具有递送功能的基因表达调控用单链核酸分子的制作方法
【专利摘要】提供一种单链核酸，其具有递送功能，能够抑制靶基因的表达。一种分子，其特征在于当沿着从5’侧向3’侧的方向观察时以下列顺序包括5’侧区域(Xc)、连接子区域(Lx)、内部区域(Z)、连接子区域(Ly)和3’侧区域(Yc)，其中前述内部区域(Z)由相互连接的内部5’侧区域(X)和内部3’侧区域(Y)构成，前述5’侧区域(Xc)与前述内部5’侧区域(X)互补，前述3’侧区域(Yc)与前述内部3’侧区域(Y)互补，选自前述内部区域(Z)、前述5’侧区域(Xc)和前述3’侧区域(Yc)的至少之一包含抑制靶基因的表达的表达抑制序列，并且一种生物相关物质结合至选自由5’末端、3’末端、前述连接子区域(Lx)和前述连接子区域(Ly)组成的组的至少之一。
【专利说明】具有递送功能的基因表达调控用单链核酸分子
【技术领域】
[0001] 本发明涉及具有递送功能（delivery化nction)的基因表达抑制用单链核酸分 子，包含其的组合物及其用途。
【背景技术】
[0002] 作为用于抑制基因表达的技术，例如RNA干扰（RNAi)是已知的（非专利文献1)。 RNA干扰对基因表达的抑制一般例如通过将短双链RNA分子投与至细胞等来进行。前述双 链RNA分子一般称作siRNA(小干扰RNA)。已报道称基因表达还可被经分子内退火而具有 部分形成于其中的双链的环状RNA分子所抑制（专利文献1)。然而，在该些技术中，诱导基 因表达抑制的RNA分子具有下列问题。
[0003] 首先，为了生产前述SiRNA,必须单独合成正义链和反义链并在该过程结束时将该 些链杂交。因此，存在制造效率低下的问题。此外，当前述SiRNA投与至细胞时，必须在抑 制单链RNA解离的同时将SiRNA投与至细胞，该需要设定用于操作SiRNA的条件的繁重工 作。环状RNA分子具有的问题在于其合成困难。为了应对现状，本发明人构建了具有通过 自身退火产生的双环结构的新的单链核酸分子，解决了上述问题（专利文献2)。
[0004][文献列表]
[0005][专利文献]
[0006]专利文献 1 ;JP-A-2008-278784
[0007]专利文献 2 ;W0 2012/005368 [000引[非专利文献]
[0009]非专利文献 1 ;Fire,等人，化Uire,vol. 391，P. 806-811，1998
【发明内容】
[0010] 发明要解决的巧颖
[0011] 此外，此类新的单链核酸分子需要进一步实现至祀标的优异递送功能。
[0012] 因此，本发明旨在提供具有递送功能的能够抑制祀基因表达的单链核酸。
[001引 巧于解决巧颖的方案
[0014] 为了实现前述目的，本发明的单链核酸分子为具有递送功能的祀基因表达抑制用 单链核酸分子，所述单链核酸分子从5'侧至3'侧依下列顺序包括5'侧区域狂C)、连接子 区域（Lx)、内部区域狂）、连接子区域（Ly)和3'侧区域（Yc),其中前述内部区域狂）通过 内部5'侦眶域佩和内部3'侦眶域（Y)的连接构成，前述5'侦眶域狂C)与前述内部5' 侧区域佩互补，前述3'侧区域（Yc)与前述内部3'侧区域（Y)互补，前述内部区域狂)、 前述5'侧区域狂C)和前述3'侧区域（Yc)的至少之一包括抑制祀基因的表达的表达抑制 序列，且选自由5'末端、3'末端、前述连接子区域（Lx)和前述连接子区域（Ly)组成的组的 至少之一结合至生物相关物质。
[0015] 发明的效果
[0016] 本发明的单链核酸分子能够实现向祀标的优异递送能力，而不必须 (essentially)需要例如递送用载体。因此，例如，不需要考虑载体的毒性，并且可避免设定 与形成核酸分子和载体的复合体相关的各种条件的研究。因此，例如，可减少生产和使用方 面的劳力和成本。
【专利附图】
【附图说明】
[0017] 图1示出说明本发明单链核酸分子的实例的示意图。
[0018] 图2示出说明本发明单链核酸分子的另一实例的示意图。
[0019] 图3为示出本发明实施例中稳定表达蛮火虫英光素酶（P化3LUC)的乳腺癌细胞系 MCF-7的蛮火虫英光素酶基因表达抑制效果（英光素酶的相对活性）的图。
[0020] 图4为示出本发明实施例中稳定表达蛮火虫英光素酶（P化3LUC)的乳腺癌细胞系 MCF-7的蛮火虫英光素酶基因表达抑制效果（英光素酶的相对活性）的另一图。
[0021] 图5为示出本发明实施例中稳定表达蛮火虫英光素酶（P化3LUC)的乳腺癌细胞系 MCF-7的蛮火虫英光素酶基因表达抑制效果（英光素酶的相对活性）的又一图。
[0022] 图6为示出本发明实施例中稳定表达蛮火虫英光素酶（P化3LUC)的乳腺癌细胞系 MCF-7的蛮火虫英光素酶基因表达抑制效果（英光素酶的相对活性）的又一图。
[0023] 图7为示出本发明实施例中稳定表达蛮火虫英光素酶（P化3LUC)的乳腺癌细胞系 MCF-7的蛮火虫英光素酶基因表达抑制效果（英光素酶的相对活性）的又一图。
[0024] 图8为示出本发明实施例中稳定表达蛮火虫英光素酶（P化3LUC)的乳腺癌细胞系 MCF-7的蛮火虫英光素酶基因表达抑制效果（英光素酶的相对活性）的又一图。
[00巧]图9为示出本发明实施例中稳定表达蛮火虫英光素酶（P化3LUC)的乳腺癌细胞系MCF-7的蛮火虫英光素酶基因表达抑制效果（英光素酶的相对活性）的又一图。
[0026] 图10示出本发明实施例中小鼠蛮火虫英光素酶基因表达抑制的测量结果的照 片。图10(a)为示出用本发明单链核酸处理的小鼠的测量结果的照片，图10化）为未处理 小鼠的测量结果的照片。
[0027] 图11为示出图10照片所示全身英光素酶活性（蛮火虫英光素酶基因的表达抑 巧D的测量结果的图。
[0028] 图12为示出图10照片所示脑英光素酶活性（蛮火虫英光素酶基因的表达抑制） 的测量结果的图。
【具体实施方式】
[0029] 除非另有说明，本说明书中使用的术语意指它们在本领域中通常的含义。
[0030] 1.SS化分子
[0031] 如上所述，本发明的单链核酸分子为具有递送功能的祀基因表达抑制用单链核酸 分子，并且所述单链核酸分子的特征在于其从5'侧至3'侧W下列顺序包括5'侧区域狂C)、 连接子区域（Lx)、内部区域狂）、连接子区域（Ly)和3'侧区域（Yc),其中
[0032] 前述内部区域似通过内部5'侧区域佩和内部3'侧区域（Y)的连接构成， [003引前述5'侦眶域狂C)与前述内部5'侦眶域佩互补，
[0034] 前述3'侦眶域（Yc)与前述内部3'侦眶域（Y)互补，
[00巧]前述内部区域狂）、前述5'侧区域狂c)和前述3'侧区域（Yc)的至少之一包括抑 制祀基因的表达的表达抑制序列，和
[0036] 选自由5'末端、3'末端、前述连接子区域（Lx)和前述连接子区域（Ly)组成的组 的至少之一结合至生物相关物质。
[0037] 本发明中，"祀基因的表达抑制"意指例如抑制前述祀基因的表达。前述抑制实现 的机理不特别限定，并可为例如下调或沉默。前述祀基因的表达抑制可通过例如来源于祀 基因的转录产物量的降低；前述转录产物活性的降低；由前述祀基因产生的翻译产物量的 降低；或前述翻译产物活性的降低等来证实。前述蛋白质可为例如成熟蛋白质、进行加工之 前或翻译后修饰的前体蛋白质。
[0038] 本发明的单链核酸分子在下文中还可称为本发明的"SS化分子"。本发明的SS化 分子可用于体内或体外抑制例如祀基因的表达，且还可称为"祀基因的表达抑制用SS化分 子"或"祀基因的表达抑制剂"。此外，本发明的SS化分子可通过例如RNA干扰抑制前述祀 基因的表达，且其还可称为"RNA干扰用SS化分子"、"RNA干扰诱导分子"、"RNA干扰剂"或 "RNA干扰诱导剂"。本发明的SS化分子还可例如抑制干扰素等的副作用。
[0039] 在本发明的SS化分子中，5'端和3'端不相互连接。因此，本发明的SS化分子还 可称为"线性单链核酸分子"。在本发明的SS化分子中，例如，前述内部5'区域狂）和前述 内部3'区域（巧在前述内部区域狂）处直接连接。
[0040] 在本发明的SS化分子中，前述5'侧区域狂C)与前述内部5'侧区域狂）互补，前 述3'侧区域（Yc)与前述内部3'侧区域（Y)互补。因此，在5'侧，双链可通过前述区域 狂C)向区域佩的折回并且前述区域狂C)和佩的自身退火而形成，在3'侧，双链可通过 前述区域（Yc)向区域（Y)的折回且前述区域（Yc)和（Y)的自身退火而形成。
[0041] 在本发明的SS化分子中，前述表达抑制序列为显示例如将本发明的SS化分子体 内或体外引入细胞时抑制前述祀基因表达的活性的序列。前述表达抑制序列不特别限定， 且可根据祀基因的种类适当设定。作为前述表达抑制序列，例如，由SiRNA引起的RNA干扰 中涉及的序列可适当使用。一般而言，RNA干扰为长双链RNA(dsRNA)在细胞中被Dicer裂 解（cleaved)产生由约19至21个碱基对组成且具有凸出的3'端的双链RNA(SiRNA;小干 扰RM)，并且单链RNA之一结合至祀mRNAW降解前述mRNA，从而抑制mRNA的翻译的现象。 作为结合至前述祀mRNA的前述SiRNA的单链RNA的序列，例如，已报道了用于各种祀基因 的各种序列。在本发明中，例如，前述SiRNA的单链RNA的序列可用作前述表达抑制序列。 在本发明中，不仅可使用在本申请提交时已知的SiRNA的单链RNA的序列，而且还可使用未 来将鉴定出的序列，例如作为前述表达抑制序列。
[0042] 前述表达抑制序列为例如优选与前述祀基因的设定区域至少90%的互补、更优选 95%的互补，仍更优选98%的互补，且特别优选100%的互补。当满足该种互补时，例如可 充分减少脱祀效应。
[0043] 推测前述由本发明的SS化分子造成的祀基因的表达抑制，例如通过由在前述内 部区域狂）、前述5'侧区域狂C)和前述3'侧区域（Yc)的至少之一中配置前述表达抑制 序列的结构所引起的RNA干扰或类似于RNA干扰的现象（RNA干扰样的现象）来实现。然 而，应注意的是，本发明决不限于该机理。不像所谓的SiRNA,本发明的SS化分子不W由两 条单链RNA构成的dsRNA的形式引入细胞等，且其不总是必须在细胞中裂解出前述表达抑 制序列。因此，可W说，例如，本发明的SS化分子显示RNA干扰样的功能。
[0044]在本发明的SS化分子中，前述表达抑制序列如上所述包括在前述内部区域狂）、 前述5'侧区域狂C)和前述3'侧区域（Yc)的至少之一中。本发明的SS化分子可包括例 如一个上述表达抑制序列或两个W上的上述表达抑制序列。
[0045] 在后一种情况中，本发明的SS化分子可包括例如；两个W上的针对同一祀基因的 相同表达抑制序列；两个W上的针对同一祀基因的不同表达抑制序列；或者两个W上的针 对不同祀基因的不同表达抑制序列。当本发明的SS化分子包括两个W上的上述表达抑制 序列时，各表达抑制序列的位置不特别限定，且它们可在选自前述内部区域狂)、前述5'侧 区域狂C)和前述3'侧区域（Yc)的一个区域或不同区域中。当本发明的SSNc分子包括两 个W上的针对不同祀基因的上述表达抑制序列时，例如本发明的SS化分子可抑制两种W 上的不同祀基因的表达。
[0046] 如上所述，前述内部区域狂）由相互连接的前述内部5'区域佩和前述内部3' 区域（巧构成。例如，前述区域狂）和（巧直接相互连接而二者之间没有间插序列。前述 内部区域狂）表示为"由相互连接的前述内部5'侧区域佩和前述内部3'侧区域（Y)构 成"仅表示前述5'侧区域狂C)和前述3'侧区域（Yc)之间的序列关系。该定义不意欲限 定，例如在前述SS化分子的使用中，前述内部区域狂）中的前述5'侧区域狂C)和前述3' 侧区域（Yc)是离散的独立区域。目P，例如当前述表达抑制序列包括在前述内部区域狂）中 时，前述表达抑制序列可排列成横跨前述内部区域狂）中的前述区域狂）和（Y)。
[0047] 在本发明的SS化分子中，前述5'侧区域狂C)与前述内部5'侧区域狂）互补。必 须的仅是前述区域狂C)具有与前述区域狂）的全部区域或部分区域互补的序列。具体地， 例如，优选前述区域狂C)包括与前述区域狂C)的全部区域或部分区域互补的序列或由与 前述区域狂C)的全部区域或部分区域互补的序列组成。前述区域狂C)可例如优选与前述 区域狂）的全部区域或部分区域互补，或者前述区域狂C)中的一个或几个碱基可与之非互 补。优选地，前述区域狂C)与之完美互补。在本发明的SS化分子，前述3'侧区域（Yc)与 前述内部3'侧区域（巧互补。必须的仅是前述区域（Yc)具有与前述区域（巧的全部区域 或部分区域互补的序列。具体地，例如，优选前述区域（Yc)包括与前述区域（Y)的全部区 域或部分区域互补的序列或者由与前述区域（Y)的全部区域或部分区域互补的序列组成。 前述区域（Yc)可例如优选与前述区域（Y)的全部区域或部分区域互补，或者前述区域（Yc) 中的一个或几个碱基可与之非互补。优选地，前述区域（Yc)与之完美互补。前述表达"一 个或几个碱基"意指例如1至3个碱基，优选1个碱基或2个碱基。
[0048] 本发明的SS化分子可构造为使得其在前述5'侧区域狂C)和内部5'侧区域狂） 之间具有连接子区域（Lx),并且前述区域狂C)和狂）经前述连接子区域（Lx)连接。
[0049] 本发明的SS化分子在前述3'侧区域（Yc)和内部3'侧区域（Y)之间具有连接子 区域（Ly),前述区域（Yc)和（Y)经前述连接子区域（Ly)连接。
[0050] 前述连接子区域（Lx)和前述连接子区域（Ly)各自优选在自体区域内部具有无自 身退火的结构。
[0051] 在本发明的SS化分子中，前述生物相关物质为显示对生物体的亲和性的物质并 且还称为生物相容性物质。前述生物相关物质为例如包含在源于生物体的组分中的物质或 者具有与该组分相同或相似结构的物质。前述生物相关物质不特别限定，只要其显示对生 物体的亲和性即可，例如，可提及各种功能性物质如维生素和激素等。更具体地，例如，其为 如下所述。
[0052] 例如，前述生物相关物质的第一形态为脂质。本发明的SS化分子可通过具有脂质 来改善例如向细胞内的引入效率和/或耐酶促降解性。该被认为是由于例如下述机理。即， 本发明的SS化分子通过与前述脂质区域和其它核酸区域作为整体形成微团结构（micell structure)而具有改善的细胞膜透过性和改善的耐酶促降解性。另外，本发明的SS化分子 由于前述脂质区域和其它核酸区域形成作为整体的外切体（exosome)样复合体而被理解 为具有更加改善的在生物体内的移动性。本发明不限定为此类机理。
[0053] 前述脂质的具体实例包括单纯脂质、复合脂质、衍生脂质和脂溶性维生素等。前述 单纯脂质的实例包括为脂肪酸和醇的醋的单链脂质。前述复合脂质的实例包括双链磯脂和 糖脂质等。前述衍生脂质的实例包括脂肪酸如饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸等，W及类固醇 (steroids)如胆固醇、和类固醇激素等，等等。前述脂溶性维生素的实例包括视黄醇、生育 酷和巧化醇等。除了该些W外，前述脂质的实例包括油脂、姪类如角蠻帰等和高级醇等。
[0054] 前述单链脂质由例如RCOO-表示。前述双链脂质由例如下式表示。R为例如饱和 脂肪酸如踪搁酸、硬脂酸和肉豆證酸等，W及不饱和脂肪酸如油酸等，等等。
[00 巧]
【权利要求】
1. 一种单链核酸分子，其为具有递送功能的靶基因的表达抑制用单链核酸分子，所述 单链核酸分子从5'侧至3'侧以下列顺序包括5'侧区域（Xc)、连接子区域（Lx)、内部区域 (Z)、连接子区域（Ly)和3'侧区域（Yc)，其中 前述内部区域（Z)通过内部5'侧区域（X)和内部3'侧区域（Y)的连接而构成， 前述5'侧区域（Xc)与前述内部5'侧区域⑴互补， 前述3'侧区域（Yc)与前述内部3'侧区域⑴互补， 前述内部区域（Z)、前述5'侧区域（Xc)和前述3'侧区域（Yc)的至少之一包括抑制靶 基因的表达的表达抑制序列，和 选自由5'末端、3'末端、前述连接子区域（Lx)和前述连接子区域（Ly)组成的组的至 少之一结合至生物相关物质。
2. 根据权利要求1所述的单链核酸分子，其中所述生物相关物质为脂质。
3. 根据权利要求2所述的单链核酸分子，其中所述生物相关物质为单纯脂质、复合脂 质、衍生脂质、单链脂质、双链脂质、糖脂质、脂溶性维生素或类固醇。
4. 根据权利要求2所述的单链核酸分子，其中所述脂质选自由棕榈酸、肉豆蘧酸、硬脂 酸和油酸组成的组的至少之一。
5. 根据权利要求1所述的单链核酸分子，其中所述生物相关物质为选自由抗体蛋白 质、其肽和穿膜肽组成的组的至少之一。
6. 根据权利要求1至5任一项所述的单链核酸分子，其满足下式（1)和（2)的条件： Z=X+Y(1) Z彡Xc+Yc(2) 其中Z为内部区域（Z)的碱基数，X为内部5'侧区域（X)的碱基数，Y为内部3'侧区 域（Y)的碱基数，Xc为5'侧区域（Xc)的碱基数，和Yc为3'侧区域（Yc)的碱基数。
7. 根据权利要求1至6任一项所述的单链核酸分子，其包括至少一种修饰残基。
8. 根据权利要求1至7任一项所述的单链核酸分子，其包括稳定同位素。
9. 根据权利要求1至8任一项所述的单链核酸分子，其中所述连接子区域（Lx)和/或 所述连接子区域（Ly)由核苷酸残基和非核苷酸残基的至少之一构成。
10. 根据权利要求9所述的单链核酸分子，其中所述核苷酸残基为非修饰核苷酸残基 和/或修饰核苷酸残基。
11. 根据权利要求9或10所述的单链核酸分子，其中所述连接子区域（Lx)和/或所述 连接子区域（Ly)由下列（1)-(7)的任一种残基构成： (1) 非修饰核苷酸残基 (2) 修饰核苷酸残基 (3) 非修饰核苷酸残基和修饰核苷酸残基 (4) 非核苷酸残基 (5) 非核苷酸残基和非修饰核苷酸残基 (6) 非核苷酸残基和修饰核苷酸残基 (7) 非核苷酸残基、非修饰核苷酸残基和修饰核苷酸残基。
12. 根据权利要求1至11任一项所述的单链核酸分子，其中所述基因表达抑制为通过 RNA干扰的表达抑制。
13. 根据权利要求1至12任一项所述的单链核酸分子，其中所述单链核酸分子的碱基 序列为SEQIDN0:5、6、ll、12、13、14、15 或 16 的碱基序列。
14. 一种靶基因的表达抑制用组合物，其包括根据权利要求1至13任一项所述的单链 核酸分子。
15. -种药学组合物，其包括根据权利要求1至13任一项所述的单链核酸分子。
16. 根据权利要求15所述的药学组合物，其用于治疗炎症。
17. -种抑制靶基因的表达的方法，其包括使用根据权利要求1至13任一项所述的单 链核酸分子。
18. 根据权利要求17所述的方法，其包括将所述单链核酸分子投与至细胞、组织或器 官的步骤。
19. 根据权利要求18所述的方法，其中将所述单链核酸分子在体内或体外投与。
20. 根据权利要求17至19任一项所述的方法，其中所述基因表达抑制为通过RNA干扰 的表达抑制。
21. -种诱导RNA干扰来抑制靶基因的表达的方法，其包括使用根据权利要求1至13 任一项所述的单链核酸分子。
22. -种疾病的治疗方法，其包括将根据权利要求1至13任一项所述的单链核酸分子 投与至患者的步骤，其中所述单链核酸分子具有抑制引起所述疾病的基因的表达的序列作 为表达抑制序列。
23. 根据权利要求1至13任一项所述的单链核酸分子的用途，其用于靶基因的表达抑 制。
24. 根据权利要求1至13任一项所述的单链核酸分子的用途，其用于诱导RNA干扰。
25. -种核酸分子，其用于治疗疾病，其中所述核酸分子为根据权利要求1至13任一项 所述的单链核酸分子，和所述单链核酸分子具有抑制引起所述疾病的基因的表达的序列作 为表达抑制序列。
【文档编号】C12N15/09GK104379744SQ201380028696
【公开日】2015年2月25日 申请日期:2013年5月25日 优先权日:2012年5月26日
【发明者】大木忠明, 青木绘里子, 江村智佐登, 滨崎智洋 申请人:株式会社博纳克