组合的γ9δ2T细胞受体链交换的制作方法

组合的γ9δ2T 细胞受体链交换的制作方法
【专利摘要】本发明提供鉴定介导抗肿瘤响应的γ9δ2T-细胞受体(γ9δ2TCR)的方法。令人惊讶的是，现在发现γ9-T-细胞受体链和δ2-T-细胞受体链(δ2TCR链)的CDR3区很重要。基于这些发现，组合的γδTCR-链交换(CTE)被提议作为用于鉴定介导抗肿瘤响应的γ9δ2TCR的有效方法。使用本发明的方法，鉴定出介导抗肿瘤响应的各个γ9TCR和δ2TCR链的特定序列。因此，本发明进一步提供用于可以例如在癌症诊断或治疗中使用的特定γ9δ2TCR或其片段。本发明进一步提供可用于表达根据本发明的γ9δ2TCR的核酸序列、基因构建体和逆转录病毒载体。
【专利说明】组合的γ9δ2Τ细胞受体链交换

【技术领域】
[0001] 本发明涉及医学领域。其涉及用于癌症治疗的免疫学和细胞疗法。本发明还涉及 用于T细胞受体、特别是可介导抗肿瘤响应的T细胞受体的识别方法。本发明还涉及在癌 症治疗中介导抗肿瘤响应的特定T细胞受体及其在癌症治疗中的用途。

【背景技术】
[0002] 到目前为止，异源干细胞移植（allo-SCT)是用于罹患癌症的患者的唯一公认和 被证明疗效的细胞疗法。这由如下观察所证实，即在具有"弱风险"白血病的患者中长期缓 解可特别采用allo-SCT来实现。然而，治愈以重度毒性的代价进行，导致治疗的患者大约 30%的总死亡率。这阻碍了广泛的临床实施，因为特别是具有低风险癌症的患者可能具有 良好的整体存活率，不能证明这种攻击性疗法（aggressive therapies)的适当性。因此， 最终的目标仍然是非攻击性移植方法的发展。这意味着产生配备有分子特征的细胞产品， 该分子特征允许选择性靶向癌细胞，同时保留健康组织。这将允许对具有医疗需求的大量 患者的治愈性治疗，不论年龄如何。
[0003] 为了设计移植物（可以是异源的或自体的）以促进例如肿瘤反应性α β T-细胞 的快速生成，已经提出了用编码肿瘤特异性α β T-细胞受体（TCR)或嵌合抗原受体的基因 来重编程α β T-细胞。数种这类受体已经用于在I期临床试验中重定向α β T-细胞。然 而，用规定的α β TCR重编程α β T-细胞基本上因它们对HLA类型的限制而受阻，从而限 制了可以采用一种α β-TCR进行治疗的患者数量。此外，引入的a ^TCR链与内源a ^TCR 链的配对可能诱发危及生命的自体反应。
[0004] 已经提出了使用Y 9 δ 2Τ-细胞的能力以高亲和性TCR介导选择性抗肿瘤反应来 介导抗肿瘤反应，而忽略健康环境（Fisch等人，1990, Science250,1269-1273)。分离的 Y 9 δ 2T-细胞可有效地杀死血液学恶性肿瘤和实体瘤的肿瘤细胞（Kabelitz等人，2007， Cancer Res. 67, 5-8)。然而，γ9 δ 2Τ-细胞的功能和增殖能力在癌症患者中常常严重受损， 使得自体Υ9 δ 2Τ-细胞对于免疫干预不那么有吸引力。
[0005] 已经提出了将规定的Υ9 δ 2TCR转移到α βΤ-细胞中，其介导α βΤ-细胞的肿 瘤特异性增殖并且针对肿瘤细胞系的广泛组重定向效应物CD8+和辅助物CD4+a β T-细胞 亚群，而在体外和体内的正常细胞可被忽略（Marcu-Malina等人，2011，Bloodll8,50-59)。 然而，关于Y9 δ 2TCR如何介导针对肿瘤细胞的不同活性以及需要用什么策略来分离对癌 细胞具有高活性的Y9S2TCR，可得的知识极少。
[0006] 因此，在本领域中存在提供对癌细胞具有高活性的Y 9 δ 2TCR的需求，并且在本 领域中存在提供用于选择这种高度活性的Y 9 δ 2TCR的改进方法的需求。


【发明内容】

[0007] 本发明提供鉴定介导抗肿瘤响应的Y 9 δ 2Τ-细胞受体（Y 9 δ 2TCR)的方法。如 所述，关于Υ9 δ 2TCR介导抗肿瘤反应的分子要求，可得的知识很少。尤其是用于介导抗 肿瘤响应的Υ9 δ 2TCR的互补决定区（CDR)内的变异性的贡献在现有技术中被视为是可 忽略的。令人惊奇的是，现在发现，Υ9Τ-细胞受体链（Y9TCR链）和δ2Τ-细胞受体链 (δ 2TCR链）的⑶R3区是重要的。基于这些发现，组合的γ δ TCR链交换（CTE)被提议 作为用于鉴定介导抗肿瘤响应的Υ9 δ 2TCR的有效方法。在本发明的方法中，γ 9Τ-细胞 受体链和δ 2Τ-细胞受体链的⑶R3区被随机修饰和组合，以形成新的γ 9 δ 2TCR。新设计 的Y 9 δ 2TCR被提供并且优选整合到随后在细胞表面表达γ 9 δ 2TCR的T-细胞中。相应 地，确定CTE工程化的T细胞的抗肿瘤响应。以这种方式，可以测试多种组合，并且可以对 每一种组合确定抗肿瘤响应。在确定抗肿瘤响应之后，可鉴定介导高度活性的抗肿瘤响应 的Υ9 δ 2Τ-细胞受体。使用本发明的方法，诸如在实施例中所述，已经鉴定了介导与参考 Y9S2TCR G115wt相比抗肿瘤响应增加的数种响应性γ9δ2ΤΟ?。因此，本发明进一步提 供可用于例如癌症诊断或治疗中的Υ9 δ 2TCR或其片段。本发明进一步提供可用于根据本 发明在细胞（优选T细胞）中表达γ9 δ 2TCR的核酸序列、基因构建体和逆转录病毒载体。

【专利附图】

【附图说明】
[0008] 图1 :由Y 9 δ 2TCR介导的抗肿瘤反应性。
[0009] 用示出的野生型Y9S2TCR或CTE工程化y9S2TCR以病毒方式转导外周血 T-细胞，并且在51Cr-释放测定（E:T3:1)中针对Daudi (A，C)来测试。特异性裂解表示为 在5小时之后在上清液中测量的倍率变化51Cr-释放。当与Y9-G115 wt/S2-G115wt工程 化T-细胞的反应相比较时计算倍率变化。（B，D)在IFN γ ELISA中在指示量的帕米膦酸盐 (pamidronate)的存在下或（E)不同的E:T比率下。（F)Daudi与用指示的γ9 δ 2TCR工程 化改造的T-细胞的细胞-细胞结合物（conjugate)的百分比通过流式细胞仪确定。数据 代表平均值土SD。*ρ〈0· 05, **ρ〈0· 01，***p〈0. 001 (根据单向 AN0VA)。
[0010] 图2:表达克隆6115的单丙氨酸突变3 2链的转导1'-细胞的^9 3 21'0?表达和 功能亲和力（functional avidity)。
[0011] 用示出的Y9和δ 2TCR链以病毒方式转导外周血T-细胞，并且（A)使用δ 2-链 特异性抗体通过流式细胞仪进行分析。示出的是与表达S 2-6115#的野生型对照相比在平 均荧光强度（MFI)中的倍率变化。（C)在针对肿瘤靶Daudi (E: TlO :1)的51Cr-释放测定中 测试转导子的裂解活性。特异性裂解表示为在5小时后在上清液中测量的倍率变化 51Cr-释 放。与未突变的野生型（S 2-G115wt)的反应性相比来计算倍率变化。箭头表示削弱受体表 达（虚线箭头）或功能亲和力（实线箭头）的S 2-G115中的突变。（B，D)指示出相关氨 基酸（箭头）的Y 9 δ 2TCR Gl 15的晶体结构。
[0012] 图3 :表达具有δ 2-CDR3长度突变的γ9 δ 2TCR G115的转导T-细胞的γ9 δ 2TCR 表达和功能亲和力。
[0013] (A)使用γ δ TCR-pan抗体通过流式细胞仪分析所示转导子的Y 9 δ 2TCR表达。示 出的是与表达S 2-6115#的野生型对照相比的在平均荧光强度（MFI)中的倍率变化。（B) 针对肿瘤靶Daudi (Ε :T1 :1)的δ 2-G115m转导T-细胞的IFN γ分泌在100 μ M帕米膦酸盐 的存在下在孵育24h后通过ELISA测量。示出的是当与表达wt δ 2-G115wt的转导子的反应 性相比时在IFN γ产生中的倍率变化。（C)如所指示的，在滴定测定中针对肿瘤靶Daudi，在 增加的帕米膦酸盐的量下，对表达S 2-6115_^412的转导子进行测试。IFNy的产生在24 小时之后通过ELISA测量。（D)产生的3 2-61150(在^^51'搜索中与MGT数据库中描述的 γ9 δ 2TCR相匹配。示出的是与类似δ⑶R3长度的δ 2-G115u^g比的引用次数（number of citation)。（E)具有δ 2-6115^4,6的转导子与表达相同δ CDR3长度的个别γ 9 δ 2TCR的 转导子并排比较。转导T-细胞针对肿瘤靶Daudi的（Ε :T1 :1)的IFNy分泌在IOOyMW 米膦酸盐的存在下于24小时之后通过ELISA测量。示出的是与表达wt δ 2-G115wt的转导 子反应性相比的IFNy产生上的倍率变化。数据代表平均值土SD。#p〈0. 01，p〈0. 001(根 据单向AN0VA)。（F) γ9 δ 2TCRG115的晶体结构；用于δ CDR3内丙氨酸延伸段（stretch) 的区域以白色显示，剩余S OTR3以绿色显示，δ链以蓝色显示，γ链以棕色显示。
[0014] 图4 :表达具有γ 9-CDR3长度突变的γ 9 δ 2TCR G115的转导T-细胞的功能亲和 力。
[0015] (A)用示出的γ9和S2TCR链以病毒方式转导外周血T-细胞。将转导子的裂 解活性与表达相同Y 9⑶R3长度的单独γ 9 δ 2TCR的T-细胞并排比较。特异性裂解表示 为在5小时后在上清液中测量的倍率变化51Cr-释放。数据代表平均值土SD。根据单向 ΑΝ〇νΑ#ρ〈0·01。（B)包括氨基酸 Y9-G115删、y9-G115q11q 和 y9-G115q111(红色箭头）以 灰色指示Y 9⑶R3的γ 9 δ 2TCR G115的晶体结构，δ⑶R3以绿色示出；δ链以蓝色示出； Y链以棕色示出。
[0016] 图5 :用CTE工程化γ 9 δ 2TCR体外转导的T-细胞的抗肿瘤反应性。
[0017] 用指示的Υ9 δ 2TCR以病毒方式转导外周血T细胞，并且针对指示的肿瘤细胞系 和健康对照组织来测试。（A)转导子在10 μ M帕米膦酸盐的存在下与靶细胞（Ε :T1 :1) - 起孵育。在24小时之后通过ELISA测量IFN γ产生。数据代表平均值土SD。根据单向 ANOVA，*p〈0. 05,、〈0. 01，***p〈0. 001。（B)转导子与以51Cr加载的指示的肿瘤靶一起孵育 (E :T10 :1)。通过在5小时之后在上清液中测量的51Cr-释放来确定特异性裂解百分比。（C) 在IFN γ ELISpot测定（Ε :T3 :1)中，在10 μ M帕米膦酸盐的存在下，针对原代AML母细胞 和健康祖细胞对CTE工程化的T-细胞进行测试。数据代表平均值土SD。根据单向AN0VA， #ρ〈0. 05，#ρ〈0. 01，^ρ〈0. 001。
[0018] 图6 :用CTE工程化γ 9 δ 2TCR体内转导的T-细胞的抗肿瘤反应性。
[0019] 在Rag2+γ C+双敲除小鼠（每组4-7只小鼠）中研究表达 CTE- γ 9 δ 2TCR γ 9-G115wt/ δ 2-cl5wt 或对照 γ 9 δ 2TCR U 9-G115wt/ δ 2-G115wt)的 T-细胞 的功能亲和性。在第〇天全身照射（2Gy)以后，小鼠在第1天采用0. 5xl06的Daudi-萤光 素酶或5xl06RPMI8226/S-萤光素酶细胞和IO 7CTE- γ 9 δ 2TCR转导的T-细胞来静脉注射。 此外，在IFA中的6xl05inL2和帕米膦酸盐（10mg/kg体重）在第1天并且每3周注射，直 至实验结束。（A，B)通过测量在两侧上小鼠的整个区域，通过生物发光成像（BLI)在体内评 估肿瘤长出（outgrowth)。数据代表测量的所有动物的平均值（Daudi :n = 4, RPMI8226/S : η = 7)。根据单向 AN0VA*p〈0. 05，**p〈0. 01(Daudi :第 42 天；RPMI8226/S :第 35 天）。（c)处 理的Daudi小鼠的总体存活率监测了 72天。*ρ〈0· 05广p〈0. 01 (通过Iogrank(Mantel-Cox) 检验）。
[0020] 图7.组合的γ δ TCR链交换（CTE)
[0021] 分离单独的Y 9 δ 2Τ-细胞克隆（A)并确定γ 9TCR和δ 2TCR链的序列（B)。通过 组合的Y S TCR链交换，设计新的γ 9 δ 2TCR，从而使γ 9-和δ 2⑶R3区被随机修饰（例 如，经由氨基酸替换、缺失和/或插入和/或缩短或延长CDR3长度）（C)并将其重新组合。 (D)随后新的Υ9 δ 2TCR被引入细胞中，优选诸如α β T-细胞的T-细胞（例如使用编码 Y 9TCR和δ 2TCR链的逆转录病毒载体，通过转导进行），并提供CTE工程化的T细胞（E)。 最后，CTE工程化的T-细胞在功能性测定中进行抗肿瘤细胞测试，来确定介导抗肿瘤响应 高的Y 9 δ 2TCR。由此，可选择例如具有最高抗肿瘤响应和/或最低副作用的γ 9 δ 2TCR。
[0022] 定义：
[0023] 在以下的描述和实施例中使用大量的术语。为了提供说明书和权利要求包括对这 些术语给出的范围的清楚和一致的理解，提供了以下定义。除非在本文中另有定义，否则使 用的所有技术和科学术语具有与本发明所属的本领域中普通技术人员所通常理解的相同 的含义。所有出版物的公开、专利申请、专利和其它参考文献以其整体并入本文以作参考。 [0024] 实施在本发明方法中使用的常规技术的方法对于本领域技术人员将是明显的。 在分子生物学、生物化学、计算化学、细胞培养、重组DNA、生物信息学、基因组学、测序和相 关领域中的常规技术的实践对于本领域技术人员是众所周知的并且例如在以下文献参考 中讨论：''Sambrook 等人，Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. , 1989 ；Ausubel 等 人,Current Protocols in Molecular Biology, John ffiley&Sons, New York, 1987and periodic updates ;以及系列 Methods in Enzymology, Academic Press, San Diego，'。
[0025] 在本文件和在其权利要求中，动词"包括"及其词形变化以其非限制性的意义使 用，意指包括该术语之后的条目，但是不排除没有具体提到的条目。其涵盖动词"基本上 由...组成"以及"由......组成"。
[0026] 如在本文中所使用的，单数形式"一个"、"一种"和"该"（"a"、"an"、"the"）包括 复数对象，除非上下文另有明确规定。例如，如上文中使用的，用于分离"一种"DNA分子的 方法包括分离多个分子（例如10个、100个、1000个、10000个、100000个、百万个或更多个 分子）。
[0027] 比对（"aligning"、"alignment"）：使用术语"比对"是指在存在短段或长段的相 同或相似的核苷酸的基础上，对两个或更多个核苷酸序列的比较。在本领域中已知数种用 于核苷酸序列比对的方法，如将在下面进一步解释的。使用术语"比对"也指在存在短段或 长段的相同或相似的氨基酸的基础上，对两个或更多个氨基酸序列的比较。在本领域中已 知数种用于氨基酸序列比对的方法，如将在下面进一步解释的。
[0028] "基因的表达"是指如下过程，其中可操作地连接到合适调节区域（特别是启动 子）的DNA区域转录成RNA，所述RNA具有生物活性，即能够翻译成生物活性蛋白质或肽（或 活性肽片段），或者其本身是具有活性的（如转录后基因沉默或RNAi)。在某些实施方式中 的活性蛋白质是指组成型活性的蛋白质。编码序列优选为有义方向，并且编码所需的生物 活性蛋白质或肽、或者活性肽片段。
[0029] 如在本文中使用的，术语"可操作地连接"是指在功能关系上多核苷酸元件的连 接。当一个核酸与另一个核酸序列处于功能关系时，核酸被"可操作地连接"。例如，如果启 动子或者说转录调节序列影响编码序列的转录，则其可操作地连接到编码序列。可操作地 连接是指所连接的DNA序列通常是连续的，并且在有必要接合两个或更多个蛋白质编码区 时,所连接的DNA序列是连续的并且位于阅读框内。
[0030] 术语"基因构建体"是指包含可操作地连接到合适的调节区域（例如启动子）的 区域（转录区域）的DNA序列，该区域在细胞中被转录成RNA分子（例如mRNA)。因此，基 因构建体可包含数个可操作地连接的序列，例如启动子、5'前导序列（包括例如参与翻译 起始的序列）、（蛋白质）编码区、剪接供体和受体位点、内含子和外显子序列以及3'非翻 译序列（也称为3'不翻译序列或3' UTR，包括例如转录终止序列位点）。
[0031] "同一性（identity)"是核苷酸序列或氨基酸序列同一性的量度。一般而言，t匕 对序列以便获得最高位匹配。"同一性"本身具有领域公认的含义并且可使用公开技术计 算。参见例如 "COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY, Lesk, A.M.，ed·，Oxford University Press1New York, 1988 ；BI0C0MPUTING:INFORMATICS AND GENOME PROJECTS, Smith, D. ff.,ed. ,Academic Press1New York, 1993 COMPUTER ANALYSIS OF SEQUENCE DATA, PART I, Griffin, A. M. , and Griffin, H. G. , eds. , Humana Press, New Jersey, 1994 ；SEQUENCE ANALYSIS IN MOLECULAR BIOLOGY，von Heinje，G. ,Academic Press，1987 ;以及 SEQUENCE ANALYSIS PRIMER ；Gribskov, M. and Devereuxj J. , eds. , M Stockton PressjNew York，1991)。尽管存在多种测量两个多核苷酸或多肽序列之间同一性的方法，但是 术语"同一性"为技术人员众所周知（Carillo, H.，and Lipton, D.，SIAM J. Applied Math(1988)48:1073)。通常确定两个序列之间同一性或相似性所采用的方法包括但不 限于在⑶IDE TO HUGE COMPUTERS, Martin J. Bishop, ed·，Academic Press，San Diego， 1994 和 Cari I lo，H·，and Lipton，D. ,SIAM J.Applied Math (1988) 48:1073 中公开的方 法。在计算机程序中编入确定同一性和相似性的方法。确定两个序列之间同一性和相似 性的优选计算机程序方法包括但不限于GCS程序包（Devereux，J.，等人，Nucleic Acids Research (1984) 12 (I) :387)，BLASTP，BLASTN，FASTA (Atschul，S.F.等人，J.Molec，Biol. (1990)215 ：403)〇
[0032] 作为说明，多核苷酸具有与编码某一序列的多肽的参考核苷酸序列具有至少例如 95% "同一'丨生"的核苷酸序列，意指的是多核苷酸的核苷酸序列与参考序列相同，不同在于， 多核苷酸序列相对于参考多肽序列的每100个核苷酸可以包括至多五个点突变。因此，核 苷酸序列与参考核苷酸序列的同一性百分比是基于参考核苷酸序列的全长进行计算的。换 句话说，为了获得与参考核苷酸序列具有至少95%相同的核苷酸序列的多核苷酸，参考序 列中至多5%的核苷酸可以缺失和/或被另一核苷酸替换，和/或多个核苷酸至多参考序列 中总核苷酸的至多5%可以插入到参考序列中。参考序列的这些突变可以存在于参考核苷 酸序列的5'或3'末端位置处，或在那些末端位置之间的任何位置处，单独穿插在参考序列 中的核苷酸当中或以一个或多个连续组穿插于参考序列中。
[0033] 类似地，多肽具有与SEQ ID NO: 1或2的参考氨基酸序列具有至少例如95% "同 一性"的氨基酸序列，意指的是多肽的氨基酸序列与参考序列相同，不同在于，多肽序列相 对于SEQ ID NO: 1或2的参考氨基酸每100个氨基酸可以包括至多五个氨基酸改变。因此， 氨基酸序列与参考氨基酸序列的同一性百分比是基于参考氨基酸序列的全长进行计算的。 换句话说，为了获得与参考氨基酸序列具有至少95%相同的氨基酸序列的多肽，参考序列 中至多5%的氨基酸残基可以缺失或被另一氨基酸替换，或多个氨基酸至多参考序列中总 氨基酸残基的至多5%可以插入到参考序列中。参考序列的这些改变可以存在于参考氨基 酸序列的氨基端或羧基端位置处，或在那些末端位置之间的任何位置处，单独穿插在参考 序列中的残基当中或以一个或多个连续组穿插于参考序列中。
[0034] 根据本发明的"核酸"或"核酸序列"可包括嘧啶和嘌呤碱基（优选分别为胞 嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶，以及腺嘌呤和鸟嘌呤）的任何聚合物或寡聚物（参见Albert L. Lehninger, Principles of Biochemistry, at793_800 (Worth Pub. 1982)，其整体地并入 本文以作参考用于所有目的）。本发明考虑任何脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸或肽核酸成分 以及其任何化学变体，例如这些碱基的甲基化、羟甲基化或糖基化形式等等。聚合物或寡聚 物在组成上可以是异质的或同质的，并且可分离自天然出现的来源或者可以人工合成或以 合成方式产生。此外，核酸可以是DNA或RNA或其混合物，并且可以以单链或双链形式长期 或过渡地存在，包括同源双链、异源双链和杂合态。
[0035] 如在本文中所使用的，术语"启动子"是指如下的关于基因转录起始位点的转录方 向位于上游的核酸序列，其作用为控制一个或多个基因的转录，并且在结构上通过存在DNA 依赖性的RNA聚合酶的结合位点、转录起始位点和任何其它DNA序列而被识别，所述任何其 它DNA序列包括但不限于转录因子结合位点、阻遏和激活蛋白质结合位点，以及本领域技 术人员熟知的直接或间接作用于调节自启动子的转录量的任何其它核苷酸序列。任选地， 术语"启动子"在本文中还包括5'UTR区（5'非翻译区）（例如，启动子在本文中可以包括 基因的翻译起始密码子上游（5'）的一个或多个部分，因为这个区域在调节转录和/或翻译 中可能有作用）。"组成型"启动子是在大多数生理和发育条件下在大多数组织中具有活性 的启动子。"诱导型"启动子是生理上（例如通过某些化合物的外部施用）或发育上受调节 的启动子。"组织特异性"启动子仅仅在特定类型的组织或细胞中具有活性。"在特定的细 胞类型例如T细胞中有活性的启动子"是指启动子在这种细胞类型内驱动转录的一般能力。 其对启动子的时空活性没有任何暗示。
[0036] 术语"氨基酸序列"或"蛋白质"或"肽"是指由氨基酸链组成的分子，而没有提及 具体的作用模式、大小、三维结构或来源。因此，其"片段"或"部分"仍然可被称为"氨基酸 序列"或"蛋白质"或"肽"。"分离的氨基酸序列"用于指这样的氨基酸序列，其不再处于其 天然环境中，例如在体外或在重组细菌或人类宿主细胞中。
[0037] "工程化细胞"在本文中是指经工程化的细胞，例如，通过外源核酸序列的引入或 内源基因序列的特定变更。这样的细胞已被遗传修饰，例如通过在内源基因中引入例如一 个或多个突变、插入和/或缺失，和/或在基因组中插入基因构建体。工程化细胞可指孤 立的或者培养中的细胞。工程化细胞可以是"转导细胞"，其中细胞已经用例如修饰病毒感 染，例如也可使用逆转录病毒，诸如在实施例中描述的，但也可以考虑其它合适的病毒诸如 慢病毒。也可以使用非病毒方法，诸如转染。因此，工程化细胞也可以是"稳定转染的细胞" 或"瞬时转染的细胞"。转染是指将DNA (或RNA)转移到细胞中以使得基因被表达的非病毒 方法。转染方法在本领域中是广泛已知的，诸如核酸的磷酸钙转染、PEG转染以及脂质体或 脂质复合物（Iipoplex)转染。这样的转染可以是瞬时的，但也可以是稳定的转染，其中可 以选择基因构建体整合到其基因组中的细胞。
[0038] "随机修饰"包括产生随机序列，并且还包括选择在自然界中出现的和可衍生自从 受试者（例如从人类）得到的Y 9 δ 2T细胞受体序列的δ 2-⑶R3编码区和/或γ 9-⑶R-3 编码区，如在实施例部分中所述的，其中从数据库中选择这种Y9-CDR3和S2-CDR3序列。 产生随机序列包括在起始Y 9-⑶R-3和δ 2-⑶R3序列中修饰一个或多个氨基酸，最多至其 中起始序列的所有氨基酸均可被修饰的程度。修饰氨基酸序列可以通过改变密码子的核苷 酸序列来进行，以使得由密码子编码的氨基酸改变。
[0039] 关于氨基酸序列的术语"与……对应"是指将一个序列与包含相应序列（例如氨 基酸残基50-70)的参考序列比对时，与实例氨基酸残基50-70对齐的氨基酸是该一个序列 的对应的氨基酸残基。其中对应的氨基酸与Y9-CDR3和S2-CDR3区域对齐的比对实例在 表3中示出。
[0040] 术语"可选择标记物"是对本领域普通技术人员熟悉的术语，并且在此用于描述任 何基因实体，当其被表达时可以用来选择含有可选择标记物的一个细胞或多个细胞。可选 择标记物基因产物赋予例如抗生素抗性或另一可选择的性状或营养需求。例如在本领域中 公知的可选择标记物包括绿色荧光蛋白（GFP)、eGFP、萤光素酶、⑶S等。

【具体实施方式】
[0041] 在第一方面，本发明涉及用于识别介导抗肿瘤响应的γ9 δ 2T-细胞受体的方法， 包括以下步骤：
[0042] a)提供T-细胞；
[0043] b)提供包含Y9-⑶R3编码区的编码Y9-T-细胞受体链的核酸序列和包含 δ 2-⑶R3编码区的编码δ 2-Τ-细胞受体链的核酸序列，其中γ 9-⑶R3编码区被随机修饰， 其中δ 2-⑶R3编码区被随机修饰；
[0044] c)将步骤b)的核酸序列引入到T-细胞中，以提供具有包含步骤b)的γ 9-Τ-细 胞受体链和步骤b)的δ 2-T-细胞受体链的γ 9 δ 2T-细胞受体的工程化T-细胞；
[0045] d)任选地，重复步骤b)和c);
[0046] e)确定在步骤c)和d)中提供的工程化T-细胞的抗肿瘤响应；
[0047] f)鉴定介导抗肿瘤响应的工程化T-细胞的Y 9 δ 2T-细胞受体。
[0048] T细胞或T淋巴细胞属于名为淋巴细胞的一组白血细胞，其在细胞介导的免疫中 起作用。T细胞源自骨髓中的造血干细胞，在胸腺中成熟（Τ在此衍生），并在外周淋巴组 织中获得它们的全部功能。在T-细胞发育期间，作为初始β或STCR基因重排的结果， ⑶4XD8 _T-细胞（对⑶4和⑶8共同受体均为阴性）致力于α β或Υ δ命运（fate)。经 历早期β链重排的细胞在细胞表面上表达由完整的β链和预TCRa链组成的预TCR结 构。这种细胞切换到⑶4+CD8+状态，重排TCR a链基因座，并在表面上表达成熟的a i3TCR。 在β基因重排之前成功完成Y基因重排的⑶4TD8T1细胞表达功能性γ δ TCR并保持 CD4XD8-(Claudio Tripodo等人Gamm delta T cell lymphomas Nature Reviews Clinical 0ncology6, 707-717 (December 2009)。T细胞受体与CD3蛋白复合物缔合。成熟的T细胞， 即表达α β TCR或γ δ TCR，在细胞表面上表达T细胞受体复合物。构成T细胞总群体约 1-5%的γ δΤ-细胞可以在进一步的亚群中划分。表达y9S2TCR的γ δΤ-细胞亚群构 成γ9δ2Τ-细胞。三个互补决定区（CDR1XDR2、⑶R3)都位于T细胞受体的细胞外域。这 些区域一般是最可变的结构域并且显著有助于TCR之间的多样性。⑶R区在T细胞发育期 间组成，其中所谓的可变-(V)、多样-(D)和连接-(J)基因片段随机地组合，以产生多种多 样的TCR。
[0049] α β T细胞可关于作为表达α β TCR的T淋巴细胞功能来定义，所述α β TCR识 别结合到MHC分子（主要组织相容性复合体）的肽，MHC分子在各细胞表面上表达。MHC呈 递从细胞蛋白质衍生的肽。例如当细胞感染了病毒，则MHC将呈递病毒肽，并且α β TCR和 MHC复合物之间的相互作用激活特定类型的T细胞，其引发免疫响应以消除感染细胞。因 此，αβΤ细胞在功能上可定义为能够识别结合到MHC分子的肽的细胞。可从外周血例如 经由CD3抗原来选择α βΤ细胞，如在以下和在实施例中描述的，因为大多数T细胞具有 α βΤΟ?。也可以采用a ^TCR特异性的抗体来选择α β T细胞，如下面所描述的。从这些 选择的细胞中，可以确定与αΤ-细胞受体链和βΤ-细胞受体链对应的核酸（或氨基酸） 序列。因此，α β T-细胞也可被定义为包含与a T-细胞受体链和/或β T-细胞受体链对 应的核酸（或氨基酸）序列的细胞。
[0050] Υ9 δ 2Τ-细胞可在功能上定义，在于它们由统称为磷酸抗原的一组非肽的磷酸 化类异戊二烯前体来特异性并且快速地激活。磷酸抗原几乎由所有的活细胞产生。在动 物和人类细胞（包括癌细胞）中发现的最常见磷酸抗原是异戊烯焦磷酸（IPP)和其异构 体二甲基烯丙基焦磷酸（DMAPP)。γ9 δ 2Τ-细胞的活化包括克隆扩增、细胞毒活性和细 胞因子的表达。Υ9δ2Τ-细胞也通过γ9δ2Τ-细胞受体的表达来定义。例如，可以使用 Y 9 δ 2Τ-细胞受体特异性的抗体来选择细胞，如下面所描述。从这些选择的细胞中，可以 确定与Y 9Τ-细胞受体链和/或δ 2Τ-细胞受体链对应的核酸（或氨基酸序列）序列。因 此，Y 9 δ 2Τ-细胞也可以被定义为包含与γ 9Τ-细胞受体链和/或δ 2Τ-细胞受体链对应 的核酸（或氨基酸）序列的细胞。
[0051] 本领域技术人员能够很好地选择和/或鉴定通过细胞表面上抗原或受体的表达 而特征化的细胞群体，如在整个本文中所描述的。应当理解的是，关于细胞表面上的表达， 诸如⑶3、⑶4、⑶8、α βτα?、γ δ TCR和γ9 δ 2TCR，这通常是在细胞群体中进行，其中当 与具有较低表达水平的细胞相比时，细胞的一部分具有高得多的抗原表达水平。因此，术语 阳性或阴性应被理解为是相对的，即与阴性的细胞相比，阳性细胞具有高得多的表达水平。 这个意义上的阴性细胞因此可以仍具有可检测的表达水平。细胞表面上的表达可以使用 荧光激活细胞分选术（FACS)来分析，并且许多特异性抗体是可商购的，例如诸如对于适用 于这种FACS分析的⑶3、⑶4、⑶8、α β TCR、γ δ TCR和Y 9 δ 2TCR的抗体，诸如在实施例 中所述并且如可用的。因此，γ9δ2Τ-细胞也可以定义并选择为在FACS中对y9S2TCR 为阳性的那些。适用于FACS或类似分离技术（例如结合至磁珠的抗体）的抗体被广泛使 用。选择允许筛选阴性和/或阳性细胞的条件，诸如抗体制造商所提供的。可以适于选择 Y 9 δ 2-T细胞或工程化γ 9 δ 2T细胞的抗体实例（诸如可从BD Pharmingen (BD，IBecton Drive，Franklin Lakes，NJ USA)得到）是 VY9-PE (克隆 Β3, #555733)、VS2-FITC (克隆 B6, #555738)、γ δ TCR-APC (克隆Bl，#555718)，或（诸如可从 Beckman Coulter 得到） 是？&11-￥6 1'〇?^(克隆11^51〇，#頂1418仍。同样，用于〇0-1'细胞选择的合适抗体， 诸如抗CD3抗体，可以（例如可从BD Pharmingen得到）是CD3-FITC(#345763)，或者，诸 如抗 ct PTCR 抗体（例如可从 Beckman Coulter 得到），是 pan-a PTCR-PE (#A39499)或 pan-α β TCR-PC5(#A39500)。
[0052] 因此，在本发明的方法中，提供第一种T-细胞。T-细胞可以是原代细胞，例如来 自受试者，诸如在实施例中描述的用于人受试者的。T-细胞可以是α β T细胞。T-细胞还 可以是细胞系，诸如SupT-1、Jurkat或Raji细胞或任何其它广泛可得的细胞系。作为原 代细胞或任何其它细胞系的任何细胞类型是足够的，只要该细胞群或其中的相当部分表达 T-细胞受体，即例如在FACS分选等（如上所述）中对α βτ-细胞受体为阳性，则这种细胞 群是可以考虑的。此外，当提供有根据本发明的Υ9 δ 2TCR受体时能形成功能性TCR复合 物并显示例如功能性细胞毒性响应和/或细胞因子产生时，可以考虑任何细胞或细胞群。 所提供的细胞也可以是祖细胞，优选为血液祖细胞，诸如胸腺细胞或造血干细胞，其在对之 提供适当刺激之后可发展成T细胞或工程化T细胞。因此可以理解的是，根据本发明提供 T细胞和对其提供Y 9 δ 2TCR受体也可包括提供祖细胞，对其提供γ 9 δ 2TCR受体，并刺激 这些祖细胞以使得它们发展成工程化T细胞。
[0053] 此外，提供了编码Y 9-Τ-细胞受体链的核酸序列和编码δ 2-Τ-细胞受体链的核 酸序列，其中Y 9-⑶R3编码区被随机修饰，其中δ 2-⑶R3编码区被随机修饰。优选地， Y 9-Τ-细胞受体链和δ 2-Τ-细胞受体链是人类来源的。γ 9和δ 2的人⑶R3区是明确 的。例如，氨基酸序列SEQ ID NO. 1的Y9-TCR链的人⑶R3区与氨基酸残基118-132对应， 其与根据国际免疫遗传学信息系统（IMGT)的氨基酸残基γ 105-γ 117对应。氨基酸序列 SEQ ID NO. 2的δ 2TCR链的人CDR3区与氨基酸残基112-127对应，其与根据MGT的氨基 酸残基δ 105-δ 117对应。根据国际免疫遗传学信息系统（MGT) (Lefranc MP. MGT，the international ImMunoGeneTics database. Nucleic Acids Res. 2003 ;31:307-310,其并入 本文以作参考），人CDR3区可以由锚定位置C104和Fl 18分隔，但不包括它们（也参见表 3)，其对于每个链称为γC104和γF118和δC104和δF118。锚定位置γC104与SEQID NO. 1中的Cl 17对应，并且γ Fl 18与SEQ ID NO. 1中的F133对应。锚定位置δ C104与氨 基酸序列SEQ ID NO. 2中的Clll对应，并且锚定位置δ Fl 18与氨基酸序列SEQ ID NO. 2 中的F128对应。MGT提供了例如不同物种的T细胞受体（包括人类T细胞受体）的序列、 基因组和结构的通用访问（common access)，并允许鉴定包括⑶R3区的γ 9T-细胞受体链 和δ 2T-细胞受体链，例如经由锚定位置。
[0054] 根据MGT，CDR3由（但不包括）锚定位置2nd-CYS104和J-PHE或J-TRP118分 隔。JUNCTION包括2nd-CYS104和J-PHE或J-TRP118,因此比CDR3长两个氨基酸。CDR3 编号从105到117,如果有必要，在环的顶部添加空位（gap)或额外位置。需要注意的是， J-PHE或J-TRP属于在位置118-121处的特征性J-REGION基序' F/W-G-X-G'，该CDR3由 相同的锚定位置（2nd-CYS104和J-PHE或J-TRP118)分隔，无论是何种受体类型（IG或 TR)，何种链型（对于IG为重链或轻链；对于TR为α链、β链、Y链或δ链）或何种物 种。对于 IMGT 编号说明，还参见 http://www. imgt. org/IMGTScientificChart/Numbering/ IMGTIGVLsuperfamily. html。该IMGT编号也在实施例中使用。
[0055] 因此，通过使用锚定位置，根据MGT标准，可以很容易地鉴定⑶R3区。例如，通过 使用可用的在线工具，如由IMGT提供的（例如IMGT/V-QUEST)，输入氨基酸序列（或核酸序 列），可以很容易地鉴定Y 9T-细胞受体链序列或δ 2T-细胞受体链序列以及确切的⑶R3 区。或者，可在MGT中找到已为公众可得的Υ9Τ-细胞受体链序列或δ 2Τ-细胞受体链序 列，因此，可以容易地从其中鉴定⑶R3区。或者，使用作为参考序列的SEQ ID NO. 1和SEQ ID No. 2以及其中的锚定氨基酸残基位置，通过比对容易地鉴定其它γ 9-T-细胞和δ 2-T-细 胞受体链的CDR3区，诸如在表3中对于不同的CDR3区所示出的。因此，技术人员能容易地 从任何Y 9Τ-细胞受体链序列鉴定与SEQ ID NO. 1的⑶R3区对应的任何⑶R3区，此外，技 术人员能容易地从任何S 2T-细胞受体链序列鉴定与SEQ ID NO. 2的⑶R3区对应的任何 ⑶R3区。因此，技术人员知道他需要随机修饰来自任何γ 9-T-细胞和/或δ 2-T-细胞受 体链的哪个氨基酸序列。
[0056] 因此，修饰δ 2-Τ-细胞受体链核酸序列中的δ 2-⑶R3编码区可包括将SEQ ID NO. 4的核酸序列与目标δ 2-Τ-细胞受体链核酸序列进行比对，鉴定δ 2-Τ-细胞受体链 核酸序列中与SEQ ID NO. 4中的编码锚定位置的密码子对应的密码子，并随机地修饰目 标δ 2-T-细胞受体链核酸序列中鉴定出的锚定位置密码子之间的核酸序列。此外，修饰 Y 9-Τ-细胞受体链核酸序列中的γ 9-⑶R3编码区可包括将SEQ ID NO. 4的核酸序列与目 标Y9-T-细胞受体链核酸序列进行比对，鉴定Y9-T-细胞受体链核酸序列中与SEQ ID NO. 3中的编码锚定位置的密码子对应的密码子，并随机地修饰目标γ 9-T-细胞受体链核 酸序列中鉴定出的锚定位置密码子之间的核酸序列。CDR3编码区的核酸序列的随机修饰 为，使得由核酸序列编码的氨基酸序列被修饰，即至少一个氨基酸残基改变成另一个氨基 酸残基，或至少一个氨基酸残基插入或缺失。
[0057] 编码Y 9-T-细胞受体链和δ 2-T-细胞受体链的核酸序列可以被引入到T-细胞 中，以提供具有Y 9 δ 2Τ-细胞受体的工程化T-细胞，该γ 9 δ 2Τ-细胞受体包括γ 9-Τ-细 胞受体链和S 2-Τ-细胞受体链。通过表达γ 9-Τ-细胞受体链和δ 2-Τ-细胞受体链（其 中该⑶R3区已随机修饰），在细胞中表达特定的γ9 δ 2-Τ细胞受体。任选地，可以重复提 供⑶R3经随机修饰的Υ9-Τ-细胞受体链和δ2-Τ-细胞受体链以及随后引入到T细胞中的 步骤。例如，每次这样做时，使用经随机修饰的CDR3区的不同组合。也可以预想到，例如使 用随机修饰的CD3区的不同组合来重复这些步骤的步骤可以至少部分地同时进行。例如， 可提供多个编码Y 9-Τ-细胞受体链的核酸序列（其中γ 9-CDR3编码区经随机修饰）以及 编码δ2-Τ-细胞受体链的核酸序列（其中S2-CDR3编码区经随机修饰），并且可以将该多 个核酸序列引入T细胞中，从而提供多个工程化T细胞。
[0058] 鉴定所提供的表达Y 9 δ 2Τ-细胞受体或工程化Y 9 δ 2Τ-细胞受体的介导抗肿瘤 响应的工程化T-细胞的抗肿瘤响应。在提供核酸序列和引入到T-细胞中的步骤在分开 步骤中执行的情况下，确定抗肿瘤响应和鉴定工程化的Y 9 δ 2Τ-细胞受体的步骤可以组 合，因为在各个相应的工程化γ9δ2Τ-细胞中引入了哪种核酸序列是已知的。因此，确定 抗肿瘤响应可对于每个工程化Y 9 δ 2Τ-细胞分开地执行。可选地，例如当组合多种工程 化Y 9 δ 2Τ-细胞时，例如当重复例如如上所述的步骤同时执行，并且提供多个工程化T-细 胞时，可以分离工程化T-细胞，并且对于每个分离的工程化T-细胞确定抗肿瘤响应。工 程化的T细胞可以在不同的隔室（compartment)间分隔，并且可以在每个隔室中确定抗肿 瘤响应。在这种情况下，鉴定介导抗肿瘤响应的工程化T-细胞的步骤可以包括确定编码 Y9 δ 2TCR的各个⑶R3区的核酸序列的序列，例如通过测序。因此，任选地作为最终步骤， 鉴定介导抗肿瘤响应的工程化T-细胞涉及确定包含γ 9-⑶R3编码区的编码γ 9-Τ-细胞 受体链的核酸序列和包含S 2-⑶R3编码区的编码δ 2-Τ-细胞受体链的核酸序列。也可设 想到仅确定Y 9-⑶R3和δ 2-⑶R3编码区二者的核酸序列，即不需要确定γ 9-Τ-细胞受体 链和/或δ 2-Τ-细胞受体链的完整核酸序列。作为确定核酸序列的替代方式，也可确定 Y 9-CDR3和δ 2-CDR3区的氛基酸序列。
[0059] 优选地，编码Y 9-Τ-细胞受体链的核酸序列编码与SEQ ID NO. 1的氨基酸序列具 有至少60%序列同一性的氨基酸序列，并且其中编码δ 2-T-细胞受体链的核酸序列编码 与SEQ ID NO. 2的氨基酸序列具有至少60%序列同一性的氨基酸序列。编码γ 9-Τ-细胞 受体链的核酸序列优选包括编码与SEQ ID NO. 1的氨基酸序列具有至少70%、80%、90%、 95%或99%序列同一性的氨基酸序列的核酸序列。编码δ 2-T-细胞受体链的核酸序列优 选包括编码与SEQ ID NO. 2的氨基酸序列具有至少70%、80%、90%、95%或99%序列同一 性的氨基酸序列的核酸序列。技术人员能够对于功能来确定Y9 δ 2-T-细胞受体。优选地， 序列同一性的百分比基于SEQ ID NO. 1或SEQ ID NO. 2的整个长度进行计算。
[0060] Y 9-⑶R3和δ 2-⑶R3的⑶R3区的随机修饰可包括氨基酸残基的任意选择。这种 任意选择可通过在体外产生随机序列来完成，例如通过随机化学合成，诸如使用化学合成 由 Sloning Biotechnology 提供（Sloning BioTechnology GmbH-A Division of MorphoS ys，Zeppelinstrasse4, 82178Puchheim, Germany)。γ 9-CDR3 和 δ 2-CDR3 的 CDR3 区的随机 修饰也可包括从见于天然的CDR3区中的序列中任意选择。这种天然的CDR3氨基酸序列是 由自然随机生成的，即任意选择的。
[0061] 关于随机修饰，随机修饰的Y 9-⑶R3编码区可优选在与SEQ ID NO. 1的氨基酸 残基118-132对应的氨基酸序列处被修饰。关于随机修饰，随机修饰的γ 9-CDR3编码区 可优选在与SEQ ID NO. 1的氨基酸残基122-124对应的氨基酸序列处被修饰。如所述， Y 9-⑶R3编码区很容易鉴定，例如通过比对和/或通过由頂GT提供的信息，因此，与SEQ ID NO. 1的氨基酸残基118-132对应的来自Y9-⑶R3编码区的氨基酸残基同样容易鉴定。 任选地，SEQ ID NO. 1的氨基酸残基C117和F133可进一步被用于鉴定对应的氨基酸残基。 在诸如表3中所示出的比对中，可以容易地鉴定与SEQ ID NO. 1的氨基酸序列的氨基酸残 基118-132对应的来自γ 9-⑶R3编码区的氨基酸残基，由此也容易鉴定与SEQ ID NOl的 氨基酸残基122-124对应的氨基酸残基。因此，通过将目标氨基酸序列与参考氨基酸序列 (SEQ ID NO. 1)比对，并鉴定锚定氨基酸残基C117和F133,可以容易地鉴定对应的序列，从 而鉴定⑶R3区。接着，比对⑶R3区，并鉴定与SEQ ID NOl的118-132对应的氨基酸序列 的氨基酸残基。关于随机修饰，随机修饰的S 2-⑶R3编码区可在与SEQ ID NO. 2的氨基酸 残基115-122对应的氨基酸序列处被修饰。关于随机修饰，随机修饰的δ 2-CDR3编码区可 在与SEQ ID NO. 2的氨基酸残基112-127对应的氨基酸序列处被修饰。可以容易地鉴定 δ 2-⑶R3编码区，例如通过比对和/或通过由頂GT提供的信息，因此，与SEQ ID NO. 2的氨 基酸残基112-127对应的来自δ 2-⑶R3编码区的氨基酸残基同样容易鉴定。任选地，SEQ ID NO. 2的氨基酸残基Clll和F128可进一步用于鉴定相应的氨基酸残基。在诸如表3中 所示出的比对中，可以容易地鉴定与SEQ ID NO. 2的氨基酸序列的氨基酸残基112-127对 应的来自S2CDR3编码区的氨基酸残基。因此，通过将目标氨基酸序列与参考氨基酸序列 (SEQ ID NO. 2)比对，并鉴定锚定氨基酸残基Clll和F128,可以容易地鉴定对应的序列，从 而鉴定⑶R3区。接着，比对⑶R3区，并可鉴定与SEQ ID NO. 2的112-127对应的氨基酸序 列的氨基酸残基，由此还鉴定与氨基酸残基115-122对应的氨基酸序列。
[0062] 在一个实施方式中，随机修饰与SEQ ID N02的氨基酸残基115-122对应的氨基酸 序列包括长度上的修饰。
[0063] 在一个实施方式中，随机修饰与SEQ ID N02的氨基酸残基112-127对应的氨基酸 序列包括长度上的修饰。
[0064] 在一个实施方式中，随机修饰氨基酸序列包括引入氨基酸替换、缺失和/或插入。
[0065] 关于随机修饰，这可包括诸如氨基酸替换、缺失和/或插入的任何修饰。因此，随 机修饰可包括在序列和/或长度上的修饰。⑶R3区可因此在范围从1、2、3、4、5、6、7、8、9、 10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22个氨基酸残基的长度上变化。优选地，根据 IGMT注解，δ 2-⑶R3编码区可在位置δ L109和δ T113之间在范围为5-7个氨基酸的长度 上变化。因此，优选地，与SEQ ID NO. 2的氨基酸序列112-127对应的δ 2-⑶R3编码区在 SEQ ID NO. 2的L116和Τ123之间随机修饰，以使其在该区域中包含5-7个氨基酸。因此， 整个δ 2-CDR3编码区优选在范围为15至17个氨基酸残基的长度上变化。氨基酸替换可 包括任意替换，例如保守替换或非保守替换，在保守替换中，来自一组的一个氨基酸改变成 该组的另一个氨基酸残基，例如，一种脂肪族氨基酸残基交换为另一种脂肪族氨基酸残基， 在非保守替换中，来自一组的一个氨基酸改变成不同组的另一个氨基酸残基，例如一种脂 肪族氨基酸残基交换为碱性氨基酸残基。
[0066] 关于提供核酸，可以理解的是，提供核酸以使得当将其引入细胞中时，核酸可以表 达，从而使其所编码的氨基酸序列在细胞表面上表达。优选地，这通过将一个核酸或多个核 酸整合到细胞基因组中进行。优选地，编码Y 9-Τ-细胞受体链的核酸序列在基因构建体中 提供，并且编码S 2-Τ-细胞受体链的核酸序列在基因构建体中提供。基因构建体可以在分 开的载体上提供。基因构建体也可在单个载体上提供。编码Y 9-Τ-细胞受体链的核酸序 列和编码δ 2-Τ-细胞受体链的核酸序列也可在单个基因构建体中提供。例如，单个基因构 建体可表达包含内部核糖体进入位点的单个mRNA，例如在实施例中所述的，以使得每个受 体链可以从同一 mRNA转录。
[0067] 基因构建体和/或载体也可以包括可选择标记物。可选择标记物可以定义为任何 核酸序列和/或氨基酸序列，其允许提供有该物质的细胞被选择。例如，可选择标记物可以 是新霉素或嘌呤霉素抗性基因，例如实施例中所述的。然后可通过在新霉素或嘌呤霉素的 存在下执行孵育来选择已转移基因构建体和/或载体的细胞。其它的可选择标记物可以例 如是绿色、红色和黄色荧光蛋白中的任一种。然后可通过使用FACS来执行选择。它不要求 有可选择标记物，因为细胞在表达Y 9 δ 2T-细胞受体时可基于其自身上的该表达来进行 选择，例如通过使用如上所述的针对其的抗体进行选择。可以提供的是，宿主细胞不表达实 质量的Y 9 δ 2Τ-细胞受体以允许选择工程化γ 9 δ 2Τ-细胞，即与工程化γ 9 δ 2-Τ-细胞 受体相比，内源性Y 9 δ 2-Τ-细胞受体的表达必须低得多。
[0068] 优选地，编码Y 9-Τ-细胞受体链的核酸序列在逆转录病毒载体中提供，编码 S 2-Τ-细胞受体链的核酸序列在逆转录病毒载体中提供，并且将核酸序列引入T-细胞中 的步骤包括对T-细胞的逆转录病毒载体转导。转导可同时进行或在后续步骤中进行。或 者，编码Y 9-Τ-细胞受体链的核酸序列和编码δ 2-Τ-细胞受体链的核酸序列在单个逆转 录病毒载体中提供，并且将核酸序列引入T-细胞中的步骤包括对T-细胞的逆转录病毒载 体转导。例如在实施例中描述的，逆转录病毒载体对于将核酸序列转移到T-细胞中是高度 有效的，从而可提供工程化的T-细胞。许多逆转录病毒和慢病毒载体是已知的或诸如实施 例中描述的。逆转录病毒载体具有RNA基因组，当进入细胞时，其逆转录成DNA，随后整合到 宿主基因组中。整合是有利的，因为它允许转导细胞的增殖，同时保持包含基因构建体的病 毒载体基因组。
[0069] 在一个实施方式中，确定抗肿瘤反应性的步骤包括将细胞与肿瘤细胞接触。肿瘤 细胞可以是任何类型的肿瘤细胞。例如，来自患者的原代肿瘤细胞。肿瘤细胞可以是来自 细胞系的肿瘤细胞，诸如在名为 Daudi、RPMI8226/S、0PM2、LME1、K562、Saos2、MZ1851RC、 SCC9、Fadu、MDA-MB231、MCF7、BT549、SW480的实例中列出的细胞系，其在本领域中是熟知 的。肿瘤细胞系可容易地从美国典型培养物保藏中心（ATCC, Manassas, Virginia)等获得。 确定抗肿瘤活性的步骤可包括任何其中可确定抗肿瘤效果的测定，诸如具有对肿瘤细胞分 裂速率的效果，即关于肿瘤细胞分裂、细胞死亡、结合到肿瘤细胞等的速度。
[0070] 确定抗肿瘤响应包括将工程化的T细胞与肿瘤细胞接触，并测量其裂解肿瘤细 胞和/或诱导IFN-Y产生的能力。裂解肿瘤细胞的能力包括提供固定量的与工程化 γ9δ2Τ-细胞（S卩，表达Y9S2TCR的工程化T-细胞）接触的肿瘤细胞，在孵育期之后，对 存活的肿瘤细胞数进行计数。当将计数的存活细胞数与未与工程化Y9 δ 2T-细胞接触的 对照比较，且数量更低时，这种工程化γ9δ2Τ-细胞可被认为具有抗肿瘤响应。除了计数 存活细胞，人们也可以执行与在实施例中描述的相类似的 51铬-释放测定。51铬-释放的 量是已裂解的细胞数量的度量。
[0071] 类似地，也可例如通过抗体染色、ELISA和/或对表达的mRNA的定量PCR来确 定IFN-Y产生。用于确定IFN-Y的测定法可广泛商购，如在实施例中描述的。使工程化 γ9 δ 2T-细胞与肿瘤细胞接触。接触可以是在存在磷酸抗原的情况下，如帕米膦酸盐。因 此，当与细胞不接触工程化Υ9 δ 2Τ-细胞的情形相比，产生的IFN-Y量更高时，这种工程 化Y 9 δ 2Τ-细胞可被视为具有抗肿瘤响应。除了与对照（即不接触工程化γ 9 δ 2Τ-细胞 的细胞）相比较之外，人们也可以与参考值比较。在任何情况下，可以考虑任何其中可确定 对肿瘤细胞的效果的测定，涉及将Υ9 δ 2Τ-细胞与肿瘤细胞接触。只要有抗肿瘤效果，可 以确定例如诱导细胞死亡、细胞生存力、结合到肿瘤细胞、和/或IFN-Y产生。
[0072] 此外，关于上述的方法，可以在转移编码工程化Υ9 δ 2Τ-细胞受体（即具有随机 修饰的CDR3区）的核酸之前或之后扩增T细胞。优选地，扩增在转移之后进行，从而使得相 对较少的核酸需要转移。T细胞的扩增可以通过在IL-2的存在下以α-⑶3/⑶28Dynabead 进行刺激而执行。也可使用诸如在实施例中描述的快速扩增方案。对于可以例如经由诸 如如上所述的可选择标记物来选择的包含工程化Y 9 δ 2T-细胞受体的扩增细胞，其可进 一步例如使用如在实施例中描述的MACS分离系统来筛选CD4抗原和CD8抗原的存在。工 程化T细胞可随后进一步使用如REP方案（如Riddel and Greenberg, 1990J Immunol Methods. 128(2) :189-201所述的，其并入本文以作参考）或使用与之相似的其它扩增方法 进行扩增。简言之，扩增方法涉及使用针对诸如TCR、CD3和CD28和/或饲养细胞和/或刺 激细胞因子的T细胞活化分子的抗体。
[0073] 在另一个实施方式中，提供如下的Y9 δ 2T-细胞受体或其片段，其包括包含 Y9-CDR3区的Υ9-Τ-细胞受体链和包含S2-CDR3区的δ2-Τ-细胞受体链，其中与SEQ ID NO. 1的氨基酸残基122-124对应的γ 9-CDR3区的氨基酸序列被修饰，其中与SEQ ID NO. 2 的氨基酸残基115-122对应的δ 2-⑶R3区的氨基酸序列被修饰，其中在γ9 δ 2T-细胞受 体或其片段内的氨基酸修饰的组合在表1中列出。替换可包括例如表1中所列出的组合。各 个Y9-CDR3和δ 2-CDR3区的氨基酸序列被选自如下氨基酸序列组合的氨基酸序列替换： AQQU9)和 ALKRTD(S2) ;AQQU9)和 LLGY(S2) ;IQU9)和 ALKRTD(S2);以及 IQU9) 和TLGMGGEY( δ 2)。使用根据本发明的方法（如上面所述的以及如在实施例中所述的）来 鉴定包含⑶R3区的这些特定组合的这些Y 9 δ 2T-细胞受体或其片段。
[0074] 可以优选组合的Y 9-⑶R3和δ 2-⑶R3区的氨基酸序列的组合在下面表1中列 出，因为它们示出抗肿瘤效果。
[0075] 表I. Y9-CDR3和δ 2-CDR3区的氨基酸序列的组合。列出了与对应于SEQ ID NO. 1 的编号122-124的γ 9-⑶R3区中的氨基酸残基对应的区域（其经历替换，即已被修饰），并 且也列出了与对应于SEQ ID NO. 2的氨基酸残基115-122的δ 2-⑶R3区中的氨基酸残基对 应的区域（其经历替换）。Y 9-⑶R3和δ 2-⑶R3的不同组合从1-4编号。例如，数字2与 具有Υ9-Τ-细胞受体链和δ2Τ-细胞受体链的y9S2TCR对应，其中与SEQ ID NO. 1的编 号122-124对应的Y9-CDR3区已被AQQ替换，其中与SEQ ID NO. 2的氨基酸残基115-122 对应的S 2-CDR3区已被用ALKRTD替换。
[0076] 表I : Y 9-⑶R3和δ 2-⑶R3的修饰氨基酸序列的组合，其中列出的氨基酸序列替 换与SEQ ID NO. 1的122-124对应的γ 9-CDR3氨基酸残基，并且替换与SEQ ID NO. 2的 115-122对应的δ 2-CDR3氨基酸残基。

【权利要求】
1. 一种用于鉴定介导抗肿瘤响应的Y9S2T-细胞受体的方法，包括以下步骤： a) 提供T-细胞； b) 提供包括Y9-⑶R3编码区的编码Y9-T-细胞受体链的核酸序列和包括S2-⑶R3 编码区的编码S2-T-细胞受体链的核酸序列，其中所述Y9-CDR3编码区被随机修饰，其中 所述S 2-⑶R3编码区被随机修饰； c) 将步骤b)的核酸序列引入到T-细胞中，以提供具有包括步骤b)的Y9-T-细胞受 体链和步骤b)的S 2-T-细胞受体链的y 9 S 2T-细胞受体的工程化T-细胞； d) 任选地，重复步骤b)和c); e) 确定在步骤c)和d)中提供的工程化T-细胞的抗肿瘤响应； f) 鉴定介导抗肿瘤响应的工程化T-细胞的y 9 S 2T-细胞受体。
2. 根据权利要求1所述的方法，其中所述编码Y9-T-细胞受体链的核酸序列编码与 SEQ ID NO. 1的氨基酸序列具有至少60%序列同一性的氨基酸序列，和/或其中所述编码 S 2-T-细胞受体链的核酸序列编码与SEQ ID NO. 2的氨基酸序列具有至少60%序列同一 性的氨基酸序列。
3. 根据权利要求1-2中任一项所述的方法，其中所述被随机修饰的Y9-CDR3编码区在 与SEQ ID NO. 1的氨基酸残基122-124对应的氨基酸序列处被修饰。
4. 根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述被随机修饰的S2-CDR3编码区在 与SEQ ID NO. 2的氨基酸残基115-122对应的氨基酸序列处被修饰。
5. 根据权利要求4所述的方法，其中随机修饰与S2-CDR3编码区对应的氨基酸序列包 括长度上的修饰。
6. 根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中随机修饰氨基酸序列包括引入氨基酸 替换、缺失和/或插入。
7. 根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述编码Y9-T-细胞受体链的核酸序 列在表达载体中提供，且所述编码S 2-T-细胞受体链的核酸序列在表达载体中提供，或其 中所述编码Y9-T-细胞受体链的核酸序列和所述编码S2-T-细胞受体链的核酸序列在单 个表达载体中提供。
8. 根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述编码Y9-T-细胞受体链的核酸序 列在逆转录病毒载体中提供，且所述编码S 2-T-细胞受体链的核酸序列在逆转录病毒载 体中提供，或其中所述编码Y9-T-细胞受体链的核酸序列和所述编码S2-T-细胞受体链 的核酸序列在单个逆转录病毒载体中提供，且其中将核酸序列引入到T-细胞中的步骤包 括T-细胞的逆转录病毒载体转导。
9. 根据权利要求1-8中任何一项所述的方法，其中确定抗肿瘤响应的步骤包括将所述 工程化T-细胞与肿瘤细胞接触，和测量其裂解所述肿瘤细胞和/或诱导IFN- Y的能力。
10. -种Y 9 S 2T-细胞受体或其片段，包括具有Y 9-⑶R3区的y 9-T-细胞受体链和 具有S 2-CDR3区的S 2-T-细胞受体链，其中所述Y9-CDR3区的与SEQ ID NO. 1的氨基酸 残基122-124对应的氨基酸序列被修饰，其中所述S 2-⑶R3区的与SEQ ID NO. 2的氨基酸 残基115-122对应的氨基酸序列被修饰，其中在所述y9 S 2T-细胞受体或其片段内的氨基 酸修饰的组合如在表1中所列出。
11. 一种Y9S2T-细胞受体或其片段，包括： 包括Y 9-⑶R3区的y 9-T-细胞受体链和包括S 2-⑶R3区的S 2-T-细胞受体链，其 中所述Y 9-⑶R3区的与SEQ ID NO. 1的氨基酸序列的氨基酸残基122-124对应的氨基酸 序列是AQQ，其中所述S2-CDR3区的与SEQ ID NO. 2的氨基酸序列的氨基酸残基115-122 对应的氨基酸序列是ALKRTD。
12. 根据权利要求10-11中任一项所述的Y9S2T-细胞受体或其片段，其中所述 Y 9-⑶R3区的与SEQ ID NO. 1的氨基酸序列的氨基酸残基118-121对应的氨基酸序列是 ALWE，其中所述Y 9-⑶R3区的与SEQ ID NO. 1的氨基酸序列的氨基酸残基125-132对应的 氨基酸序列是ELGKKIKV，且其中所述S2-⑶R3区的与SEQ ID NO. 2的氨基酸序列的氨基酸 残基112-114对应的氨基酸序列是A⑶，且其中所述S 2-⑶R3区的与SEQ ID NO. 2的氨基 酸序列的氨基酸残基123-127对应的氨基酸序列是TDKLI。
13. 根据权利要求10-12中任一项所述的Y9S2T-细胞受体或其片段，其中所述 Y9-T-细胞受体链包括与SEQ ID NO. 1的氨基酸序列具有至少60%序列同一性的氨基酸 序列，且其中所述S2-T-细胞受体链包括与SEQ ID NO. 2的氨基酸序列具有至少60%序列 同一性的氨基酸序列。
14. 根据权利要求10-13中任一项所述的Y9S2T-细胞受体或其片段，其中所述 Y 9-T-细胞受体链包括包含SEQ ID NO. 1的氨基酸序列的氨基酸残基1-121和125-315的 氨基酸序列，且其中被修饰的氨基酸残基122-124如在权利要求10-13中任一项所限定，且 其中所述S 2-T-细胞受体链包括包含SEQ ID NO. 2的氨基酸序列的氨基酸残基1-114和 123-293的氨基酸序列，且其中被修饰的氨基酸残基115-122如在权利要求10-13中任一项 所限定。
15. -种结合物，包括连接到试剂的根据权利要求10-14所述的y 9 S 2T-细胞受体的 可溶性片段。
16. 根据权利要求14所述的结合物，其中所述试剂选自诊断剂、治疗剂、抗癌剂、化学 品、纳米颗粒、化学治疗剂或荧光染料。
17. -种分离的核酸序列，其编码如在权利要求10-14中任一项所限定的S2-T-细 胞受体链或其片段，其中与SEQ ID NO. 2的氨基酸序列的氨基酸残基115-122对应的 S 2-⑶R3区被氨基酸残基ALKRTD或LLGY替换。
18. -种分离的核酸序列，其编码如在权利要求10-14中任一项所限定的Y9-T-细 胞受体链或其片段，其中所述Y9-CDR3区的与SEQ ID NO. 1的氨基酸序列的氨基酸残基 122-124对应的氨基酸序列被氨基酸残基IQ替换。
19. 一种基因构建体，其包括根据权利要求17-18中任一项所述的分离的核酸序列。
20. -种逆转录病毒载体，其包括根据权利要求19所述的基因构建体。
21. -种分离的核酸序列，其编码如在权利要求10-14中任一项所限定的Y9S2T-细 胞受体或其片段。
22. -种基因构建体，其包括根据权利要求21所述的核酸序列。
23. -种逆转录病毒载体，其包括根据权利要求22所述的基因构建体。
24. -种细胞，其表达如在权利要求15中所限定的Y9S2T-细胞受体的可溶性片段。
25. -种T细胞，其包括根据权利要求10-14中任一项所述的y 9 S 2T-细胞受体。
26. 根据权利要求25所述的T细胞，其中所述T细胞包括根据权利要求17-18所述的 分离的核酸序列、根据权利要求19所述的基因构建体或根据权利要求20所述的逆转录病 毒载体。
27. 根据权利要求10-14中任一项所述的Y9S2T-细胞受体或其片段、根据权利要求 15-16中任一项所述的结合物、根据权利要求17-18和21中任一项所述的分离的核酸序列、 或根据权利要求19或22所述的基因构建体、或根据权利要求20或23所述的逆转录病毒 载体、或根据权利要求25-26中任一项所述的T细胞用作药物的用途。
28. 根据权利要求10-14中任一项所述的y 9 S 2T-细胞受体或其片段、根据权利要求 15-16中任一项所述的结合物、根据权利要求17-18和21中任一项所述的分离的核酸序列、 或根据权利要求19或22所述的基因构建体、或根据权利要求20或23所述的逆转录病毒 载体、或根据权利要求25-26中任一项所述的T细胞用作癌症治疗中的药物的用途。
【文档编号】C12N15/12GK104334741SQ201380028482
【公开日】2015年2月4日 申请日期:2013年3月28日 优先权日:2012年3月28日
【发明者】J·H·E·库巴尔, E-C·格林德尔 申请人:Umc乌得勒支控股有限公司