经修饰的自然杀伤t细胞、医药组合物和其用图

经修饰的自然杀伤t细胞、医药组合物和其用图
【专利摘要】本发明提供经修饰的自然杀伤T(NKT)细胞，包含所述经修饰的NKT细胞和至少一种医药学上可接受的载剂或赋形剂的医药组合物，和所述经修饰的NKT细胞的用途。本文还公开用于富集NKT细胞且产生所述经修饰的自然杀伤T细胞的方法。本发明提供的经修饰的NKT细胞以及医药组合物具有免疫抑制作用，可用于自体免疫疾病治疗领域。
【专利说明】
经修饰的自然杀伤T细胞、医药组合物和其用途
[0001] 相关申请案的交叉参考
[0002] 本申请要求2015年4月7日提交的美国申请案第62/144,066号的优先权，所述申请 案的全部公开内容W引用的方式并入本文中。
技术领域
[0003] 本发明设及生物医药领域，具体设及一种经修饰的自然杀伤T细胞、医药组合物和 其用途。
【背景技术】
[0004] 自然杀伤T(NKT)细胞和常规T细胞在胸腺中发育自共同前体。然而，不同的胸腺内 T细胞受体(TCR)相互作用会激活细胞特异性转录程序，所述程序指示每一细胞类型的独特 功能。NKT细胞通过与表达内源性糖脂结合的CDld分子及表达CD4/CD8双阳性胸腺细胞的 TCR相互作用来选择。相比之下，常规T细胞通过其TCR与胸腺上皮细胞的MHC分子及胜肤相 互作用来选择(杰夫苏布勒斯基(Jeff Subleski)等人NKT细胞在恶性病、自体免疫和过敏 病症中的分裂人格（The split personality of NKT cells in mali邑nancy,autoimmune and allergic disorders).免疫疗法（Immunotherapy) .2011年10月；3( 10): 1167-1184)。
[0005] 识别自身和非自身的确保机制崩溃为自体免疫疾病的标志特征。祀向自身组织的 持久免疫反应引起延长的炎症和后续的组织破坏。NKT细胞在患有自体免疫疾病的患者的 外周血液中的异常出现率和/或活性，说明NKT细胞设及疾病病理学。
[0006] 运些发现提高发展NKT细胞疗法用于自体免疫疾病的可能性和为临床应用产生更 多可胜任于治疗的NKT细胞的培养方法的可能性，因为仍存在对于有效治疗和/或预防自体 免疫疾病的未满足的需求。
[0007] 本发明提供具有独特表型W满足运些和其它需求的经修饰的NKT细胞。经修饰的 NKT细胞可用于自体疗法或非自体疗法。

【发明内容】

[000引在一个实施例中，本发明提供一种经修饰的自然杀伤T(NKT)细胞，其包含CD3+ CD56+CD8+NKT细胞表型；至少一种选自CD25、Foxp3、CTLA-4或LAP的调节性T (lYeg)细胞表面 标记物；W及选自PD-1的T辅助细胞表面标记物。
[0009] 在另一实施例中，本发明提供一种经修饰的NKT细胞，其包含CD3+CD56乂D8+NKT细 胞表型；至少一种选自CD25、Foxp3、CTLA-4或LAP的Treg细胞表面标记物;选自PD-1的T辅助 细胞表面标记物，其中所述NKT细胞表型实质上不含至少一种选自CDld-四聚体或TCR Va 24_Jal8的恒定型自然杀伤T(iNKT)细胞表面标记物，其中所述NKT细胞表型实质上不含至 少一种选自GITR、PI-16或IL-15RQ的细胞标记物。
[0010] 在另一实施例中，本发明提供一种经修饰的NKT细胞，其包含CD3+CD56乂D8+NKT细 胞表型；至少一种选自CD25、Foxp3、CTLA-4或LAP的Treg细胞表面标记物;选自PD-1的T辅助 细胞表面标记物，选自IL-15Ra的T细胞生长受体，其中所述NKT细胞表型实质上不含至少一 种选自CDld-四聚体或TCR Va24_Jal8的iNKT细胞表面标记物，其中所述NKT细胞表型实质 上不含至少一种选自GITR或PI-16的细胞标记物。
[0011] 在其它实施例中，本发明提供医药组合物，其包含一种或多种本文所述的经修饰 的NKT细胞和医药学上可接受的载剂或赋形剂。
[0012] 在其它实施例中，本发明提供本文所述的经修饰的NKT细胞在制备治疗自体免疫 疾病的药物中的用途。
[0013] -些实施例提供用于治疗自体免疫疾病的方法，其包含向有需要的个体投与有效 量的本文所述的经修饰的NKT细胞或医药组合物，从而治疗所述自体免疫疾病。
[0014] 本发明还提供用于产生本文所述的经修饰的NKT细胞的方法，其包含(a)将富集的 单核细胞部分与转化生长因子e(TGF-e)和细胞培养基一起培养，其中所述富集的细胞部分 中的单核细胞实质上不含W下细胞标记物中的至少一种:CD14、CD19或CD25(下文为富集的 CD14-CD19-CD25-细胞部分），W及(b)使来自步骤(a)的经培养的CD14-CD19-CD25-细胞部分 与T细胞生长因子接触。
[0015] 在另一实施例中，用于产生本发明的经修饰的NKT细胞的方法包含W下步骤：（a) 将富集的单核细胞部分与转化生长因子e(TGF-e)和细胞培养基一起培养，其中所述富集的 细胞部分中的单核细胞实质上不含W下表面标记物中的至少一种:〔04^014八016八019或 CD25(下文为富集的CDCCDirCDl扩CD19-CD25-细胞部分），W及(b)使来自步骤(a)的经培养 的CD4-CD14-CD1扩CD19-CD25-细胞部分与T细胞生长因子接触。
[0016] 本文所述的富集和/或培养方法从固定量的样品（例如10ml肝素化外周血液)产生 具有较高免疫抑制活性的更多数目的经修饰的NKT细胞。
[0017] 用于此专利的术语"本发明（invention)"、"本发明（the invention)"、"本发明 (this invention)"和"本发明（the present invention)"意欲广泛地指此专利和随附专 利权利要求书的所有主题。含有运些术语的陈述应理解为不限制本文所述的主题或不限制 随附专利权利要求书的涵义或范围。此专利涵盖的本发明的实施例由随附权利要求书而非 此
【发明内容】
限定。此
【发明内容】
为本发明的各种方面的高阶综述且引入一些进一步描述于W 下【具体实施方式】部分中的概念。本
【发明内容】
并不意欲识别所要求的主题的关键特征或基本 特征，也并非意图单独用于确定所要求的主题的范围。主题应参照整个说明书的恰当的部 分、任一或所有图式和各权利要求来理解。
【附图说明】
[0018] 所述专利或专利申请案含有至少一个彩制图式。具有彩色图式的此专利或专利申 请案的拷贝将在请求和支付必需费用之后由专利局提供。
[0019] 下文将参考W下图式详细描述本发明的说明性实施例：
[0020] 图1A示意性地示出单核细胞富集的两个实施例且图1B和图1C示意性地示出用于 产生本发明的经修饰的MT细胞的培养方法的两个实施例。
[0021] 图2A-2F为巧光激活细胞分选(FACS)图像，其示出天然NKT细胞上CD4、CD14、CD16、 CD19和CD25细胞表面标记物的表达（图2A-2B)，富集的CDI4-CDI9-CD25-细胞部分（图2C和图 2D)W及富集的CD4-CD14-CD16-CD19-CD25-细胞部分（图沈和图2F)。
[0022] 图3A-3M为直方图，其示出富集的CD14-CD19-CD25细胞部分的化邱3(图3A)、CD25 (图3B)、PD-1 (图3C)、GITR(图3D)、PI-16(图3E)、CDld四聚体（图3F)、TCR Va24_Jal8(图 3G)、CTLA-4(图3H)、LAP(图3I)、IL-15Ra(图3J)、CD14和CD19(图3K)、CD4(图：3L)W及CD3(图 3M)的表达。
[0023] 图4A-4L为直方图，其示出富集的CDrCDHTDl扩CD19-CD25-细胞部分的化邱3(图 4A)、CD25(图4B)、PD-1 (图4C)、GITR(图4D)、PI-16(图4E)、CDld四聚体（图4F)、TCR Va24_Ja 18(图4G)、CTLA-4(图4H)、LAP(图41)、化-15Ra(图41)、〔04、〔014、〔016和〔019(图41〇^及 CD3(图化）的表达。
[0024] 图5A-5M为直方图，其示出实例2中的经修饰的NKT细胞的CD25(图5A)、PD-1(图 5B)、G口R(图5C)、PI-16(图加）、CDld四聚体（图祀）、TCR Va24_Jal8(图5F)、CTLA-4(图5G)、 LAP(图甜）、IL-15Ra(图 51)、化邱3(图 5J)、CD14 和 CD19(图 5K)、CD4(图化）W 及CD3(图 5M)的 表达。
[002引图6A-6L为直方图，其示出实例3中的经修饰的NKT细胞的CD25(图6A)、PD-1(图 6B)、G口R(图6C)、PI-16(图抓）、CDld四聚体（图6E)、TCR Va24_Jal8(图6F)、CTLA-4(图6G)、 LAP(图細）、IL-15Ra(图61) Joxp3(图61)、〔04、〔014、〔01巧0〔019(图服）和〔03(图61^的表 达。
[0026] 图7A-7C为T淋己细胞的CFSE巧光的直方图，其示出实例2中的经修饰的NKT细胞 (培养自富集的CD14-CD19-CD25-细胞部分)对T淋己细胞增殖的抑制作用。图7A展示T淋己细 胞在无任何刺激下的体外增殖，图7B展示T淋己细胞应答细胞在抗CD3和抗CD28抗体刺激下 的体外增殖，且图7C展示经修饰的NKT细胞在抗CD3和抗CD28抗体刺激下对T淋己细胞应答 细胞增殖的抑制作用。。
[0027] 图8A-8C为T淋己细胞的CFSE巧光的直方图，其示出实例3中的经修饰的NKT细胞 (培养自富集的CD4-CD14-CD16-CD19-CD25-细胞部分)对T淋己细胞增殖的抑制作用。图8A展 示T淋己细胞在无任何刺激下的体外增殖，图8B展示T淋己细胞应答细胞在抗CD3和抗CD28 抗体刺激下的体外增殖，且图8C展示经修饰的NKT细胞在抗CD3和抗CD28抗体刺激下对T淋 己细胞应答细胞增殖的抑制作用。
【具体实施方式】
[0028] 如本文所用，冠词"一个(a)"和"一个(an)"是指一个或一个W上（即，至少一个)所 述冠词的语法对象。作为举例，"一个经修饰的NKT细胞"意指一个经修饰的NKT细胞或一个 W上经修饰的NKT细胞。
[0029] 如本文所用的"有效量"是指足W减少IL-10含量或自体免疫疾病的症状和征象 (其包括(但不限于)体重减轻、皮疹、腹痛、眼睛发痒、关节疼痛或肿胀)的经修饰的NKT细胞 或医药组合物的剂量。
[0030] 术语"个体"可指具有自体免疫疾病的脊椎动物或认为需要自体免疫疾病治疗或 需要增加 IL-10含量的脊椎动物。个体包括溫血动物，如哺乳动物、如灵长类动物且更优选 地为人类。非人类灵长类动物同样为个体。术语个体包括经驯养动物(如猫、狗等）、家畜（例 如牛、马、猪、绵羊、山羊等)和实验动物(例如小鼠、家兔、大鼠、沙鼠、天竺鼠等）。由此，在本 文中涵盖兽医用途和医用调配物。
[0031] NKT细胞表面上的细胞表面标记物（如CD25、Fo邱3、PD-1)的表达含量或表面密度 只要所述表达相对于阴性对照群体(表示为为阳性就为。在一个例示性实施例中， V'意指细胞表面标记物相对于同型对照可检测地存在于巧光激活细胞分选术或磁珠中； 或在定量或半定量RT-PCR中在背景之上可检测到。在另一例示性实施例中，意指细胞标 记物相对于同型对照不可检测地存在于巧光激活细胞分选术或磁珠中；或在定量或半定量 RT-PCR中在背景之上不可检测到。在一个实例中，表面标记物的V'表达意指表面标记物的 净平均巧光强度(MFI)大于或等于约0、约1、约1.5、约2、约2.5、约3、约3.5、约4、约4.5、或约 5。在另一实例中，表面标记物的表达意指表面标记物的净MFI小于或等于约5、约4.5、约 4、约 3.5、约 3、约 2.5、约 2、约 1.5、约 1、约 0.5、约 0。
[00创术语"T细胞"和"T淋己细胞'在整个此专利中可互换地使用。
[0033] 如本文所用的术语"实质上不含"包括细胞标记物的表达或细胞标记物的含量 通过所述领域中所用的常规分析方法不可检测到或最低限度地检测到。举例来说，熟练的 业内人±已知FACS/流式细胞仪W及其它分析方法。
[0034] 本文中的所有数字可理解为由"约"修饰。在一个实施例中，除非另外说明，否则当 提及可测量值，如量、时间的持续时间等时，术语"约"意欲涵盖偏离指定值±10%、优选地 ± 5 %、更优选地± 1 %、且甚至更优选地± 0.1 %的变化，照此变化适于治疗剂的剂量。如本 文所用，除非另外说明，否则当提及范围时，术语"约"意欲涵盖偏离指定值在所述范围的差 值中的± 10 %、优选地± 5 %、更优选地± 1 %、且甚至更优选地± 0.1 %的变化，照此变化适 于治疗剂的剂量。
[00巧]经修饰的NKT细胞
[0036] 天然存在的或常规NKT细胞具有CD3+CD56乂D8+表型。在一个例示性实施例中，天然 存在的或常规NKT 细胞具有 CD14-CD19-CD3 乂 D56+CD8+CD4-CD25 下oxp3TD-厂 CTLA-4-G 口R-PI- 16X01 d 四聚体-LAPTCR Va24_Ja 18-表型。
[0037] 在一个实施例中，本发明提供一种经修饰的NKT细胞，其包含CD3+CD56+CD8+NKT细 胞表型；至少一种选自CD25、Fo邱3XTLA-4或LAP的调节性T(lYeg)细胞表面标记物；W及T 辅助细胞表面标记物，如PD-1，如表1、图5A-图5M和图6A-图化中所示。不受任何具体理论束 缚，据相信，本发明的经修饰的NKT具有与化eg细胞和/或T辅助细胞的免疫抑制性质相似的 免疫抑制性质，如制造 IFN-丫。在另一实施例中，本发明提供一种经修饰的NKT细胞，其包含 CD3乂D56+CD8+NKT细胞，其中所述CD3+CD56乂D8+NKT细胞进一步包含至少一种选自CD25、 Fo邱3、PD-1、CTLA-4或LAP的Treg细胞表面标记物，和T辅助细胞表面标记物，如PD-1，如表1 中所示。
[003引在一个例示性实施例中，经修饰的NKT细胞包含CD14-CD19-CD3+CD4-CD16-CD56乂D8 +CD25卞oxp3+PD-rCTLA-4+G口R-pi-1 扩CDld四聚体-LAP+TCR Va24_Jal8-比-15Ra+表型。在另 一例示性实施例中，经修饰的NKT细胞包含〔014^019下03+〔04下016-〔056+〔08+〔025卞0邱3+ PD- rCTLA-4+G 口R-PI -1 扩CD 1 d 四聚体-LAP+TCR Va 24_Ja 18- IL-15Rcf 表型。
[0039] 表1.常规NKT细胞和经修饰的NKT细胞的表型
[0040]
[0041 ] a叉头框P3
[0042] b程序性死亡-1
[0043] ^田胞毒性T淋己细胞相关分子-4
[0044] d糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体
[00例 e肤抑制剂16
[0046] f潜伏相关肤
[0047] 巧细胞受体Va24 Jal8 [004引h白介素-15受体曰
[0049] 在一个实施例中，本发明提供经修饰的NKT细胞，其由富集的CD4-CD14-CD16-CD19- CD25-单核细胞部分产生，且包含CD3+CD56乂D8+NKT细胞表型；至少一种选自CD25、Fo邱3、 CTLA-4或LAP的beg细胞表面标记物；W及选自PD-1的T辅助细胞表面标记物，其中所述NKT 表型实质上不含至少一种选自CDld-四聚体或TCR Va24_Jal8的iNKT细胞表面标记物，其中 所述NKT表型实质上不含至少一种选自GITR、PI-16或IL-15Ra的细胞表面标记物。在另一实 施例中，经修饰的NKT细胞由富集的CD14-CD19-CD25-单核细胞部分产生，且包含CD3+CD56+ CD8+NKT细胞表型；至少一种选自CD25、Fo邱3、PD-1、CTLA-4或LAP的lYeg细胞表面标记物； 选自PD-1的T辅助细胞表面标记物；W及选自IL-15Ra的T细胞生长受体，其中所述NKT表型 实质上不含至少一种选自CDld-四聚体或TCR Va24_Jal8的iNKT细胞表面标记物，其中所述 NKT表型实质上不含至少一种选自GITR或PI-16的细胞表面受体。
[0050] 在一个实施例中，W下细胞标记物的净MFI大于或等于约0、约0.5、约1、约1.5、约 2、约2.5、约3、约3.5、约4、约4.5或约5:CD3、CD56、CD8、CD25、Fo邱3、PD-l、CTLA-4、LAP或Iレ l5Ra。在另一实施例中，W下细胞标记物的净MFI小于或等于约5、约4.5、约4、约3.5、约3、约 2.5、约2、约1.5、约1、约0.5、约0:〔014、〔019、〔04、〔016、6口3、口1-16、〔01(1四聚体、1'0?￥〇 24_Jal8或IL-15Ra。
[0051] 在一些实施例中，本发明的经修饰的NKT细胞实质上不含W下细胞表面标记物中 的至少一种：〔〇14、〔019、〔04、〔016、6口3、？1-16、〔01(1四聚体、1'0?￥〇24_护18或比-151?〇。在 一个例示性实施例中，经修饰的NKT细胞包含CD3+CD56+CD8+NKT细胞表型，其中所述CD3+ CD56+CD8+NKT细胞实质上不含至少一种选自CDld-四聚体(例如CDld-四聚体-)或TCR Va24_ Ja 18(例如TCR Va24_Ja 1矿)的iNKT细胞表面标记物。在另一个例示性实施例中，经修饰的 NKT细胞包含CD3+CD56乂D8+NKT细胞表型，其中所述CD3+CD56乂D8+NKT细胞实质上不含GITR (例如GITRl。在另一例示性实施例中，经修饰的NKT细胞实质上不含PI-16细胞表面标记物 (例如PI-161。在另一例示性实施例中，经修饰的NKT细胞实质上不含T细胞生长受体，如 比-15Ra(例如比-15RCT)。
[0052] 在一个实施例中，细胞表面标记物的表达含量或表面密度通过W下方式定量:使 经修饰的NKT细胞暴露于在表2中列出的一种或多种巧光染料标记的特异性抗人类单克隆 抗体，接着使用流式细胞仪（例如Gall ios，可购自美国贝克曼库尔特公司（Beckman Coulter, Inc.，USA))分选经修饰的NKT细胞。用于定量细胞标记物的表达含量的其它方法 为所属领域的技术人员已知或将显而易见的。
[0053] 经修饰的NKT细胞可来自单一个体(即，自体)或汇集自多个个体(非自体的同种异 体)。
[0054] 医药组合物
[0055] 本发明提供医药组合物，其包含本文所述的经修饰的NKT细胞和医药学上可接受 的载剂或赋形剂。
[0056] 投与本发明医药组合物或经修饰的NKT细胞的途径包括(但不限于)静脉内、肌内、 关节内、皮下、经口、局部、皮下、皮内、经皮、真皮下、肠胃外、直肠、脊髓或表皮投与。在一个 实施例中，经修饰的NKT细胞或医药组合物通过静脉内注射或输注来投与。
[0057] 本发明的医药组合物可制备为呈液体溶液或悬浮液或在注射之前呈适合于液体 媒剂中的溶液或悬浮液的固体形式的可注射剂。医药组合物还可制备为呈固体形式、乳化 或其它微粒载剂用于持续传递。举例来说，医药组合物可呈W下形式:油状乳液、油包水乳 液、水包油包水乳液、位点特异性乳液、长期滞留乳液、乳化胶、微乳液、纳米乳液、脂质体、 微粒、微球体、纳米球、纳米粒子和各种天然或合成聚合物，如非再吸收的不可渗透的聚合 物（如乙締乙酸乙締醋共聚物和Hytrel⑩共聚物）、可溶胀聚合物(如水凝胶）、或再吸收的 聚合物(如胶原蛋白）和某些聚酸或聚醋(如用于制造再吸收的缝合线的那些），其允许医药 组合物的持续释放。
[005引本发明经修饰的NKT细胞调配到医药组合物中W便传递到哺乳动物个体。医药组 合物单独和/或与医药学上可接受的媒剂、赋形剂或载剂混合投与。合适的媒剂例如为盐 水、右旋糖、甘油等和其组合。另外，媒剂可含有少量的助剂物质，如润湿或乳化剂、pH缓冲 剂或佐剂。医药学上可接受的载剂可含有用于例如稳定或提高或降低本发明的医药组合物 的吸收或清除速率的生理学上可接受的化合物。生理学上可接受的化合物可包括例如碳水 化合物(如葡萄糖、薦糖或葡聚糖）、抗氧化剂(如抗坏血酸或谷脫甘肤）、馨合剂、低分子量 蛋白质、清洁剂、脂质体载体或赋形剂或其它稳定剂和/或缓冲剂。其它生理学上可接受的 化合物包括湿润剂、乳化剂、分散剂或防腐剂。参见例如第21版雷明顿医药科学 (Remington's Pharmaceutical Science),马克出片反公司（Mack Publishing Company),宾 夕法尼亚州伊斯顿化as ton，PA.)("雷明顿(Remington ' s r )。本发明的医药组合物还可包 括辅助物质，如药理药剂、细胞因子或其它生物反应调节剂。
[0059] 制备所述剂型的实际方法为所属领域的技术人员已知或将显而易见的。参见例如 雷明顿医药科学，马克出版公司，宾夕法尼亚州伊斯顿，第21版。
[0060] 经修饰的NKT细胞或本发明医药组合物可W单剂量治疗形式或W多剂量治疗形式 投与，按照一定时程和经一定时间段，其适于个体的年龄、体重和健康状况、所用具体组合 物和投与途径、经修饰的NKT细胞或本发明医药组合物是用于预防性还是治愈性目的等。举 例来说，在一个实施例中，根据本发明的经修饰的NKT细胞或医药组合物每月一次、每月两 次、每月S次、每隔一周(qow)、每周一次(qw)、每周两次(biw)、每周S次(tiw)、每周四次、 每周五次、每周六次、每隔一天(qod)、每天(qd)、一天两次(qid)或一天S次(tid)投与。
[0061] 根据本发明的经修饰的NKT细胞或医药组合物的投与持续时间（例如投与经修饰 的NKT细胞或医药组合物所经过的时间段)可不同，视多种因素中的任一种(例如个体反应 等)而定。举例来说，经修饰的NKT细胞或医药组合物可经在W下范围内的一段时间投与:约 一秒或多秒到一分钟或多分钟，一小时或多小时到一天到约一周，约两周到约四周，约一个 月到约两个月，约两个月到约四个月，约四个月到约六个月，约六个月到约八个月，约八个 月到约1年，约1年到约2年，或约2年到约4年，或更长时间。
[0062] 有利的是将肠胃外医药组合物或经修饰的NKT细胞调配成单位剂型W实现投与简 易性和剂量均一性。如本文中所用的单位剂型是指适合作为单一剂量用于待治疗个体的物 理分散单位;每个单位含有与所需药物载剂结合的经计算W产生所需治疗作用的预定量的 经修饰的NKT细胞。
[0063] 从细胞培养分析和动物研究获得的数据可W用于调配适用于人类的多种剂量。在 一个实施例中，所述NKT细胞的剂量在包括抓50在内的循环浓度范围内，并且具有极低毒性 或无毒性。剂量可W视所用剂型和所用投药途径而在此范围内变化。在另一实施例中，治疗 有效剂量最初可W从细胞培养分析估计。可W在动物模型中调配剂量W获得如在细胞培养 中所测定的包括IC5〇(即，经修饰的NKT细胞实现症状的半数最大抑制的浓度)的循环血浆浓 度范围。桑德斯特普（Sonderstrup),施普林格免疫病理学研讨会（Springer, Sem. Immunopathol.)25:35-45,2003.尼库拉(化kula)等人，吸入毒理学（Inhal .Toxicol.) 4(12):123-53,2000。
[0064] 将医药组合物调配成含有有效量的经修饰的NKT细胞，其中所述量视待治疗的个 体和待治疗的病况而定。任何具体个体的特定剂量水准视多种因素而定，包括特定经修饰 的NKT细胞的活性、年龄、体重、一般健康状况、性别、饮食、投药时间、投药途径、W及排泄速 率、药物组合W及经历疗法的具体疾病的严重度。本发明的经修饰的NKT细胞的治疗或预防 有效量的例示性非限制性范围为至少约10个细胞/剂到约1 X l〇iMV每剂。其它剂量也为可 能的，包括(但不限于）1X102、1X103、1X104、1X105、1X106、1X107、1X108或1X109。
[0065] 用于治疗自体免疫疾病的方法
[0066] 本发明的经修饰的NKT细胞具有与Treg细胞的免疫抑制性质相似的免疫抑制性 质。在一个实施例中，本发明提供用于通过W有效治疗自体免疫疾病的量向有需要的个体 投与本文所述的经修饰的NKT细胞或医药组合物来治疗自体免疫疾病的方法。不受任何具 体理论束缚，据相信，经修饰的NKT细胞通过增加 T辅助细胞1反应(IFN- 丫分泌)或发挥免疫 抑制性质来对自体免疫疾病发挥治疗作用。在一个实施例中，免疫抑制性质为自体反应和 激活的T淋己细胞(其为自体免疫疾病中的关键参与者)的抑制。
[0067] 如本文所用，"自体免疫疾病"为由个体自身组织产生且针对个体自身组织的疾病 或病症。自体免疫疾病包括（但不限于）1型糖尿病、多发性硬化症、桥本氏甲状腺炎 化ashimoto ' S Thyroiditis)、格雷氏病（Grave ' S disease)、牛皮癖、全身性红斑狼疮 (SLE)、舍格伦综合症（Sjoren ' S Syndrome)、乳糜泻、扁平苔癖和类风湿性关节炎、狼疮过 敏性皮炎、硬皮病、异位性湿疹、鼻窦炎、哮喘、发炎性肠道疾病(如溃瘍性结肠炎）。
[0068] 经修饰的NKT细胞可单独、或在一种或多种免疫抑制剂之前、之后或与一种或多种 免疫抑制剂同时投与。免疫抑制剂的非限制性实例包括类固醇、非类固醇消炎药物(NSAID) (如吗I噪美辛（indomethacin))、疾病改性抗风湿病药物(DMARD)或前述中的两种或更多种 的组合。DMA畑包括小分子药剂，如甲氨蝶岭(methotrexate)、来氣米特（leflunomide)、柳 氮横胺化晚（sulfasalazine)、环憐酷胺（cyclo地OS地amide)、硫挫嚷岭（azathioprine)、 环抱菌素Aレyclospo;rinA)、d-青霉胺（d-penicillamine)、抗追疾药物（例如?化氯哇 化y化oxychloroquine))。0魁畑还包括生物物质，如肿瘤坏死因子a(TNF-a)括抗剂(例如依 那西普化tanercept)，商标名恩利化nbrel)，可购自美国科利奇维尔的惠氏医药公司 (Wyeth Pharmaceuticals,Inc. ,Collegeville,USA);阿达木单抗(Adalimumab)，商标名修 美乐化UMIRA)，可购自美国伊利诺伊州雅培公园的雅培实验室（AlDbott Laboratories, AW3〇tt Park, Illinois，USA))、白介素-1受体括抗剂、白介素-6受体括抗剂、抗CD20单克隆 抗体、CTLA-4-Ig、RGD 肤等。
[0069] 富集NKT细胞的方法和其用于产生经修饰的NKT细胞的用途
[0070] 如图1A中所示，样品（例如外周血液、厮血、骨髓、来自胸腺或脾的组织样品）获自 个体，且样品中的单核细胞通过离屯、(例如Ficoll-Paque?PREMIUM，美国通用电气医疗集团 (GE Healthcare USA))分离。分离（isolating)或分离（separating)单核细胞的其它方法 为所属领域的技术人员已知或将显而易见的。经分离的单核细胞可进一步富集W获得仅T 细胞。
[0071] 在一个实施例中，具有至少W下表面标记物的单核细胞自经分离的单核细胞部分 耗尽或移除:〔04^014、〔016、〔019或〔025。视样品来源而定，单核细胞可来源于人类外周单 核细胞、单核细胞或骨髓母细胞。在一个实施例中，富集的CD14-CD19-CD25-细胞部分中的单 核细胞实质上不含选自CD14、CD19或CD25的细胞表面标记物。在另一实施例中，富集的CD4- CD14-CD16-CD19-CD25-细胞部分中的单核细胞实质上不含选自〔04、〔014、〔016、〔019或〔025 的细胞表面标记物。
[0072] 在一个实施例中，如图1A和图1B中所示，用于产生经修饰的NKT细胞的体外方法包 含W下阶段：（i)耗乏或移除具有W下细胞标记物中的至少一种的单核细胞:CD14XD19或 CD25(即，产生富集的CD14-CD19-CD25-单核细胞部分）；（ii)使来自步骤（i)的CD14-CD19- CD25-细胞部分与包含转化生长因子e(TGF-e)和细胞培养基的组合物接触；W及（iii)使来 自步骤（ii)的富集的CD14-CD19-CD25-NKT细胞部分与T细胞生长因子接触。在另一实施例 中，用于产生经修饰的NKT细胞的体外方法包含W下阶段：（i)耗乏或移除具有W下细胞标 记物中的至少一种的单核细胞：〔04、〔014、〔016、〔019或〔025(即，产生富集的〔04^014- CD16-CD19-CD25-单核细胞部分）；（ii)使来自步骤（i)的富集的CD4-CD14-CD16-CD19-CD25-细 胞部分与包含TGF-0和细胞培养基的组合物接触；（iii)使来自步骤(ii)的单核细胞部分与 T细胞生长因子接触。
[0073] 在一个实施例中，使富集的NKT细胞与TGF-e、T细胞生长因子和细胞培养基接触增 强经修饰的NKT细胞上的lYeg细胞表面标记物（如CD25、Fo邱3和CTLA-4)的表达。在另一实 施例中，培养方法增强T辅助细胞表面标记物(如PD-1)的表达。经修饰的NKT细胞的增殖速 率由FACS测定的经修饰CD3+CD56 乂 D8+NKT细胞的信号强度测定。细胞增殖的其它分析为此 项技术中熟知的，例如，克隆源性分析、代谢分析和直接增殖分析。
[0074] 如本文所用的细胞培养基包括支持细胞生长和/或维持的任何培养基。细胞培养 基的非限制性实例包括造血细胞培养基，如X-Vivo 15，或包含哺乳动物细胞培养基和培养 基补充剂的混合物，如R-10培养基。
[0075] 术语哺乳动物细胞培养基包括支持哺乳动物细胞生长和/或维持的任何细胞培养 基，如RPMI培养基1640(可购自美国赛默飞世尔科技公司（Thermo Fisher Scientific, USA))。在一个实施例中，RPMI培养基1640包含lOOU/mL青霉素；lOOiig/mL链霉亲和素；2mM k谷氨酷胺；W及20mM皿PES。培养基补充剂为哺乳动物细胞培养物提供如脂质、氨基酸、 生长因子、葡萄糖或微量元素的营养物W增加产量。培养基补充剂的非限制性实例为血清， 如约5 %到约10%胎牛血清(FBS)。在一个实施例中，R-10培养基包含RPMI培养基1640和 10%FBS〇
[0076] T细胞生长因子包括刺激T细胞的产生和发育的任何分子。T细胞生长因子的非限 制性实例包括化-15。在一个实施例中，化-15的浓度为约20ng/ml到约16化g/ml。在另一实 施例中，化-15的浓度等于或小于约 160、150、140、130、120、110、100、90、80、70、60、50、40、 30或20或其间增量为Ing/ml的任何值或值范围（例如约155ng/ml、约37ng/ml)。
[0077] 尽管化-2可用于产生经修饰的NKT细胞，但由比-2产生的经修饰的NKT细胞的数目 与IL-15的数目相比较少（参见表6)。化-2和化-15为具有重叠但不同生物学作用的细胞因 子，其受体共有两个为信号转导所必需的亚基。不受任何具体理论束缚，据相信，比-15对其 专用受体a具有较高亲和力，且因此需要较低浓度的IL-15来产生经修饰的NKT细胞。在一个 实施例中，T细胞生长因子实质上不含IL-2。在另一实施例中，化-2W < 2重量％、< 1.5重 量％、。重量％和< 0.5重量％的量存在于T细胞生长因子中。富集的NKT细胞与转化生长 因子e(TGF-e)细胞培养基或T细胞生长因子的接触时间的例示性非限制性范围为约1分钟 到约1小时、约1小时到约24小时、约1天到约3天、约1天到约6天、约1天到约9天、约3天到约6 天、或至少1天。在一个实施例中，接触时间为约3天。在另一实施例中，接触时间为约6天。
[0078] 执行本发明的特定方面的W下实例仅出于说明性目的提供，且并不意欲W任何方 式限制本发明的范围。
[0079]
[0080] :富集的单核细胞部分
[0081] 如图1A中所示，40ml外周血液收集自健康志愿者且肝素化。血液样品与等体积的 预溫热的憐酸盐缓冲盐水（PBS)混合（W色列生物工业公司（Biological Industries， Israel))。将40ml稀释的外周血液等分试样置放到50ml离屯、管中且下载10ml预溫热的 Ficoll-Paque?PREMIUM。离屯、管在2000rpm下在室溫中离屯、30分钟。单核细胞自其它类型的 血细胞分离，接着收集且在PBS中洗涂一次。细胞集结粒再悬浮到密度为106个/lOOiil MACS 缓冲液。
[0082] 为了耗乏或移除具有W下细胞标记物中的至少一种的单核细胞:CD4、CD14、CD16、 CD19或CD25，来自前述段落的经分离的单核细胞使用"如a化oMACS分离器"（德国贝吉施-格 拉德己赫的美天旋生物技术公司（Miltenyi Biotec Be;rgisch,Gla化ach,Germany))根据 制造商的说明书进行免疫磁性珠粒分离。简单来说，单核细胞用生物素-抗CD14抗体、生物 素-抗CD19抗体、生物素-抗CD25抗体、生物素-抗CD4抗体和/或生物素-抗CD16抗体(其均可 购自博莱德(BioLegend))和20山链霉亲和素微珠(德国美天旋生物技术公司）染色，且用磁 性分离器分离。CD14-CD19-CD25-单核细胞部分或CD4-CD14-CD1扩CD19-CD25-单核细胞部分通 过洗涂而自未结合的细胞富集。富集的CD14-CD19-CD25-单核细胞部分实质上不含具有至少 一种选自CD14、CD19或CD25的细胞表面标记物的细胞，而富集的CD4-CD14-CD16-CD19-CD25- 单核细胞部分实质上不含具有至少一种选自〔04八014^016八019或〔025的细胞表面标记 物的细胞。
[0083] 如图2中所示，富集的CD14-CD19-CD25-细胞部分（图2D)和富集的CD4-CD14-CD16- CD19-CD25-细胞部分（图2F)的〔04、〔014、〔016、〔019和〔025的信号水准比非富集的细胞部分 (图2B)的信号水准低得多。
[0084] 实例2:经修饰的NKT细胞的第一实施例的体外培养
[0085] 如图1B中所示，来自实例1的富集的CD 14XD19-CD25-细胞部分如下培养：
[00化](a)在第0天，富集的CD14-CD19-CD25-细胞部分与包含3ml R-10培养基和40ng/ml TGF-0的组合物一起培养在预先涂布有化g抗人类CD3抗体(美国博莱德(Biolegend，USA)) 的6孔板中。
[0087] (b)在第1天，将40ng/ml比-15(博莱德)添加到步骤(a)中的培养物中。
[008引（C)在第3天，收集步骤（b)中的一半经培养细胞且下旋，接着用R-10培养基和 40ng/ml TGF-0在6孔板中再悬浮细胞集结粒。
[0089] (d)在第4天，将40ng/ml比-15(博莱德)添加到步骤(C)中的培养物中。
[0090] (e)在第6天，收集来自步骤(d)的经修饰的NKT细胞。
[0091] 步骤（e)中的经修饰的NKT细胞使用Ga 11 i0S流式细胞仪（贝克曼库尔特公司 (Beckman Coulter，Inc.))、Kazula软件1.2版（贝克曼库尔特公司）和表2中列出的抗体分 析其表型。
[
[0092] 表2.用于经修饰的NKT细胞表型的抗体 「m〇q1
[00M]在此实施例中，使用FACS/流式细胞仪分析的细胞表面标记物的表达含量定义在 表3中。表3中的表达含量的解释为定义细胞表面标记物的表达含量的一个实例。应注意，流 式细胞仪信号水准强度随着W下因素变化:流式细胞仪、软件和所用的不同批次抗体。
[0096] 表 3
[0097]
[009引结果：如图3A-3M中所示，富集的CD14-CD19-CD25-细胞部分的单核细胞具有表型 CD 14TD19-CD3乂D56+CD8+CD4-CD25下oxp3TD-rCTLA-4-G口R-PI-1 扩CD 1 d四聚体-LAPTCR V口 24_Jal8-IL-15Ra-。
[0099] 图5A-5M说明实例2中的经修饰的NKT细胞的表型为CD14-CD19-CD3+CD56+CD8+CD4- CD25+Foxp3+PD-rCTLA-4+G口R-pi-1 扩CDld四聚体-LAP+TCR Va24_Jal8-比-15Ra+表型。
[0100] 表4展示富集的CD14-CD19-CD25-细胞部分的单核细胞和由其培养的经修饰的NKT 细胞的净MFI。
[0101] 表4.
[0102]
[0104] W下概述富集的CD14-CD19-CD25-单核细胞表型和经修饰的NKT细胞表型之间的差 异。
[0105] 参富集的 CD14-CD19-CD25-单核细胞具有表型化 xp3-CD 化-pD-rCTLA-4-LAp-IL-15R 曰-，而经修饰的 NKT 细胞具有表型Foxp3乂 D25+PD-rCTLA-4+LAP+Ikl5Ra+。
[0106] ?与富集的CDI4-CDI9-CD25-细胞的相比，Fo邱3的表达在经修饰的NKT细胞中上调 至少62倍。
[0107] 参与富集的CD14-CD19-CD25-细胞的相比，CD25的表达在经修饰的NKT细胞中上调 至少130倍。
[010引参与富集的CD14-CD19-CD25-细胞的相比，PD-1的表达在经修饰的NKT细胞中上调 至少8.5倍。
[0109] 参与富集的CD14-CD19-CD25-细胞的相比，CTLA-4的表达在经修饰的NKT细胞中上 调至少73倍。
[0110] 参与富集的CD14-CD19-CD25-细胞的相比，比-15Ra的表达在经修饰的NKT细胞中上 调至少250倍。
[0111] 实例3:经修饰的MT细胞的第二实施例的体外培养
[OW] 如图1C中所示，来自实例1的富集的CD4-CD14-CD1扩CD19-CD25-细胞部分如下培养：
[0113] (a)在第0天，富集的CD4-CD14-CD16-CD19-CD25-细胞部分与包含3ml X-Vivo 15和 40ng/ml TGF-0的组合物一起培养在预先涂布有化g抗人类CD3抗体(博莱德）的6孔板中。
[0114] (b)在第1天，将80ng/ml比-15(博莱德)添加到步骤(a)中的培养物中。
[0115] (C)在第3天，收集步骤(b)中的一半经培养细胞且下旋，接着用3ml X-Vivo 15和 40ng/ml TGF-0在6孔板中再悬浮细胞集结粒。
[0116] (d)在第4天，将80ng/ml比-15(博莱德)添加到步骤(C)中的培养物中。
[0117] (e)在第6天，收集来自步骤(d)的经修饰的NKT细胞。
[0118] 步骤(e)中的经修饰的NKT细胞根据实例2中的方案分析其表型。
[0119] 结果:如图4A-化中所示，富集的CDCCDirCDl扩CD19-CD25-细胞部分的单核细胞具 有表型 CD14-CD19-CD3+CD16-CD56+CD8+CD4-CD25J〇w3TD-rCTLA-4-GITR-pi-l 扩 CDld 四聚 体-LAPTCR Va24_Jal8-IL-15Ra-。
[0120] 图6A-6L说明实例3中的经修饰的NKT细胞的表型为CD14-CD19-CD3+CD16-CD56+CD8+ CD4-CD化卞0邱3+PD-rCTLA-4+G口 R-pi-1 扩CDld四聚体-LAP+TCR Va24_Jal8-比-15RCT表型。 [01別]表5展示富集的CDCCDirCDl扩CD19-CD25-单核细胞和由其培养的经修饰的NKT细 胞的净MFI。
[0122] 表5.
[0123]
[0124]
[012引 W下概述富集的CD4-CD14-CD1扩CD19-CD25-单核细胞表型和经修饰的NKT细胞表型 之间的差异。
[0126] 参富集的 CD4-CD14-CD16-CD19-CD25-单核细胞具有表型化 xp3-CD25-pD-rCTLA-4- LAP-，而经修饰的NKT细胞具有表型化邱3+CD25+PD-rCTLA-4+LAP+。
[0127] 参与富集的CD4-CD14TD1扩CD 19-CD2 5-细胞的相比，Foxp 3的表达在经修饰的NKT细 胞中上调至少53倍。
[012引参与富集的CDrCDirCDl扩CD19-CD25-细胞的相比，CD25的表达在经修饰的NKT细 胞中上调至少85倍。
[0129] 参与富集的CDrCDirCDl扩CD19-CD25-细胞的相比，PD-1的表达在经修饰的NKT细 胞中上调至少15倍。
[0130] 参与富集的CD4-CD14TD16-CD19-CD25-细胞的相比，CTLA-4的表达在经修饰的NKT 细胞中上调至少90倍。
[0131] 实例4: IL-15浓度对经修饰的NKT细胞培养物的作用
[0132] 比-15的浓度对经修饰的NKT细胞培养物的体外评估使用FACS/流式细胞仪执行。
[0133] W下化-15浓度用于产生实例2的经修饰的NKT细胞：5ng/ml IL-12、10ng/ml、 20ng/ml、40ng/ml、80ng/ml和160ng/ml。
[0134] 璧呈当比-15浓度在约 20ng/ml 到约 160ng/ml 之间时，Foxp3、CD25、CTLA-4和 PD-1 的表达含量较高。
[0135] 实例5:经修饰的NKT细胞对激活的CFSE标记的T淋己细胞的增殖的抑制能力的功 能性评估
[0136] "T淋己细胞应答细胞"分析：簇基巧光素二乙酸醋下二酷亚胺醋（CFSE)标记的 CD25-外周血单核细胞(CD25-PBMC)用化g/ml抗CD3和化g/ml抗CD28抗体刺激W激活CFSE标 记的T淋己细胞应答细胞。将实例巧日实例3中的经修饰的NKT细胞添加到CFSE标记的T淋己 细胞应答细胞中W评估免疫抑制性质。在共培养4天之后，测量CFSE巧光稀释度。
[0137] 实例2中的经修饰的NKT细胞的结果：图7A示出了在无任何抗体刺激下CFSE标记的 T淋己细胞应答细胞的CFSE稀释度分析(2.78% )。抗CD3抗体和抗CD28抗体的添加诱导CFSE 标记的T淋己细胞应答细胞的增殖(35.02%)，如图7B中所示。图7C展示将实例帥的经修饰 的NKT细胞添加到CFSE标记的T淋己细胞应答细胞中使CFSE标记的T淋己细胞应答细胞的增 殖减少35.02 %到13.24% (62 %减少）。
[0138] 实例3中的经修饰的NKT细胞的结果：图8A示出了在无任何抗体刺激下CFSE标记的 T淋己细胞应答细胞的CFSE稀释度分析（1.18% )。抗CD3抗体和抗CD28抗体的添加诱导CFSE 标记的T淋己细胞应答细胞的增殖（15.21 % )，如图8B中所示。图8C展示将实例3中的经修饰 的NKT细胞添加到CFSE标记的T淋己细胞应答细胞中使CFSE标记的T淋己细胞应答细胞的增 殖减少15.21 % 到3.7 % (75.5 % 减小）。
[0139] 运些结果展示出本发明的经修饰的NKT细胞有效抑制激活的CFSE标记的T淋己细 胞(其为自体免疫疾病中的关键参与者)的增殖。
[0140] 实例6: IL-2对经修饰的NKT细胞的产生的作用
[0141] IL-2对经修饰的NKT细胞培养物的作用的体外评估使用FACS/流式细胞仪执行。实 例1的富集的CD14-CD19-CD25-单核细胞与（a)抗CD3抗体巧GF-0+比-2或(b)抗CD3抗体巧GF- 折比-15-起根据实例2中的步骤培养。
[0142] 表6.用不同培养基或生长因子产生的经修饰的NKT细胞的％
[0143]
[0144] 如表6中所示，用TGF-0和化-2产生的经修饰的NKT细胞的一个例示性实施例的％ 为1.26。另一方面，用TGF-0和比-15产生的经修饰的NKT细胞的％为15.47，此代表与用TGF- 0和IL-2产生的经修饰的NKT细胞的％相比增加11倍。
[0145] 虽然已经描述并说明了本发明的特定方面，但是所述方面应仅视为本发明的说明 性实施例并且不应视为限制如根据所附权利要求书所理解的本发明。本说明书中所引用的 所有公开案和专利申请案W全文引用的方式并入本文中用于所有目的，其引用的程度如同 每篇个别公开案或专利申请案经具体地并且个别地指明W引用的方式并入一般，W用于所 有目的。尽管已出于清楚理解的目的通过说明和实例相当详细地描述前述发明，但根据本 发明的教示，所属领域的技术人员能容易地显而易见，可在不脱离所附权利要求书的精神 或范围的情况下对其作出某些改变和修改。
【主权项】
1. 一种经修饰的自然杀伤T (NKT)细胞，其包含： NKT细胞表型，其特征为⑶3+⑶56+⑶8+; 至少一种T调节性(Treg)细胞表面标记物，其选自CD25、Foxp3、CTLA-4或LAP;以及 T辅助细胞表面标记物，其选自PD-1。2. 根据权利要求1所述的经修饰的NKT细胞，其中所述NKT细胞表型实质上不含至少一 种选自⑶Id-四聚体或TCR Va24_Jal8的恒定型自然杀伤T(iNKT)细胞表面标记物。3. 根据权利要求1所述的经修饰的NKT细胞，其中所述NKT细胞表型实质上不含GITR、 PI-16或其组合。4. 根据权利要求1所述的经修饰的NKT细胞，其进一步包含IL-15Ra。5. 根据权利要求1所述的经修饰的NKT细胞，其中所述NKT细胞表型实质上不含IL-15R a〇6. -种医药组合物，其包含： (a) 经修饰的NKT细胞，其包含： NKT细胞表型，其特征为⑶3+⑶56+⑶8+; 至少一种T调节性(Treg)细胞表面标记物，其选自CD25、Foxp3、CTLA-4和LAP;以及 T辅助细胞表面标记物，其选自PD-1;以及 (b) 医药学上可接受的载剂或赋形剂。7. 根据权利要求6所述的医药组合物，其中所述NKT细胞表型实质上不含一种或多种选 自⑶Id-四聚体或TCR Va24_Jal8的iNKT细胞表面标记物。8. 根据权利要求6所述的医药组合物，其中所述NKT细胞表型实质上不含GITR、PI-16或 其组合。9. 根据权利要求6所述的医药组合物，其中所述经修饰的NKT细胞进一步包含IL-15Ra。10. 根据权利要求6所述的医药组合物，其中所述NKT细胞表型实质上不含IL_15Ra。11. 权利要求1所述的经修饰的NKT细胞在制备治疗自体免疫疾病的药物中的用途。12. 根据权利要求11所述的用途，其中所述经修饰的NKT细胞实质上不含一种或多种选 自⑶Id-四聚体或TCR Va24_Jal8的iNKT细胞表面标记物。13. 根据权利要求11所述的用途，其中所述经修饰的NKT细胞实质上不含GITR、PI-16或 其组合。14. 根据权利要求11所述的用途，其中所述经修饰的NKT细胞进一步包含IL-15Ra。15. 根据权利要求11所述的用途，其中所述经修饰的NKT细胞实质上不含IL-15Ra。16. 根据权利要求11所述的用途，其中所述治疗自体免疫疾病的药物中，进一步包含免 疫抑制剂。17. -种产生根据权利要求1所述的经修饰的NKT细胞的方法，其包含以下步骤： (a) 将富集的⑶14TD19TD25^单核细胞部分与包含转化生长因子iKTGF-β)和细胞培养 基的组合物一起培养；以及 (b) 使来自步骤(a)的所述经培养的细胞部分与T细胞生长因子接触。18. 根据权利要求17所述的方法，其中所述细胞培养基包含哺乳动物细胞培养基和培 养基补充剂。19. 根据权利要求18所述的方法，其中所述哺乳动物细胞培养基为RPMI培养基1640且 所述培养基补充剂为胎牛血清。20. 根据权利要求17所述的方法，其中所述细胞培养基为造血细胞培养基。21. 根据权利要求20所述的方法，其中所述造血细胞培养基为X-Viv〇15。22. 根据权利要求17所述的方法，其中所述T细胞生长因子为IL-15。23. 根据权利要求17所述的方法，其中所述富集的CD14TD19TD25^单核细胞进一步耗 尽具有以下细胞标记物中的至少一种的细胞:⑶4或⑶16。24. 根据权利要求17所述的方法，其中所述富集的细胞碎片与所述组合物或所述T细胞 生长因子的所述接触时间为约1天到约3天。25. -种经修饰的自然杀伤T(NKT)细胞，其包含表型CD3+CD56+CD8+CDld-四聚体-TCR Va 24_Ja 18-GITR-ΡI -16-CD25+Foxp3+CTLA-4+LAP+PD- ΓIL-15Rcf 〇
【文档编号】C12N5/0783GK106047808SQ201610212808
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年4月7日 公开号201610212808.5, CN 106047808 A, CN 106047808A, CN 201610212808, CN-A-106047808, CN106047808 A, CN106047808A, CN201610212808, CN201610212808.5
【发明人】李建谋, 方志豪, 郑雅方, 魏大程, 周凯元
【申请人】富禾生医股份有限公司