一种mhc限制性杀伤t细胞的体外诱导培养方法
【专利摘要】本发明涉及细胞体外诱导培养及扩增【技术领域】，特别涉及一种MHC限制性杀伤T细胞的体外诱导培养方法：分离脐带血单个核细胞；脐带血单个核细胞放入培养基中培养，采用含10%FBS的RPMI-1640为基础培养基，添加不同的细胞因子在培养细胞的4个阶段使用。使用脐血中提取的MNC细胞作为原料，通过添加细胞因子，经过15天的扩增培养获得扩增10-15倍的CTL，并且具有旺盛的杀瘤活性，使脐血可以作为肿瘤过继免疫治疗所需T淋巴细胞的来源；该方法能够获得较其他方法数量更多的CTL，并且体外细胞毒性试验与荧光定量PCR实验检测细胞毒性增强。
【专利说明】一种MHC限制性杀伤T细胞的体外诱导培养方法
[0001]【技术领域】
本发明涉及细胞体外诱导培养及扩增【技术领域】，特别涉及一种MHC限制性杀伤T细胞的体外诱导培养方法。
[0002]【背景技术】
肿瘤过继免疫治疗是指通过向肿瘤患者输注抗肿瘤活性的免疫细胞，直接杀伤或激发机体免疫反应以达到杀伤肿瘤细胞治疗肿瘤的目的，过继免疫治疗是肿瘤生物治疗的重要组成部分，在肿瘤的治疗中起着积极的作用，其中常见的细胞种类包括细胞因子诱导的T细胞(cytokine induced killor, CIK 细胞)、自然杀伤细胞(Nature killor, NK 细胞)和杀伤性T细胞(cytotoxic T cell，CTL)。其中CTL是机体特异性抗肿瘤免疫的主要效应细胞，是肿瘤免疫治疗中较为理想的效应细胞种类。CTL是一类具有CD3+CD8+表面标志、具有MHC I限制性的T细胞，可以特异性地快速性杀伤靶细胞。虽然CTL受MHC I类分子限制性，T细胞过继免疫疗法须使用患者自身的血液进行，但HLA与患者相同或部分相同的健康个体也可获得特异性的CTL。近年来的研究成果肯定了来自患者体内或经体外肿瘤抗原刺激的肿瘤抗原特异性T细胞过继免疫疗法，但该方法仍有不足之处:患者在疾病状态下免疫细胞功能低下，而且经连续放化疗之后，使体外扩增难度进一步增加。因此寻找功能健全的免疫细胞来源非常必要。
[0003]脐带血干细胞是目前的研究热点，其来源丰富，获取方便，含有丰富的造血干细胞和免疫细胞；同时脐血造血干细胞具有多向分化潜能，在造血因子的作用下可以分化扩增。目前技术已能长时间储存脐血，经深低温长期储存的脐血经过多种细胞因子组合诱导分化，可产生大量免疫细胞如CIK细胞和NK细胞，用于肿瘤过继免疫治疗，但有关扩展脐血CTL的报道尚不多见。
[0004]虽然很多研究结果显示脐血特异性的CTL的杀伤活性较成人外周血CTL低，但脐血T细胞前体和辅助T细胞前体的含量与成人外周血相当，受异种抗原刺激的增殖反应强，仍然可作为过继免疫治疗的来源。如脐血T淋巴细胞分泌IFN-Y低于成人，但在IL-2刺激后，两者无明显差异。经PHA-P刺激后能够使脐血T淋巴细胞活化，有文献报道，脐血淋巴细胞对不同浓度的植物血凝集素(PHA)和刀豆蛋白A的增殖反应与成人相同或高于成人，所以脐血T淋巴细胞可望成为肿瘤过继免疫治疗的主要替代细胞来源。
[0005]
【发明内容】
为了解决以上现有技术中本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种MHC限制性杀伤τ细胞(ctl，表型为ra3+ra8+)的体外诱导培养方法。
[0006]本发明是通过以下步骤得到的:
一种MHC限制性杀伤T细胞的体外诱导培养方法，包括以下步骤:
(1)分离脐带血单个核细胞；
(2)脐带血单个核细胞放入培养基中培养，采用含10%FBS的RPM1-1640为基础培养基，添加不同的细胞因子在培养细胞的4个阶段使用，
第一阶段为第I天，在基础培养基中加入10-100ng/mL的GM-CSF，lO-lOOng/mL的Y-1FN, 10-100ng/mL 的 IL-15, l_5ug/mL 的 PHA-P 和 10-1000IU/mL 的 IL-4 进行培养；
第二阶段为第2天，在基础培养基中加入10-100ng/mL的SCF，lO-lOOng/mL的FLT-3L，lO-lOOng/mL 的 anti_CD3, lO-lOOng/mL 的 anti_CD28 和 100-1000IU/mL 的 IL-2 进行培养;
第三阶段为第5-8天，在基础培养基中加入10-100ng/mL的SCF, lO-lOOng/mL的FLT-3L, lO-lOOng/mL 的 IL-15 和 100-1000IU/mL 的 IL-2 进行培养；
第四阶段为第9-15天，在基础培养基中加入10-100ng/mL的IL-15和100_1000IU/mL的IL-2进行培养。
[0007]一种MHC限制性杀伤T细胞的体外诱导培养方法，包括以下步骤:
(1)分离脐带血单个核细胞；
(2)脐带血单个核细胞放入培养基中培养，采用含10%FBS的RPM1-1640为基础培养基，添加不同的细胞因子在培养细胞的4个阶段使用，
第一阶段在基础培养基中加入10-50ng/mL的GM-CSF，lO-lOOng/mL的
Y-1FN, 5-50ng/mL 的 IL-15, l_5ug/mL 的 PHA-P 和 10_500IU/mL 的 IL-4 进行培养；
第二阶段在基础培养基中加入 10-50ng/mL 的 SCF, 10_50ng/mL 的 FLT-3L，lO-lOOng/mL的 ant1-CD3, lO-lOOng /mL 的 anti_CD28 和 1000-2000IU/mL 的 IL-2 进行培养；
第三阶段在基础培养基中加入10-50ng/mL的SCF, 10-50ng/mL的FLT-3L，5_50ng/mL的 IL-15 和 1000-2000IU/mL 的 IL-2 进行培养；
第四阶段在基础培养基中加入5-50ng/mL的IL-15和1000-2000IU/mL的IL-2进行培养。
[0008]所述的体外诱导培养方法，优选
第一阶段在基础培养基中加入20ng/mL的GM-CSF，50ng/mL的\ -1FN, 10ng/mL的IL-15, 2ug/mL 的 PHA-P 和 100IU/mL 的 IL-4 进行培养；
第二阶段在基础培养基中加入20ng/mL的SCF, 20ng/mL的FLT-3L，50ng/mL的ant1-CD3, 50ng/mL 的 anti_CD28 和 1000IU/mL 的 IL-2 进行培养；
第三阶段在基础培养基中加入20ng/mL的SCF, 20ng/mL的FLT-3L，10ng/mL的IL-15和1000IU/mL的IL-2进行培养；
第四阶段在基础培养基中加入10ng/mL的IL-15和1000IU/mL的IL-2进行培养。
[0009]所述的体外诱导培养方法，优选在每个阶段中保持细胞密度为5 X IO6个/mL。
[0010]所述的体外诱导培养方法，优选培养发生在37°C、5% CO2、饱和湿度的细胞培养箱内。
[0011]所述的体外诱导培养方法，优选分离脐带血单个核细胞的步骤包括:脐带血用淋巴细胞分离液分离，用密度梯度离心法分离得到脐带血单个核细胞。
[0012]本发明的有益效果:
1)使用脐血中提取的MNC细胞作为原料，通过添加细胞因子，经过15天的扩增培养获得扩增10-15倍的CTL，并且具有旺盛的杀瘤活性，使脐血可以作为肿瘤过继免疫治疗所需T淋巴细胞的来源；
2)该方法能够获得较其他方法数量更多的CTL，并且体外细胞毒性试验与荧光定量PCR实验检测细胞毒性增强。[0013]【专利附图】
【附图说明】
图1是CTL细胞形态学观察和增殖直方图，A为培养前CTL细胞形态学观察(X 200)；B为培养后CTL细胞形态学观察；
图2是流式细胞术检测实施例1细胞表型在培养前后的变化，其中A、D、G为CTL细胞培养前后CD3CD8表型变化图；B、E、H为CTL细胞培养前后CD4CD25表型变化图；C、F、I为CTL细胞培养前后⑶3⑶56表型变化图；
图3是流式细胞术检测实施例2细胞表型在培养前后的变化，其中A、D、G为CTL细胞培养前后CD3CD8表型变化图；B、E、H为CTL细胞培养前后CD4CD25表型变化图；C、F、I为CTL细胞培养前后⑶3⑶56表型变化图；
图4是流式细胞术检测实施例3细胞表型在培养前后的变化，其中A、D、G为CTL细胞培养前后CD3CD8表型变化图；B、E、H为CTL细胞培养前后CD4CD25表型变化图；C、F、I为CTL细胞培养前后⑶3⑶56表型变化图；
图5是实施例1诱导得到的CTL细胞杀伤活性检测结果(CCK8法)，A为直接提取的脐血MNC细胞，B为经过培养的CTL细胞；
图6是实施例1诱导得到的CLT细胞内TNF- a、GM-CSF, IFN- y、granzymeA、granzymeB、GM-CSF、granulysin、perforin等相关细胞因子基因的表达,实体柱为扩增前结果，空白柱为扩增后结果。
【具体实施方式】
[0014]下面结合具体实施例对本发明进行进一步说明:
实施例1:由脐血体外诱导培养CTL细胞
(I)足月正常分娩之脐血取自山东大学齐鲁医院妇产科(产妇知情同意，并经山东大学齐鲁医院伦理委员会同意)，用含枸橼酸钠抗凝剂的采血袋收集，24h内实验。输血传播传染病检测合格的脐带血用Ficoll淋巴细胞分离液分离，用密度梯度离心法分离得到脐带血单个核细胞(MNC)，待培养。
[0015]第一阶段(第I天)在基础培养基中加入20ng/mL的GM-CSF，50ng/mL的
Y-1FN, 10ng/mL 的 IL-15, 2ug/mL 的 PHA-P 和 100IU/mL 的 IL-4 得到个性化培养基 1，调整细胞密度为5 X 1O6个/mL，进行培养；
第二阶段(第2-4天)在基础培养基中加入20ng/mL的SCF，20ng/mL的FLT-3L，50ng/mL的ant1-CD3, 50ng/mL的anti_CD28和1000IU/mL的IL-2到个性化培养基2，调整细胞密度为5 X IO6个/mL，进行培养；
第三阶段(第5-8天)在基础培养基中加入20ng/mL的SCF，20ng/mL的FLT-3L，IOng/mL的IL-15和1000IU/mL的IL-2到个性化培养基3，调整细胞密度为5 X IO6个/mL，进行培养；
第四阶段(第9-15天)在基础培养基中加入10ng/mL的IL-15和1000IU/mL的IL-2到个性化培养基4，调整细胞密度为5 X IO6个/mL，进行培养，得到CTL细胞。
[0016]上述细胞培养置于37°C、5% CO2、饱和湿度的细胞培养箱内培养。每隔I天通过台盼蓝染色法计数并检测细胞免疫表型和活性。共培养15天后收获细胞。细胞总数平均由培养前平均细胞数4.6 X IO7达到个性化培养后细胞数7 X IO8,增殖率平均为1522%。图1是CTL细胞形态学观察图，A:为培养前CTL细胞形态学观察(X 200) ；B为培养后CTL细胞形态学观察，可见细胞聚集成克隆球(X 200)。
[0017]实施例2:由脐血体外诱导培养CTL细胞
(I)足月正常分娩之脐血取自山东大学齐鲁医院妇产科(产妇知情同意，并经山东大学齐鲁医院伦理委员会同意)，用含枸橼酸钠抗凝剂的采血袋收集，24h内实验。输血传播传染病检测合格的脐带血用Ficoll淋巴细胞分离液分离，用密度梯度离心法分离得到脐带血单个核细胞(MNC)，待培养。
[0018]第一阶段(第I天)在基础培养基中加入10ng/mL的GM-CSF，10ng/mL的
Y-1FN, 5ng/mL的IL-15, lug/mL的PHA-P和10IU/mL的IL-4得到个性化培养基1，调整细胞密度为5 X IO6个/mL，进行培养；
第二阶段(第2-4天)在基础培养基中加入10ng/mL的SCF，10ng/mL的FLT-3L，IOng/mL的ant1-CD3, 10ng/mL的anti_CD28和1000IU/mL的IL-2到个性化培养基2，调整细胞密度为5 X IO6个/mL，进行培养；
第三阶段(第5-8天) 在基础培养基中加入10ng/mL的SCF，10ng/mL的FLT-3L，5ng/mL的IL-15和1000IU/mL的IL-2到个性化培养基3，调整细胞密度为5 X IO6个/mL，进行培养；
第四阶段(第9-15天)在基础培养基中加入5ng/mL的IL-15和1000IU/mL的IL-2到个性化培养基4，调整细胞密度为5 X IO6个/mL，进行培养，得到CTL细胞。
[0019]上述细胞培养置于37°C、5% CO2、饱和湿度的细胞培养箱内培养。每隔I天通过台盼蓝染色法计数并检测细胞免疫表型和活性。共培养15天后收获细胞。细胞总数平均由培养前平均细胞数4.7 X IO7达到个性化培养后细胞数2.32 X 108，增殖率平均为493%。
[0020]实施例3:由脐血体外诱导培养CTL细胞
(I)足月正常分娩之脐血取自山东大学齐鲁医院妇产科(产妇知情同意，并经山东大学齐鲁医院伦理委员会同意)，用含枸橼酸钠抗凝剂的采血袋收集，24h内实验。输血传播传染病检测合格的脐带血用Ficoll淋巴细胞分离液分离，用密度梯度离心法分离得到脐带血单个核细胞(MNC)，待培养。
[0021 ] 第一阶段(第I天)在基础培养基中加入100ng/mL的GM-CSF，100ng/mL的
Y-1FN, 50ng/mL 的 IL-15, 5ug/mL 的 PHA-P 和 500IU/mL 的 IL-4 得到个性化培养基 1，调整细胞密度为5 X IO6个/mL，进行培养；
第二阶段(第2-4天)在基础培养基中加入50ng/mL的SCF, 50ng/mL的FLT-3L，IOOng/mL的ant1-CD3, 100ng/mL的anti_CD28和2000IU/mL的IL-2到个性化培养基2，调整细胞密度为5 X IO6个/mL，进行培养；
第三阶段(第5-8天)在基础培养基中加入50ng/mL的SCF, 50ng/mL的FLT-3L，50ng/mL的IL-15和2000IU/mL的IL-2到个性化培养基3，调整细胞密度为5 X IO6个/mL，进行培养；
第四阶段(第9-15天)在基础培养基中加入50ng/mL的IL-15和2000IU/mL的IL-2到个性化培养基4，调整细胞密度为5 X IO6个/mL，进行培养，得到CTL细胞。
[0022]上述细胞培养置于37°C、5% CO2、饱和湿度的细胞培养箱内培养。每隔I天通过台盼蓝染色法计数并检测细胞免疫表型和活性。共培养15天后收获细胞。细胞总数平均由培养前平均细胞数4. 9 X 107达到个性化培养后细胞数6. 1 X 108，增殖率平均为1244%。
[0023]诱导培养结果鉴定 1.免疫表型鉴定
分别用PE标记小鼠抗人单克隆抗体⑶3、⑶25，FITC标记小鼠抗人单克隆抗体⑶8、 CD56、CD4，分别以相应PE-小鼠IgGl和FITC-小鼠IgGl、FITC_小鼠IgG2b作为同型对照 抗体，使用流式细胞仪对直接分离的脐血单个核细胞和经过体外诱导培养得到的细胞进行 检测。实施例1、2、3的检测结果分别见图2，图3，图4，其中A、D、G为CTL细胞培养前后 ⑶3⑶8表型变化图；B、E、H为CTL细胞培养前后⑶4⑶25表型变化图；C、F、I为CTL细胞 培养前后CD3CD56表型变化图。
[0024]经流式细胞仪检测显示，直接分离的脐血单个核细胞流式分型的结果95%以上均 为CD3-CD8-双阴性，而在体外培养15d后，经过实施例1体外诱导培养收获的CTL细胞 CD3+CD8+细胞的比例高达82. 77%，CD4+CD25+细胞仅有1. 44%，同时还含有少量的CD3-CD56+ 细胞（0. 45%)。实施例2和实施例3体外诱导培养收获的CTL细胞OT3+ra8+细胞的比例也 达到53. 34%和76. 35%。综合考虑实验结果与培养成本，我们认为实施例1为最优。
[0025]2.细胞杀伤活性检测（CCK-8法）
收集对数生长期K562细胞、Hela细胞为靶细胞，并调整密度为1 X 105个/mL。将经过 体外诱导培养收获的CTL细胞作为实验组，以直接分离的脐血MNC细胞作为对照组。根据 不同效靶比，调整CTL细胞密度为1 X 105/ml和1 X 106/mL两组，分别按效靶比（1:1，10:1) 将CTL细胞与靶细胞（各lOOul)混合，同时设相应的仅靶细胞对照孔，仅CTL细胞对照孔 和培养基空白对照孔，终体积均为200ul/孔，每组均设8个平行孔。37°C 5% C02培养箱中 培养，在培养的3h和6h分别取下一排孔，加入10ul CCK-8并混匀，于培养箱中继续培养1 小时后，测定每孔450nm波长处的0D值。
[0026]细胞毒活性的计算方法：求出8个平行孔的平 均值，按以下方法计算效应细胞毒活性，以杀伤率％表示： 细胞毒活性=1-(效靶细胞作用孔0￡)值-效应细胞孔OD值卜靶细胞孔OD值xl 00%
比较不同效靶比、不同时间点下对照组细胞及CTL细胞对Hela细胞和HK562细胞的杀 伤活性，结果见图5，CTL细胞杀伤活性检测结果（CCK8法）。实验结果显示经过培养的CTL 细胞比直接提取的脐血MNC细胞杀伤力显著增高，而且效靶比越高、杀瘤时间越长，杀伤效 果就越好。直接提取的MNC细胞杀伤效果平均值为61. 88%，最低32. 45%，最高71. 96% ;培 养的CTL细胞杀伤效果均能达到80%以上，平均值为90. 33%，与对照组相比有显著提高。
[0027]3、Real-time RT-PCR法检测相关基因表达
取直接分离的脐血单个核细胞和经过体外诱导培养收获的CTL细胞，各1 X 106个细 胞。按Trizol试剂盒说明提取总RNA;进行RT-PCR获得cDNA,检测颗粒酶（granzyme )A、颗粒酶 B、GM-CSF、颗粒溶素(Granulysin )、IFN-y、TGF-betal、TNF-a 和穿孔素 (perforin )基因的表达，以GAPDH为内参基因。采用SYBR Green Dye I法在PCR仪MX 3000P进行定量PCR反应，以直接分离的脐血MNC细胞作为对照组并将其结果设为1，见图 6。
[0028]结果显示TNF- a、GM_CSF和IFN_ y等相关细胞因子的mRNA表达水平水平均有不 同程度增加，与对照组相比较，其中IFN-y、TGF-betal上调较为明显（P〈0. 05)，其余因子均大幅上调(P〈0.01)。[0029]上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受实施例的限制，其它任何未背离本发明的精神实质与原理下所做的改变、修饰、组合、替代、简化均应为等效替换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
【权利要求】
1.一种MHC限制性杀伤T细胞的体外诱导培养方法，其特征是包括以下步骤: (1)分离脐带血单个核细胞； (2)脐带血单个核细胞放入培养基中培养，采用含10%FBS的RPM1-1640为基础培养基，添加不同的细胞因子在培养细胞的4个阶段使用， 第一阶段为第I天，在基础培养基中加入10-100ng/mL的GM-CSF，lO-lOOng/mL的Y-1FN, lO-lOOng/mL 的 IL-15, l_5ug/mL 的 PHA-P 和 10-1000IU/mL 的 IL-4 进行培养； 第二阶段为第2天，在基础培养基中加入10-100ng/mL的SCF，lO-lOOng/mL的FLT-3L，lO-lOOng/mL 的 anti_CD3, lO-lOOng/mL 的 anti_CD28 和 100-1000IU/mL 的 IL-2 进行培养; 第三阶段为第5-8天，在基础培养基中加入10-100ng/mL的SCF, lO-lOOng/mL的FLT-3L, lO-lOOng/mL 的 IL-15 和 100-1000IU/mL 的 IL-2 进行培养； 第四阶段为第9-15天，在基础培养基中加入10-100ng/mL的IL-15和100_1000IU/mL的IL-2进行培养。
2.—种MHC限制性杀伤T细胞的体外诱导培养方法，其特征是包括以下步骤: (1)分离脐带血单个核细胞； (2)脐带血单个核细胞放入培养基中培养，采用含10%FBS的RPM1-1640为基础培养基，添加不同的细胞因子在培养细胞的4个阶段使用， 第一阶段在基础培养基中加入10-50ng/mL的GM-CSF，lO-lOOng/mL的Y-1FN, 5-50ng/mL 的 IL-15, l_5ug/mL 的 PHA-P 和 10_500IU/mL 的 IL-4 进行培养； 第二阶段在基础培养基中加入 10-50ng/mL 的 SCF, 10-50ng/mL 的 FLT-3L，lO-lOOng/mL的 ant1-CD3, lO-lOOng/mL 的 anti_CD28 和 1000-2000IU/mL 的 IL-2 进行培养； 第三阶段在基础培养基中加入10-50ng/mL的SCF, 10-50ng/mL的FLT-3L，5_50ng/mL的 IL-15 和 1000-2000IU/mL 的 IL-2 进行培养； 第四阶段在基础培养基中加入5-50ng/mL的IL-15和1000-2000IU/mL的IL-2进行培养。
3.根据权利要求2所述的体外诱导培养方法，其特征在于 第一阶段在基础培养基中加入20ng/mL的GM-CSF，50ng/mL的\ -1FN, 10ng/mL的IL-15, 2ug/mL 的 PHA-P 和 100IU/mL 的 IL-4 进行培养； 第二阶段在基础培养基中加入20ng/mL的SCF, 20ng/mL的FLT-3L，50ng/mL的ant1-CD3, 50ng/mL 的 anti_CD28 和 1000IU/mL 的 IL-2 进行培养； 第三阶段在基础培养基中加入20ng/mL的SCF, 20ng/mL的FLT-3L，10ng/mL的IL-15和1000IU/mL的IL-2进行培养； 第四阶段在基础培养基中加入10ng/mL的IL-15和1000IU/mL的IL-2进行培养。
4.根据权利要求1或2所述的体外诱导培养方法，其特征在于在每个阶段中保持细胞密度为5 X IO6个/mL。
5.根据权利要求1或2或4所述的体外诱导培养方法，其特征在于培养发生在37°C、5% CO2、饱和湿度的细胞培养箱内。
6.根据权利要求1或2或4所述的体外诱导培养方法，其特征在于分离脐带血单个核细胞的步骤包括:脐带血用淋巴细胞分离液分离，用密度梯度离心法分离得到脐带血单个核细胞 。
【文档编号】C12N5/0783GK103740643SQ201410026036
【公开日】2014年4月23日 申请日期:2014年1月21日 优先权日:2014年1月21日
【发明者】明奕, 张海燕, 李栋 申请人:山东省齐鲁干细胞工程有限公司