为19碱基、20碱基、21碱基、22碱基、23碱基、24碱基、25碱基、26碱基、27碱基、28碱基、29碱基或30碱基。
上述内部区域(Z)包含上述表达抑制序列的情况下，上述内部区域(Z)例如可以为仅由上述表达抑制序列构成的区域，也可以为包含上述表达抑制序列的区域。上述表达抑制序列的碱基数例如为I扩30碱基、优选为19、20或21碱基。上述内部区域(Z)包含上述表达抑制序列的情况下，在上述表达抑制序列的5’侧和/或3’侧还可以具有附加序列。上述附加序列的喊基数例如为I 31喊基、优选为I 21喊基、更优选为I 11喊基、进一步优选为f 7碱基。上述5’侧区域(Xe)的碱基数例如为f 29碱基，优选为f 11碱基，更优选为f 7碱基，进一步优选为广4碱基，特别优选为I碱基、2碱基、3碱基。上述内部区域(Z)或上述3’侧区域(Yc)包含上述表达抑制序列的情况下，例如，优选为这样的碱基数。作为具体例，在上述内部区域(Z)的碱基数为1扩30碱基(例如，19碱基)的情况下，上述5’侧区域(Xe)的碱基数例如为f 11碱基，优选为Γ7碱基，更优选为Γ4碱基，进一步优选为I碱基、2碱基、3碱基。上述5’侧区域(Xe)包含上述表达抑制序列的情况下，上述5’侧区域(Xe)例如可以为仅由上述表达抑制序列构成的区域，也可以为包含上述表达抑制序列的区域。上述表达抑制序列的长度例如如前所述。上述5’侧区域(Xe)包含上述表达抑制序列的情况下，在上述表达抑制序列的5’侧和/或3’侧还可以具有附加序列。上述附加序列的碱基数例如为f 11碱基、优选为f 7碱基。上述3’侧区域(Yc)的碱基数例如为f 29碱基，优选为f 11碱基，更优选为f 7碱基，进一步优选为广4碱基，特别优选为I碱基、2碱基、3碱基。上述内部区域(Z)或上述5’侧区域(Xe)包含上述表达抑制序列的情况下，例如，优选为这样的碱基数。作为具体例，在上述内部区域(Z)的碱基数为1扩30碱基(例如，19碱基)的情况下，上述3’侧区域(Yc)的碱基数例如为f 11碱基，优选为Γ7碱基，更优选为Γ4碱基，进一步优选为I碱基、2碱基、3碱基。上述3’侧区域(Yc)包含上述表达抑制序列的情况下，上述3’侧区域(Yc)例如可以为仅由上述表达抑制序列构成的区域，还可以为包含上述表达抑制序列的区域。上述表达抑制序列的长度例如如前所述。上述3’侧区域(Yc)包含上述表达抑制序列的情况下，在上述表达抑制序列的5’侧和/或3’侧还可以具有附加序列。上述附加序列的碱基数例如为f 11碱基、优选为f 7碱基。如上所述，上述内部区域(Z)、上述5’侧区域(Xe)以及上述3’侧区域(Yc)的碱基数例如能够以上述式(2)的“Z彡Xc+Yc”表示。作为具体例，“Xc+Yc”的碱基数例如与上述内部区域(Z)相同，或者小于上述内部区域(Z)。为后者的情况下，“Z-(Xc+Yc)”例如为广10，优选为广4，更优选为1、2或3。上述“Z-(Xc+Yc)”例如相当于上述内部区域(Z)中的上述自由碱基的区域(F)的碱基数(F)。本发明的ssNc分子中，上述连接子区域(Lx)和上述连接子区域(Ly)的长度没有特别限制。上述连接子区域(Lx)例如优选为上述内部5’侧区域(X)与上述5’侧区域(Xe)能够形成双链的长度，上述连接子区域(Ly)例如优选为上述内部3’侧区域(Y)与上述3’侧区域(Yc)能够形成双链的长度。上述连接子区域(Lx)和上述连接子区域(Ly)的构成单元包含碱基的情况下，上述连接子区域(Lx)和上述连接子区域(Ly)的各自的碱基数可以相同，也可以不同，另外，其碱基序列可以相同，也可以不同。上述连接子区域(Lx)和上 述连接子区域(Ly)的碱基数的下限例如为I碱基、优选为2碱基、更优选为3碱基，其上限例如为100碱基、优选为80碱基、更优选为50碱基。关于上述各连接子区域的碱基数，作为具体例，可以例示出例如广50碱基、30碱基、20碱基、f 10碱基、7碱基、1 4碱基等，但不限于此。本发明的ssNc分子的全长没有特别限制。本发明的ssNc分子中，上述碱基数的合计(全长的碱基数)的下限例如为38碱基、优选为42碱基、更优选为50碱基、进一步优选为51碱基、特别优选为52碱基，其上限例如为300碱基、优选为200碱基、更优选为150碱基、进一步优选为100碱基、特别优选为80碱基。本发明的ssNc分子中，除上述连接子区域(Lx)和连接子区域(Ly)以外的碱基数的合计的下限例如为38碱基、优选为42碱基、更优选为50碱基、进一步优选为51碱基、特别优选为52碱基，上限例如为300碱基、优选为200碱基、更优选为150碱基、进一步优选为100碱基、特别优选为80碱基。本发明的ssNc分子的构成单元没有特别限制，可以举出例如核苷酸残基。上述核苷酸残基可以举出例如核糖核苷酸残基以及脱氧核糖核苷酸残基。上述核苷酸残基可以举出例如未经修饰的非修饰核苷酸残基和经修饰的修饰核苷酸残基。本发明的ssNc分子例如通过包含上述修饰核苷酸残基，能够提高核酸酶耐受性，能够提高稳定性。另外，本发明的ssNc分子除了例如上述核苷酸残基之外，还可以包含非核苷酸残基。上述核苷酸残基和上述非核苷酸残基详见后述。本发明的ssNc分子中，上述内部区域(Z)、上述5’侧区域(Xe)和上述3’侧区域(Yc)的构成单元分别优选为上述核苷酸残基。上述各区域例如由下述(1Γ(3)的残基构成。(I)非修饰核苷酸残基(2)修饰核苷酸残基(3)非修饰核苷酸残基和修饰核苷酸残基本发明的ssNc分子中，上述连接子区域(Lx)和上述连接子区域(Ly)的构成单元没有特别限制，例如，可以举出上述核苷酸残基和上述非核苷酸残基。上述连接子区域例如可以仅由上述核苷酸残基构成，也可以仅由上述非核苷酸残基构成，还可以由上述核苷酸残基和上述非核苷酸残基构成。上述连接子区域例如由下述(I广(7)的残基构成。
(I)非修饰核苷酸残基(2)修饰核苷酸残基(3)非修饰核苷酸残基和修饰核苷酸残基(4)非核苷酸残基(5)非核苷酸残基和非修饰核苷酸残基(6)非核苷酸残基和修饰核苷酸残基(7)非核苷酸残基、非修饰核苷酸残基以及修饰核苷酸残基本发明的ssNc分子具有上述连接子区域(Lx)和上述连接子区域(Ly)两者的情况下，例如，两者的构成单元可以相同，也可以不同。作为具体例，可以举出例如两连接子区 域的构成单元为上述核苷酸残基的形态，两连接子区域的构成单元为上述非核苷酸残基的形态，一个区域的构成单元为上述核苷酸残基而另一个连接子区域的构成单元为非核苷酸残基的形态等。本发明的ssNc分子可以举出例如仅由上述核苷酸残基构成的分子，除上述核苷酸残基以外还包含上述非核苷酸残基的分子等。本发明的ssNc分子中，如上所述，上述核苷酸残基例如可以仅为上述非修饰核苷酸残基，也可以仅为上述修饰核苷酸残基，还可以为上述非修饰核苷酸残基和上述修饰核苷酸残基两者。上述ssNc分子包含上述非修饰核苷酸残基和上述修饰核苷酸残基的情况下，上述修饰核苷酸残基的个数没有特别限制，例如为“I个或数个”，具体而言，例如为Γ5个、优选为Γ4个、更优选为Γ3个、最优选为I个或2个。本发明的ssNc分子包含上述非核苷酸残基的情况下，上述非核苷酸残基的个数没有特别限制，例如为“I个或数个”，具体而言，例如为I、个、:Γ6个、:Γ4个、I个、2个或3个。本发明的ssNc分子中，上述核苷酸残基例如优选为核糖核苷酸残基。该情况下，本发明的ssNc分子例如也称为“RNA分子”或“ssRNA分子”。上述ssRNA分子可以举出例如仅由上述核糖核苷酸残基构成的分子，除上述核糖核苷酸残基以外还包含上述非核苷酸残基的分子。上述ssRNA分子中，如上所述，上述核糖核苷酸残基例如可以仅为上述非修饰核糖核苷酸残基，也可以仅为上述修饰核糖核苷酸残基，还可以包含上述非修饰核糖核苷酸残基和上述修饰核糖核苷酸残基两者。上述ssRNA分子例如在除上述非修饰核糖核苷酸残基以外还包含上述修饰核糖核苷酸残基的情况下，上述修饰核糖核苷酸残基的个数没有特别限制，例如为“I个或数个”，具体而言，例如为广5个，优选为广4个，更优选为广3个，最优选为I个或2个。与上述非修饰核糖核苷酸残基相对的上述修饰核糖核苷酸残基可以为例如核糖残基被脱氧核糖残基取代了的上述脱氧核糖核苷酸残基。上述ssRNA分子例如在除上述非修饰核糖核苷酸残基以外还包含上述脱氧核糖核苷酸残基的情况下，上述脱氧核糖核苷酸残基的个数没有特别限制，例如为“I个或数个”，具体而言，例如为Γ5个，优选为Γ4个，更优选为广3个，最优选为I个或2个。本发明的ssNc分子例如包含标记物质，可以被上述标记物质标记化。上述标记物质没有特别限制，可以举出例如荧光物质、色素、同位素等。上述标记物质可以举出例如芘、TAMRA、荧光素、Cy3色素、Cy5色素等荧光团，上述色素可以举出例如Alexa488等Alexa色素等。上述同位素可以举出例如稳定同位素和放射性同位素，优选为稳定同位素。上述稳定同位素例如由于暴露的危险性小，也不需要专用的设施，因而操作性优异，另外还能够降低成本。另外，上述稳定同位素例如不存在标记的化合物的物性变化，作为示踪物的性质也优异。上述稳定同位素没有特别限制，可以举出例如2h、13c、15n、17o、18o、33s、34s和36S0如上所述，本发明的ssNc分子能够抑制上述靶基因的表达。因此，本发明的ssNc分子例如能够用作基因成为原因的疾病的治疗剂。本发明的ssNc分子例如含有作为上述表达抑制序列的、抑制上述成为疾病原因的基因的表达的序列的情况下，例如，通过上述靶基因的表达抑制，能够治疗上述疾病。本发明中，“治疗”包含例如上述疾病的预防、疾病的改善、预后的改善的含义，可以为任意一种。本发明的ssNc分子的使用方法没有特别限制，例如，对具有上述靶基因的投与对象投与上述ssNc分子即可。上述投与对象可以举出例如细胞、组织或器官。上述投与对象可以举出例如人，除 人以外的非人哺乳类等非人动物。上述投与例如可以为体内，也可以为体外。上述细胞没有特别限制，可以举出例如HeLa细胞、293细胞、NIH3T3细胞、COS细胞等各种培养细胞；ES细胞、造血干细胞等干细胞；初代培养细胞等由生物体分离的细胞；等等。本发明中，作为表达抑制的对象的上述靶基因没有特别限制，能够设定期望基因。而且，如上所述，根据上述靶基因的种类适宜设计上述表达抑制序列即可。以下示出本发明的ssNc分子的具体例，但本发明不受其任何限制。上述ssNc分子的碱基序列可以例示出例如序列号2、7、8、13、14、29 35、37、43、44、47、48以及51 80的碱基序列，另外，也可以为上述碱基序列中例如缺失、被取代和/或附加I个或数个的碱基序列。上述靶基因为GAPDH基因的情况下，可以举出例如序列号2、7、8、13、37以及5广80的碱基序列，靶基因为TGF-β I的情况下，可以举出例如序列号14以及29 35的碱基序列，上述靶基因为LAMAl基因的情况下，可以举出例如序列号43和44的碱基序列，上述靶基因为LMNA基因的情况下,可以举出例如序列号47和48的喊基序列。关于本发明的ssNc分子的使用，能够援引后述的本发明的组合物、表达抑制方法和治疗方法等的记载。如上所述，本发明的ssNc分子能够抑制靶基因表达，因此作为例如医药品、诊断药和农药、以及农药、医学、生命科学等的研究工具有用。2.核苷酸残基上述核苷酸残基例如包含糖、碱基和磷酸作为构成要素。如上所述，上述核苷酸残基可以举出例如核糖核苷酸残基和脱氧核糖核苷酸残基。上述核糖核苷酸残基例如具有核糖残基作为糖，具有腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)和U (尿嘧啶)作为碱基，上述脱氧核糖残基例如具有脱氧核糖残基作为糖，具有腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)和胸腺嘧啶⑴作为碱基。上述核苷酸残基可以举出未修饰核苷酸残基和修饰核苷酸残基。上述未修饰核苷酸残基中，上述各构成要素例如与天然存在的构成要素相同或实质上相同，优选与人体中天然存在的构成要素相同或实质上相同。上述修饰核苷酸残基例如为对上述未修饰核苷酸残基进行了修饰的核苷酸残基。上述修饰核苷酸残基例如可以对上述未修饰核苷酸残基的构成要素的任意一者进行了修饰。本发明中，“修饰”例如为上述构成要素的取代、附加和/或缺失；上述构成要素中的原子和/或官能团的取代、附加和/或缺失，能够称为“改变”。上述修饰核苷酸残基可以举出例如天然存在的核苷酸残基、人工修饰的核苷酸残基等。上述天然来源的修饰核苷酸残基可以参照例如 Limbach 等(Limbach et al.、1994、Summary :the modified nucleosidesof RNA, Nucleic Acids Res. 22 :2183 2196)。另外，上述修饰核苷酸残基例如可以为上述核苷酸的代替物的残基。上述核苷酸残基的修饰可以举出例如核糖-磷酸骨架(以下，核糖磷酸骨架)的修饰。上述核糖磷酸骨架中，例如，能够修饰核糖残基。上述核糖残基例如能够修饰2’位碳，具体而言，例如，能够将2’位碳上键合的羟基取代为氢或者氟等卤素。通过将上述2’位碳的轻基取代为氢，能够将核糖残基取代为脱氧核糖。上述核糖残基例如能够取代为立体异构体，例如，可以取代为阿拉伯糖残基。上述核糖磷酸骨架例如可以取代为具有非核糖残基和/或非磷酸的非核糖磷酸骨架。上述非核糖磷酸骨架可以举出例如上述核糖磷酸骨架的非带电体。被取代为 上述非核糖磷酸骨架的上述核苷酸的代替物可以举出例如吗啉代、环丁基、吡咯烷等。除此之外，上述代替物可以举出例如人工核酸单体残基。作为具体例，可以举出例如PNA (肽核酸)、LNA (锁核酸，Locked Nucleic Acid)、ΕΝΑ (2，-O, 4，-C-亚乙基桥联核酸，2，_0，4，-C-Ethylenebridged Nucleic Acid)等，优选为 PNA。上述核糖磷酸骨架中，例如，能够修饰磷酸基。上述核糖磷酸骨架中，与糖残基最邻近的磷酸基被称为α磷酸基。上述α磷酸基带负电，其电荷均匀分布在不与糖残基键合的2个氧原子。在上述α磷酸基的4个氧原子之中，以下将不在核苷酸残基间的磷酸二酯键中与糖残基键合的2个氧原子称为“非键合(non-linking)氧”。另一方面，以下将在上述核苷酸残基间的磷酸二酯键中与糖残基键合的2个氧原子称为“键合(linking)氧”。上述α磷酸基例如优选进行成为非带电的修饰、或者上述非键合氧中的电荷分布成为非对称型的修饰。上述磷酸基中，例如可以取代上述非键合氧。上述氧能够用例如S (硫)、Se (硒)、B (硼)、C (碳)、Η(氢)、Ν(氮)和OR(R为烷基或芳基)中的任意原子取代，优选用S取代。上述非键合氧例如优选两者被取代，更优选两者用S取代。上述修饰磷酸基可以举出例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硫代硒酸酯、硼代磷酸酯、硼代磷酸酯、氢膦酸酯、氮代磷酸酯、烷基膦酸酯或芳基膦酸酯以及磷酸三酯等，其中，优选上述2个非键合氧的两者均为被S取代的二硫代磷酸酯。上述磷酸基中，例如可以取代上述键合氧。上述氧能够用例如S(硫)、C(碳)和N(氮)中的任一原子取代。上述修饰磷酸基可以举出例如用N取代的交联磷酰胺酯、用S取代的交联硫代磷酸酯和用C取代的交联亚甲基膦酸酯等。上述键合氧的取代例如优选在本发明的ssNc分子的5’末端核苷酸残基和3’末端核苷酸残基的至少一者进行,在5’侧的情况下，优选利用C取代，在3’侧的情况下，优选利用N取代。上述磷酸基例如可以取代为上述非含磷的连接子。上述连接子包含例如硅氧烷、碳酸酯、羧甲基、氨基甲酸酯、酰胺、硫醚、环氧乙烷连接子、磺酸酯、磺酰胺、硫甲缩醛、甲缩醛、肟、亚甲基亚氨基、亚甲基甲基亚氨基、亚甲基肼基、亚甲基二甲基肼基和亚甲氧基甲基亚氨基等，优选包含亚甲基羰基氨基和亚甲基甲基亚氨基。
本发明的ssNc分子例如可以3’末端和5’末端的至少一者的核苷酸残基被修饰。上述修饰例如可以是3’末端和5’末端中的任一者，也可以是两者。如上所述，上述修饰例如优选对末端的磷酸基进行。上述磷酸基例如可以修饰整体，也可以修饰上述磷酸基中的I个以上原子。在前者的情况下，例如，可以为磷酸基整体的取代，也可以为缺失。上述末端的核苷酸残基的修饰可以举出例如其他分子的附加。上述其他分子可以举出例如上述那样的标记物质、保护基等功能性分子。上述保护基可以举出例如S(硫)、Si (硅)、B (硼)、含酯基团等。上述标记物质等功能性分子例如能够用于本发明的SSNc分子的检测等。上述其他分子例如可以附加于上述核苷酸残基的磷酸基，也可以通过间隔臂附加于上述磷酸基或上述糖残基。上述间隔臂的末端原子例如能够附加于上述磷酸基的上述键合氧或者糖残基的O、N、S或C或进行取代。上述糖残基的键合部位例如优选为3’位的C或5’位的C、或者与它们键合的原子。上述间隔臂例如还能够附加于上述PNA等核苷酸代替物的末端原子或进行取代。
上述间隔臂没有特别限制，可以包含例如-(CH2) n_、- (CH2) nN_、- (CH2) n0_、- (CH2)nS-、0 (CH2CH2O) nCH2CH20H、无碱基糖、酰胺、羧基、胺、羟基胺、羟基亚胺、硫醚、二硫醚、硫脲、磺酰胺和吗啉代等、以及生物素试剂和荧光素试剂等。上述式中，η为正整数，优选n=3或6。除了这些之外，附加在上述末端的分子可以举出例如色素、嵌合剂(例如，吖啶)、交联剂(例如，补骨脂素、丝裂霉素C)、卩卜啉(TPPC4、Texaphyrin、Sapphyrin)、多环式芳香族烃(例如，吩嗪、二氢吩嗪)、人工核酸内切酶(例如，EDTA)、亲油性载体(例如，胆固醇、胆酸、金刚烷乙酸、I-芘丁酸、二氢睾酮、1，3-双-O (十六烷基)甘油、栊牛儿醇基己基、十六烷基甘油、冰片、薄荷醇、1，3-丙二醇、十七烷基、棕榈酸、肉豆蘧酸、03-(油酰基)石胆酸、03-(油酰基)胆酸、二甲氧基三苯甲基或者吩噁嗪)和肽复合体(例如，黑腹果蝇触足肽、Tat肽)、烷基化剂、磷酸、氨基、巯基、PEG(例如，PEG-40K)、MPEG、[MPEG]2、聚氨基、烷基、取代烷基、放射线标记物、酶、半抗原(例如，生物素)、输送/吸收促进剂(例如，阿司匹林、维生素E、叶酸)、合成核糖核酸酶(例如，咪唑、二咪唑、组胺、咪唑簇、吖啶-咪唑复合体、四氮杂大环的Eu3+复合体)等。本发明的ssNc分子的上述5’末端可以用例如磷酸基或磷酸基类似物修饰。上述磷酸基可以举出例如，5’单磷酸((H0)2(0)P-0-5，)、5，二磷酸((HO)2(O)P-O-P (HO)(O)-0-5，)、5，三磷酸((HO)2(O)P-O-(HO) (O)P-O-P(HO) (O)-0-5，)、5’ -鸟苷帽(7-甲基化或非甲基化、7m-G-0-5’ - (HO) (O) P-O- (HO) (O) P-O-P (HO) (O) -0-5，)、5，-腺苷帽(Appp)、任意的修饰或非修饰核苷酸帽结构(N-0-5，- (HO) (O)P-O-(HO) (O)P-O-P(HO) (0)-0_5，)、
5’ -硫代磷酸(硫代磷酸酯(HO) 2 (S) P-0-5 ’)、5 ’ - 二硫代磷酸(二硫代磷酸酯(HO) (HS)
(S)P-0-5’)、5’_硫代磷酸酯((H0)2(0)P-S-5’)、硫取代的单磷酸、二磷酸和三磷酸(例如，5’ - α -硫代三磷酸、5’ -Y-硫代三磷酸等)、5’ -磷酰胺酯((HO) 2 (O) Ρ-ΝΗ-5’、(HO) (NH2)(0)Ρ-0-5’)、5’ -烷基膦酸(例如，RP(OH) (O)-0-5’、(OH)2 (O) Ρ-5’ -CH2、R 为烷基(例如，甲基、乙基、异丙基、丙基等))、5’ -烷基醚膦酸(例如，RP(OH) (O)-0-5’、R为烷基醚(例如，甲氧基甲基、乙氧基甲基等))等。上述核苷酸残基中，上述碱基没有特别限制。上述碱基例如可以为天然的碱基，也可以为非天然的碱基。上述碱基例如可以为天然来源，也可以为合成品。上述碱基例如能够使用一般的碱基、其修饰类似物等。上述碱基可以举出例如腺嘌呤和鸟嘌呤等嘌呤碱基；胞嘧啶、尿嘧啶和胸腺嘧啶等嘧啶碱基。除此之外，上述碱基还可以举出肌苷、胸腺嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤、nubularine、isoguanisine、杀结核菌素(tubercidine)等。上述碱基可以举出例如2-氨基腺嘌呤、6-甲基化嘌呤等烷基衍生物；2_丙基化嘌呤等烷基衍生物；5-卤代尿嘧啶和5-卤代胞嘧啶；5_丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶；6_偶氮尿嘧啶、6-偶氮胞嘧啶和6-偶氮胸腺嘧啶；5_尿嘧啶(假尿嘧啶)、4_硫尿嘧啶、5-卤代尿嘧啶、5-(2-氨基丙基)尿嘧啶、5-氨基烯丙基尿嘧啶；8_卤化、氨基化、硫醇化、硫代烷基化、羟基化和其他的8-取代嘌呤；5-三氟甲基化和其他的5-取代嘧啶；7-甲基鸟嘌呤；5_取代嘧啶；6_氮杂嘧啶；N-2、N-6和0-6取代嘌呤(包含2-氨基丙基腺嘌呤);5_丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶；二氢尿嘧啶；3_去氮-5-氮杂胞嘧啶；2_氨基嘌呤；5_烷基尿嘧啶；7_烷基鸟嘌呤；5_烷基胞嘧啶；7-去氮腺嘌呤；N6，N6-二甲基腺嘌呤；2，6-二氨基嘌呤；5-氨基-烯丙基-尿嘧啶；N3-甲基尿嘧啶；取代1，2，4-三唑；2_吡啶酮；5_硝基吲哚；3_硝基吡咯；5_甲氧基尿嘧 啶；尿嘧啶-5-氧基乙酸；5_甲氧基羰基甲基尿嘧啶；5-甲基-2-硫尿嘧啶；5-甲氧基羰基甲基-2-硫尿嘧啶；5-甲氨基甲基-2-硫尿嘧啶；3-(3-氨基-3-羧基丙基)尿嘧啶；3-甲基胞嘧啶；5-甲基胞嘧啶；N4-乙酰基胞嘧啶；2_硫胞嘧啶；N6-甲基腺嘌呤；N6-异戊基腺嘌呤；2-甲硫基-N6-异戊烯基腺嘌呤；N-甲基鸟嘌呤；0_烷基化碱基等。另外，嘌呤和嘧丨淀包含例如美国专利第 3，687，808 号、“Concise Encyclopedia Of Polymer Science AndEngineering，，、858 859 页、Kroschwitz J. I.编、John ffiley&S ons、1990 ;和 Englisch 等、Angewandte Chemie、International Edition、1991、30 卷、p. 613 所公开的物质。除了这些之外，上述修饰核苷酸残基还可以包含例如缺失碱基的残基、即无碱基的核糖磷酸骨架。另外，上述修饰核苷酸残基能够使用例如美国临时申请第60/465，665号(申请日2003年4月25日)和国际申请第PCT/US (MA)7O7O号(申请日2004年3月8日)中记载的残基，本发明能够援引这些文献。3.非核苷酸残基上述非核苷酸残基没有特别限制。关于本发明的ssNc分子，例如作为上述非核苷酸残基，可以具有包含吡咯烷骨架或哌啶骨架的非核苷酸结构。优选的是，例如上述连接子区域(Lx)和上述连接子区域(Ly)中的至少一者具有上述非核苷酸残基。可以在例如上述连接子区域(Lx)中具有上述非核苷酸残基，也可以在上述连接子区域(Ly)中具有上述非核苷酸残基，还可以在两个上述连接子区域中具有上述非核苷酸残基。上述连接子区域(Lx)和上述连接子区域(Ly)例如可以相同，也可以不同。上述吡咯烷骨架例如可以是构成吡咯烷的五元环的碳的I个以上被取代了的吡咯烷衍生物的骨架，在被取代的情况下，例如，优选为C-2的碳以外的碳原子。上述碳可以被例如氮、氧或硫取代。上述吡咯烷骨架例如可以在吡咯烷的五元环内包含例如碳-碳双键或碳-氮双键。上述吡咯烷骨架中，构成吡咯烷的五元环的碳和氮例如可以键合氢，也可以键合后述的取代基。上述连接子区域(Lx)例如可以介由上述吡咯烷骨架中的任一基团而与上述区域(X)和上述区域(Xe)结合，优选为上述五元环的任意I个碳原子和氮，优选为上述五元环的2位的碳(C-2)和氮。作为上述吡咯烷骨架，可以举出例如为脯氨酸骨架、脯氨醇骨架等。上述脯氨酸骨架和脯氨醇骨架等由于为例如生物体内物质及其还原体，因此安全性也优异。上述哌啶骨架例如可以是构成哌啶的六元环的碳的I个以上被取代了的哌啶衍生物的骨架，在被取代的情况下，例如，优选为C-2的碳以外的碳原子。上述碳可以被例如氮、氧或硫取代。上述哌啶骨架例如可以在哌啶的六元环内包含例如碳-碳双键或碳-氮双键。上述哌啶骨架中，构成哌啶的六元环的碳和氮例如可以键合氢基，也可以键合后述的取代基。上述连接子区域(Lx)例如可以介由上述哌啶骨架中的任一基团而与上述区域(X)和上述区域(Xe)结合，优选为上述六元环中的任意I个碳原子和氮，优选为上述六元环的2位的碳(C-2)和氮。关于上述连接子区域(Ly)，也相同。上述连接子区域例如可以仅为由上述非核苷酸结构构成的非核苷酸残基，也可以包含由上述非核苷酸结构构成的非核苷酸残基以及核苷酸残基。上述连接子区域例如由下述式⑴表示。
[化学式I]
R3
N
、八。人入#
H
■ ■ ·⑴上述式(I)中，X1和X2各自独立地为H2、O、S或NH ;Y1和Y2各自独立地为单键、CH2、NH、O或S ;R3为与环A上的C-3、C-4、C_5或C_6键合的氢原子或取代基，上述取代基为OH、OR4、NH2, NHR4, NR4R5, SH、SR4 或氧基(=0)；R3为上述取代基的情况下，取代基R3可以为I个，也可以为多个，还可以不存在，在为多个的情况下，可以相同也可以不同；R4和R5为取代基或保护基，可以相同也可以不同；L1为由η个原子构成的亚烧基链,此处,亚烧基碳原子上的氢原子可以被OH、ORa>NH2、NHRa、NRaRb、SH或SRa取代，也可以不被取代，或者，L1为上述亚烷基链的I个以上碳原子被氧原子取代的聚醚链，其中，Y1为ΝΗ、0或S的情况下，与Y1键合的L1的原子为碳，与OR1键合的L1的原子为碳，氧原子彼此不相邻；L2为由m个原子构成的亚烷基链，此处，亚烷基碳原子上的氢原子可以被OH、ORc,NH2, NHRc, NRcRd, SH或SRe取代，也可以不被取代，或者，L2为上述亚烷基链的I个以上碳原子被氧原子取代的聚醚链，其中，Y2为ΝΗ、0或S的情况下，与Y2键合的L2的原子为碳，与OR2键合的L2的原子为碳，氧原子彼此不相邻；Ra、Rb、Rc和Rd各自独立地为取代基或保护基；
I 为 I 或 2 ;m为0 30的范围的整数，；η为0 30的范围的整数，；环A可以是上述环A上的C-2以外的I个碳原子被氮、氧或硫取代，上述环A内可以包含碳-碳双键或碳-氮双键。在上述连接子区域(Lx)用上述式(I)表示的情况下，上述区域(Xe)和上述区域(X)分别介由-OR1-或-OR2-与上述连接子区域(Lx)结合。另外，在上述连接子区域(Ly)用上述式(I)表示的情况下，上述区域(Yc)和上述区域(Y)分别介由-OR1-或-OR2-与上述连接子区域(Ly)结合。此处，R1和R2可以存在也可以不存在，R1和R2存在的情况下，R1和R2各自独立地为核苷酸残基或上述结构⑴。
上述式(I)中，X1和X2例如各自独立地为H2' O、S或ΝΗ。上述式(I)中，X1为H2是指X1和与X1键合的碳原子一起形成ch2(亚甲基)。关于X2，也相同。上述式(I)中，在环A中，I为I或2。1=1的情况下，环A为五元环，例如为上述吡咯烷骨架。上述吡咯烷骨架可以举出例如脯氨酸骨架、脯氨醇骨架等，可例示出它们的二价的结构。1=2的情况下，环A为六元环，例如为上述哌啶骨架。环A可以是环A上的C-2以外的I个碳原子被氮、氧或硫取代。另外，环A可以在环A内包含碳-碳双键或碳-氮双键。环A可以为例如L型和D型中的任意一种。上述式(I)中，Y1和Y2各自独立地为单键、CH2、NH、O或S。上述式⑴中，R3为与环A上的C-3、C-4、C_5或C-6键合的氢原子或取代基。上述取代基为OH、OR4、NH2、NHR4、NR4R5、SH、SR4或氧基(=0)。R3为上述取代基的情况下，取代基R3可以为I个，也可以为多个，还可以不存在，在为多个的情况下，可以相同也可以不同。R4和R5为取代基或保护基，即可以相同也可以不同。上述取代基可以举出例如齒素、烧基、稀基、块基、齒代烧基、芳基、杂芳基、芳烧基、环烧基、环稀基、环烧基烧基、环基烧基、轻基烧基、烧氧基烧基、氣基烧基、杂环基稀基、杂环基烧基、杂芳烧基、甲娃烧基、甲娃烧氧基烧基等。以下同样。上述保护基例如为将反应性高的官能团转换为非活性的官能团，可以举出公知的保护基等。上述保护基例如能够援引文献(J. F. W. McQmie，“Protecting Groups in OrganicChemistry’Trenum Pres s, London and New York, 1973)的记载。上述保护基没有特别限制，可以举出例如叔丁基二甲基甲硅烷基(TBDMS)、双(2-乙酰氧基乙氧基)甲基(ACE)、三异丙基甲硅烷氧基甲基(TOM)，1-(2-氰基乙氧基)乙基(CEE)、2-氰基乙氧基甲基(CEM)以及甲苯磺酰基乙氧基甲基(TEM)、二甲氧基三苯甲基(DMTr)等。R3为OR4的情况下，上述保护基没有特别限制，可以举出例如TBDMS基、ACE基、TOM基、CEE基、CEM基和TEM基等。除此之外，还可以举出后述的含甲硅烷基的基团等。以下也相同。上述式(I)中，L1为由η个原子构成的亚烷基链。上述亚烷基碳原子上的氢原子可以被例如0H、0Ra、NH2、NHRa、NRaRb、SH或SRa取代，也可以不被取代。或者，L1可以为上述亚烷基链的I个以上碳原子被氧原子取代的聚醚链。上述聚醚链例如为聚乙二醇。需要说明的是，Y1为ΝΗ、0或S的情况下，与Y1键合的L1的原子为碳，与OR1键合的L1的原子为碳，氧原子彼此不相邻。即，例如Y1为O的情况下，该氧原子与L1的氧原子不相邻，OR1的氧原子与L1的氧原子不相邻。
上述式(I)中，L2为由m个原子构成的亚烷基链。上述亚烷基碳原子上的氢原子可以被例如0H、0Re、NH2、NHRe、NReRd、SH或SR。取代，也可以不被取代。或者，L2可以为上述亚烷基链的I个以上碳原子被氧原子取代的聚醚链。需要说明的是，Y2为NH、O或S的情况下，与Y2键合的L2的原子为碳，与OR2键合的L2的原子为碳，氧原子彼此不相邻。即，例如，Y2为O的情况下，该氧原子与L2的氧原子不相邻，OR2的氧原子与L2的氧原子不相邻。L1的η和L2的m没有特别限制，下限例如分别为0，上限也没有特别限制。η和m例如能够根据上述连接子区域(Lx)的期望长度适宜设定。例如，从制造成本和收率等方面出发，η和m分别优选为(Γ30、更优选为(Γ20、进一步优选为(Γ15。η和m可以相同(n=m)，也可以不同。n+m例如为(Γ30、优选为(Γ20、更优选为(Γ15。R\R\RC和Rd可以各自独立地举出取代基或保护基。上述取代基和上述保护基例如与前述相同。上述式⑴中，氢原子例如可以各自独立地被Cl、Br、F和I等卤素取代。 上述连接子区域(Lx)用上述式(I)表示的情况下，上述区域(Xe)和上述区域(X)例如分别介由-OR1-或-OR2-与上述连接子区域(Lx)结合。此处，R1和R2可以存在，也可以不存在。R1和R2存在的情况下，R1和R2各自独立地为核苷酸残基或上述式(I)的结构。R1和/或R2为上述核苷酸残基的情况下，上述连接子区域(Lx)例如通过由除去了核苷酸残基R1和/或R2的上述式(I)的结构构成的上述非核苷酸残基以及上述核苷酸残基形成。R1和/或R2为上述式(I)的结构的情况下，上述连接子区域(Lx)例如形成2个以上的由上述式(I)的结构构成的上述非核苷酸残基连结而成的结构。上述式(I)的结构可以包含例如I个、2个、3个或4个。这样，在包含多个上述结构的情况下，上述(I)的结构例如可以直接连结，也可以介由上述核苷酸残基结合。另一方面，不存在R1和R2的情况下，上述连接子区域(Lx)例如仅通过由上述式(I)的结构构成的上述非核苷酸残基形成。另外，上述连接子区域(Ly)用上述式(I)表示的情况下，例如，关于上述区域(Yc)、上述区域(Y)以及上述连接子区域(Ly)，能够援引上述连接子区域(Lx)的说明。上述区域(Xe)和上述区域⑴与上述-OR1-和-OR2-的结合的组合、以及上述区域(Yc)和上述(Y)与上述-OR1-和-OR2-的结合的组合没有特别限制，例如，可以举出以下的任意一个条件。条件(I)上述区域(Xe)介由-OR2-与上述式(I)的结构结合，上述区域⑴介由-OR1-与上述式(I)的结构结合，上述区域(Yc)介由-OR1-与上述式(I)的结构结合，上述区域(Y)介由-OR2-与上述式(I)的结构结合。条件(2)上述区域(Xe)介由-OR2-与上述式(I)的结构结合，上述区域⑴介由-OR1-与上述式(I)的结构结合，上述区域(Yc)介由-OR2-与上述式(I)的结构结合，上述区域⑴介由-OR1-与上述式(I)的结构结合。条件(3)上述区域(Xe)介由-OR1-与上述式(I)的结构结合，上述区域⑴介由-OR2-与上述式(I)的结构结合，上述区域(Yc)介由-OR1-与上述式(I)的结构结合，上述区域(Y)介由-OR2-与上述式(I)的结构结合。条件(4)上述区域(Xe)介由-OR1-与上述式(I)的结构结合，上述区域⑴介由-OR2-与上述式(I)的结构结合，上述区域(Yc)介由-OR2-与上述式(I)的结构结合，上述区域⑴介由-OR1-与上述式(I)的结构结合。上述式(I)的结构可例示出例如下述式(1-1广式(1-9)，下述式中，η和m与上述式⑴相同。下述式中，Q为(TlO的整数。
[化学式2]
权利要求
1.一种单链核酸分子，其特征在于，其为包含抑制靶基因表达的表达抑制序列的单链核酸分子， 从5’侧至3’侧依次包含5’侧区域(Xe)、内部区域(Z)以及3’侧区域(Yc)， 所述内部区域⑵由内部5’侧区域⑴和内部3’侧区域⑴连结而构成， 所述5’侧区域(Xe)与所述内部5’侧区域⑴互补， 所述3’侧区域(Yc)与所述内部3’侧区域⑴互补， 所述内部区域(Z)、所述5’侧区域(Xe)以及所述3’侧区域(Yc)中的至少一者包含所述表达抑制序列。
2.根据权利要求I所述的单链核酸分子，其中，所述5’侧区域(Xe)与所述内部5’侧区域(X)之间具有连接子区域(Lx)， 所述5’侧区域(Xe)与所述内部5’侧区域(X)介由所述连接子区域(Lx)而连结。
3.根据权利要求I或2所述的单链核酸分子，其中，所述3’侧区域(Yc)与所述内部3’侧区域(Y)之间具有连接子区域(Ly)， 所述3’侧区域(Yc)与所述内部3’侧区域(Y)介由所述连接子区域(Ly)而连结。
4.根据权利要求I所述的单链核酸分子，其中，所述5’侧区域(Xe)与所述内部5’侧区域(X)之间具有连接子区域(Lx)， 所述5’侧区域(Xe)与所述内部5’侧区域(X)介由所述连接子区域(Lx)而连结， 所述3’侧区域(Yc)与所述内部3’侧区域(Y)之间具有连接子区域(Ly)， 所述3’侧区域(Yc)与所述内部3’侧区域(Y)介由所述连接子区域(Ly)而连结。
5.根据权利要求广4中任一项所述的单链核酸分子，其中，所述内部区域(Z)的碱基数⑵、所述内部5’侧区域⑴的碱基数⑴、所述内部3’侧区域⑴的碱基数⑴、所述5’侧区域(Xe)的碱基数(Xe)以及所述3’侧区域(Yc)的碱基数(Yc)满足下述式(I)和(2)的条件。
Z=X+Y…(I)Z 彡 Xc+Yc... (2)
6.根据权利要求f5中任一项所述的单链核酸分子，其中，所述内部5’侧区域(X)的碱基数(X)、所述5’侦彳区域(Xe)的碱基数(Xe)、所述内部3’侦彳区域(Y)的碱基数(Y)以及所述3’侧区域(Yc)的碱基数(Yc)满足下述(ar(d)中的任意一个条件， (a)满足下述式(3)和⑷的条件，X > Xe …(3)Y=Yc …(4) (b)满足下述式(5)和(6)的条件，X=Xc …(5)Y> Yc …(6) (c)满足下述式(J)和⑶的条件，X > Xe …(7)Y> Yc …(8) (d)满足下述式(9)和(10)的条件。X=Xc …(9)Y=Yc…(10)
7.根据权利要求6所述的单链核酸分子，其中，所述(ar(d)中，所述内部5’侧区域(X)的碱基数⑴与所述5’侧区域(Xe)的碱基数(Xe)之差、所述内部3’侧区域⑴的碱基数(Y)与所述3’侧区域(Yc)的碱基数(Yc)之差满足下述条件， (a)满足下述式(11)和(12)的条件，X-Xc=U2 或 3... (11) Y-Yc=O …(12) (b)满足下述式(13)和(14)的条件， X-Xc=O…(13) Y-Yc=l、2 或 3 …(14) (c)满足下述式(15)和(16)的条件， X-Xc=l、2 或 3 …(15) Y-Yc=l、2 或 3 …(16) (d)满足下述式(17)和(18)的条件。
X-Xc=O …(17) Y-Yc=O …(18)
8.根据权利要求Γ7中任一项所述的单链核酸分子，其中，所述内部区域(Z)的碱基数(Z)为19碱基以上。
9.根据权利要求8所述的单链核酸分子，其中，所述内部区域(Z)的碱基数(Z)为19碱基 30碱基。
10.根据权利要求广9中任一项所述的单链核酸分子，其中，所述5’侧区域(Xe)的碱基数(Xe)为fll碱基。
11.根据权利要求10所述的单链核酸分子，其中，所述5’侧区域(Xe)的碱基数(Xe)为广7碱基。
12.根据权利要求10所述的单链核酸分子，其中，所述5’侧区域(Xe)的碱基数(Xe)为f 3碱基。
13.根据权利要求f12中任一项所述的单链核酸分子，其中，所述3’侧区域(Yc)的碱基数(Yc)为fll碱基。
14.根据权利要求13所述的单链核酸分子，其中，所述3’侧区域(Yc)的碱基数(Yc)为广7碱基。
15.根据权利要求13所述的单链核酸分子，其中，所述3’侧区域(Yc)的碱基数(Yc)为广3碱基。
16.根据权利要求f15中任一项所述的单链核酸分子，其包含至少I个经修饰的残基。
17.根据权利要求f16中任一项所述的单链核酸分子，其包含标记物质。
18.根据权利要求f17中任一项所述的单链核酸分子，其包含稳定同位素。
19.根据权利要求f18中任一项所述的单链核酸分子，其为RNA分子。
20.根据权利要求2 19中任一项所述的单链核酸分子，其中，所述连接子区域(Lx)和/或所述连接子区域(Ly)由核苷酸残基和非核苷酸残基中的至少一者构成。
21.根据权利要求20所述的单链核酸分子，其中，所述核苷酸残基为非修饰核苷酸残基和/或修饰核苷酸残基。
22.根据权利要求20或21所述的单链核酸分子，其中，所述连接子区域(Lx)和/或所述连接子区域(Ly)由下述(1Γ(7)中的任意一者的残基构成。
(1)非修饰核苷酸残基 (2)修饰核苷酸残基 (3)非修饰核苷酸残基和修饰核苷酸残基 (4)非核苷酸残基 (5)非核苷酸残基和非修饰核苷酸残基 (6)非核苷酸残基和修饰核苷酸残基 (7)非核苷酸残基、非修饰核苷酸残基以及修饰核苷酸残基
23.根据权利要求广22中任一项所述的单链核酸分子，其中，所述单链核酸分子中，碱基数的合计为50碱基以上。
24.根据权利要求广23中任一项所述的单链核酸分子，其中，所述基因的表达抑制为基于RNA干扰的表达抑制。
25.根据权利要求广24中任一项所述的单链核酸分子，其中，所述单链核酸分子的碱基序列为序列号2、7、8、13、14、29-35、37、43、44、47、48以及51-80中的任意一个碱基序列。
26.—种表达抑制用组合物，其特征在于，其为用于抑制靶基因表达的组合物， 其包含权利要求广25中任一项所述的单链核酸分子。
27.一种药学组合物，其特征在于，其包含权利要求广25中任一项所述的单链核酸分子。
28.根据权利要求27所述的药学组合物，其为炎症治疗用。
29.—种表达抑制方法,其特征在于，其为抑制祀基因表达的方法， 其使用权利要求广25中任一项所述的单链核酸分子。
30.根据权利要求29所述的表达抑制方法，其包括将所述单链核酸分子投与至细胞、组织或器官的工序。
31.根据权利要求30所述的表达抑制方法，其中，以体内或体外的方式投与所述单链核酸分子。
32.根据权利要求29 31中任一项所述的表达抑制方法，其中，所述基因的表达抑制为基于RNA干扰的表达抑制。
33.一种表达诱导方法，其特征在于，其为诱导抑制靶基因表达的RNA干扰的方法， 其使用权利要求广25中任一项所述的单链核酸分子。
34.一种治疗方法，其特征在于，其为疾病的治疗方法， 其包括将权利要求广25中任一项所述的单链核酸分子投与至患者的工序， 所述单链核酸分子具有抑制成为所述疾病的原因的基因的表达的序列作为所述表达抑制序列。
35.权利要求f25中任一项所述的单链核酸分子的、用于抑制靶基因表达的用途。
36.权利要求广25中任一项所述的单链核酸分子的、用于诱导RNA干扰的用途。
37.一种核酸分子，其特征在于，其为用于疾病的治疗的核酸分子， 所述核酸分子为权利要求广25中任一项所述的单链核酸分子，所述单链核酸分子具有抑制成为所述疾病的原因的基因的表达的序列作为所述表达抑制序列。
全文摘要
本发明提供一种能够抑制基因表达的新的、能够容易且高效地制造的核酸分子。一种分子，其特征在于，其为包含抑制靶基因表达的表达抑制序列的单链核酸分子，从5’侧至3’侧依次包含5’侧区域(Xc)、内部区域(Z)以及3’侧区域(Yc)，上述内部区域(Z)由内部5’侧区域(X)和内部3’侧区域(Y)连结而构成，上述5’侧区域(Xc)与上述内部5’侧区域(X)互补，上述3’侧区域(Yc)与上述内部3’侧区域(Y)互补，上述内部区域(Z)、上述5’侧区域以及上述3’侧区域中的至少一者包含上述表达抑制序列。根据该单链核酸分子，能够抑制上述靶基因的表达。
文档编号C12N15/09GK102918156SQ20118002722
公开日2013年2月6日 申请日期2011年7月8日 优先权日2010年7月8日
发明者大木忠明, 林宏刚, 白水久男, 滨崎智洋, 伊藤彰浩, 铃木宽 申请人:株式会社博纳克