Foxp3+天然杀伤t细胞及免疫相关疾病的治疗的制作方法

专利名称：Foxp3+天然杀伤t细胞及免疫相关疾病的治疗的制作方法
F0XP3+天然杀伤T细胞及免疫相关疾病的治疗相关申请案本申请案根据35U. S. C. § 119(e)的规定主张2008年11月13日申请的标题为 "Foxp3+调节天然杀伤 T 细胞及其产生方法(Foxp3+Regulatory natural killer T cells and a method for their generation) ” 的美国临时申请案第 61/114，362 号的权利。本申请案主张2009年9月25日申请的标题为“细胞的新方法及用途(New process and use of cells) ”的葡萄牙临时申请案第104764号的权利。各上文所指出申请案的全部内容均以引用方式并入本文中。
背景技术：
近年来，NKT细胞在调节免疫系统中的作用获得重大关注。NKT细胞的功能依赖于细胞杀伤，且尤其依赖于细胞因子的释放。具体来说，已显示，NKT细胞能够产生为Thl、Th2 或Thl7应答所特有的细胞因子，因此影响适应性免疫(1) (2) (3) (4) (5) (6) (7)。对常规T 细胞的影响转变为多种NKT细胞抑制或加剧的免疫病状⑶(9) (10) (11) (12) (13)。已在移植(14)、过敏症(15)、自身免疫(16) (17)及其他炎性病状(18) (19)中报导这种NKT细胞对适应性免疫的影响。

发明内容
一方面，本发明提供分离的R)xp3+天然杀伤T细胞及包含R)xp3+天然杀伤T细胞的细胞群。一方面，本发明还提供使用TGF-β及一或多种NKT刺激剂产生R)xp3+天然杀伤T细胞的方法。R)xp3+天然杀伤T细胞可在体外产生，且其可在个体中原位产生。本文中指出，Foxp3+天然杀伤T细胞具有与Treg细胞类似的免疫抑制特性，且因此R)xp3+天然杀伤T细胞可用于治疗多种免疫病症及病状。当全身投予时，Foxp3+天然杀伤T细胞寻靶至肝及肺。因此，一方面，本发明提供通过全身投予i^Xp3+天然杀伤T细胞来治疗肝及肺免疫病症及病状的方法。这些免疫病症及病状包括移植物抗宿主病(graft versus host disease)、与肝移植及胰岛移植有关或由其引起的不期望副作用、及哮喘。你即3+天然杀伤T细胞寻靶至肝及肺也容许向这些器官投予治疗性多肽及其他药剂。本文中进一步指出，R)xp3+天然杀伤T细胞可通过局部投予TGF-β及NKT刺激剂而在特定解剖学位置(例如器官)原位产生。本文中还指出，如果TGF-β或NKT刺激剂在特定解剖学位置能够以足量得到，则无需投予。因此，一方面，本发明提供通过局部原位产生R)Xp3+天然杀伤T细胞来治疗特定解剖学位置免疫病症及病状的方法。一方面，本发明提供分离的R)xp3+天然杀伤T细胞。一方面，本发明提供分离的细胞群，其包含(a)至少0.001%的^)即3+天然杀伤 T细胞，或(b)至少10个R)Xp3+天然杀伤T细胞。在一些实施例中，Foxp3+天然杀伤T细胞所占百分比为至少0. 001%、至少0. 01%、至少0. 05%、至少0. 1%、至少0. 5%、至少1%、 至少5%、至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、或至少90%。在一些实施例中，R)xp3+天然杀伤T细胞的数目为至少1个、至少 10个、至少50个、至少100个、至少500个、至少1，000个、至少5，000个、至少10，000个、 至少50，000个、至少100，000个、至少1 X IO6个、至少1 X IO7个、或至少1 X IO8个细胞。在
一些实施例中，所述细胞群是血细胞群、白细胞群、T细胞群或天然杀伤T细胞群。在一些实施例中，所述细胞群是T细胞群。一方面，本发明提供一种产生R)Xp3+天然杀伤T细胞的方法，所述方法包含使包含天然杀伤τ细胞的细胞群与足以产生R)Xp3+天然杀伤T细胞的量的TGF- β与一或多种 NKT刺激剂的组合接触。在一些实施例中，所述方法进一步包含使细胞群与IL-2接触。在一些实施例中，所述方法进一步包含使细胞群与IL-7、IL-15及IL-21中的任一者或任一组合接触。在一些实施例中，所述方法进一步包含使细胞群与选自由抗-IFN γ、抗-IL-4、 抗-IL-6、抗-IL12及抗-IL-27组成群组的中和抗体中的任一种或其任一组合接触。在一些实施例中，所述细胞群是血细胞群、白细胞群、T细胞群或天然杀伤T细胞群。在一些实施例中，所述细胞群收获自个体。一方面，本发明提供一种增加R)xp3+天然杀伤T细胞的数目的方法，所述方法包含使包含至少一你即3+天然杀伤T细胞的细胞群与足以增加R)xp3+天然杀伤T细胞的数目的量的TGF-β、NKT刺激剂、一或多种增殖诱导细胞因子及一或多种中和抗体的组合接触。在一些实施例中，Foxp3+天然杀伤T细胞的数目增加至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少50倍、至少100倍、至少200倍、至少500倍、至少1000倍、至少10，000倍、至少100，000 倍、至少IO6倍、至少IO7倍。在一些实施例中，增殖诱导细胞因子是IL-2、IL-7、IL-15及 IL-21中的一者或任一组合。在一些实施例中，中和抗体是抗-正^^、抗-11^-4、抗-11^-6、 抗-IL12及抗-IL-27中的任一者或任一组合。一方面，本发明提供一种将天然杀伤T细胞递送至个体的肝或粘膜组织的方法， 所述方法包含向个体全身投予你@3+天然杀伤T细胞。一方面，本发明提供一种将天然杀伤T细胞递送至个体的肝或粘膜组织的方法，所述方法包含向个体局部投予R)Xp3+天然杀伤T细胞。在一些实施例中，R)xp3+天然杀伤T细胞是自体细胞。在一些实施例中，通过使天然杀伤T细胞与足以产生R)xp3+天然杀伤T细胞的量的一或多种NKT细胞刺激剂及TGF-β接触来产生R)xp3+天然杀伤T细胞。在一些实施例中，以有效抑制肝或粘膜组织中的免疫应答的量投予你@3+天然杀伤T细胞。在一些实施例中，抑制肝中的免疫应答旨在治疗移植物抗宿主病、由胰岛移植引起或与其有关的不期望的免疫应答、由肝移植引起或与其有关的不期望的免疫应答或免疫介导的肝炎症。在一些实施例中，Foxp3+天然杀伤T细胞与胰岛移植或肝移植结合投予。在一些实施例中，Foxp3+天然杀伤T细胞的基因组包含编码多肽的核酸，且其中将你即3+天然杀伤T细胞递送至肝使所述多肽在肝中得以表达。一方面，本发明提供一种抑制个体器官中的免疫应答的方法，所述方法包含将一或多种NKT刺激剂以足以抑制器官中的免疫应答的量局部递送至器官。在一些实施例中， 所述方法进一步包含将TGF-β以足以抑制器官中的免疫应答的量局部递送至器官。在一些实施例中，所述免疫应答是针对抗原的免疫应答。在一些实施例中，所述免疫应答是自身免疫应答。在一些实施例中，所述器官是肠或肺。在一些实施例中，抑制免疫应答旨在治疗炎性肠病、克罗恩氏病(Crohn's disease)或哮喘。在一些实施例中，局部递送至器官是递送至粘膜组织。一方面，本发明提供一种医药组合物，其包含含有R)xp3+天然杀伤T细胞的细胞群。在一些实施例中，所述细胞群是血细胞群。在一些实施例中，所述细胞群是白细胞群。 在一些实施例中，所述细胞群是T细胞群。在一些实施例中，所述细胞群是NKT细胞群。一方面，本发明提供一种医药组合物，其包含TGF-β及一或多种NKT刺激剂。每一本发明的限制规定均能够涵盖本发明的全部各个实施例。因此，预期涉及任一要素或要素组合的每一本发明限制规定可包括于本发明的每一方面中。本发明在其应用方面不仅限于下文说明中所列举或图中所示的构造细节及组件配置。本发明可具有其他实施例且能够以各种方式来实践或实施。而且，本文中所用的措词及术语旨在说明目的而不应视为限制性的。本文中对“包括(including)，，、“包含(comprising) ”、“具有(having)”、 “含有(containing) ”、“涉及(involving) ”及其变化形式的使用意在涵盖随后所列出的项目及其等效物以及增列项目。


这些图仅用于举例说明目的，而非实现本文所揭示发明所必不可少的。图1显示iNKT细胞在TGF-β的存在下上调R)xp3表达。(a)将来自C57B1/6小鼠或R)xp3gfp基因敲入小鼠的脾的iNKT和CD4+CD25-T细胞进行FACS分选并在IL-2和 IL-15的存在下在添加或不添加TGF-β的情况下培养3天。左侧点图显示用于iNKT细胞的细胞分选的门选技术(gating strategy)、以及用空的⑶Id四聚体评估的背景对照染色。也绘示了 iNKT细胞(上部图)和在TCRβ +群中门选的⑶4T细胞(下部图)。通过在从C57B1/6小鼠分离出的iNKT(上列)和对照CD4T细胞培养物(下列)中进行细胞内染色、或通过在从i^oxpSgfp基因敲入小鼠中分离的细胞中的GFP荧光来评估R)xp3表达。 所示点图代表来自三个独立实验的一式三份培养物。(b)对来自C57B1/6小鼠(顶部)和 Foxp3gfp基因敲入小鼠(底部)的胸腺iNKT细胞进行分选，在IL-2、IL-15和TGF-β的存在下进行培养，并如所述针对你即3表达进行分析。(c) iNKT细胞对R)Xp3的表达通过聚焦显微镜检查法在单细胞水平得到证实。在培养3天后对R)Xp3gfp细胞进行FACS分选， 将其不变TCR用PE标记的⑶ld/PBS57四聚体(红色)重新染色，并将细胞核用DAPI (蓝色)进行对比染色。Foxp3表达发出绿色荧光。(d)将C57B1/6小鼠的iNKT和⑶4+⑶25-T 细胞从脾分离并在5ng/mL的IL-2和不同浓度的TGF-β的存在下培养3天。培养物设定为一式两份且结果代表三个独立实验。(e)将脾iNKT和CD4+CD25-T细胞(图未示出)和不同浓度的板结合抗-CD3 —起培养3天。所示点图代表来自三个独立实验的一式三份培养物。图2显示在不同细胞因子条件下Balb/c iNKT细胞的培养物。将iNKT细胞从 Balb/c小鼠的脾分离，根据CDld/PBS57四聚体与泛TCR-β MAb (pan TCR-β MAb)的共表达进行FACS分选，并在指定条件下用3 μ g/mL的板结合抗-⑶3刺激3天。图3显示R)xp3+iNKT细胞的表型和体内稳定性。对鼠科iNKT和⑶4+⑶25-细胞进行FACS分选，在TGF- β和IL-2的存在下培养3天并针对R)Xp3和所指示的分子进行共染色。(a和b)。所绘示的概图是iNKT或CD4-细胞区域内门选(如图6中所示而界定)。 结果代表来自至少两个独立实验的一式三份培养物。(c)在TGF-β和IL-2的存在下培养3天后来自经FACS分选iNKT细胞或CD4T细胞的R)xp3和PLZF的mRNA编码RT-PCR。每一基因的表达均是相对于EFlA表达而给出。图4显示i^oxp3+iNKT细胞的体内稳定性。将脾iNKT和CD4+CD25-T细胞从 R)Xp3gfp基因敲入小鼠分离并在TGF-β和IL-2的存在下培养3天。通过FACS来分选 R)xp3-GFP+细胞并将5X104iNKT(上部图)或⑶4+⑶25-T细胞(下部图)静脉注射入 RAG2-/"受体宿主中。21天后将这些小鼠杀死并在几个器官中对iNKT和⑶4T细胞的存在进行评估。图显示肝和混合淋巴结(pool oflymph nodes ;pLNs)中iNKT和CD4T细胞的 Foxp3和⑶25表达。只能在肝中检测到iNKT细胞。图5显示，Foxp3+iNKT细胞通过GITR介导的接触依赖机制抑制T细胞的增殖。 (a)在极化条件下从来自R)xp3gfp基因敲入小鼠的iNKT细胞和CD4T细胞体外培养物分选出Foxp3+iNKT细胞、Foxp3-iNKT细胞或iTreg细胞，并从幼稚C57B1/6小鼠分离出 nTreg细胞。将所分选出的细胞以一式三份与经丝裂霉素C处理的脾细胞和FACS分选的 ⑶4+⑶25-( “应答者”)T细胞一起以不同的比率在可溶性抗-⑶3MAb的存在下进行共培养 96小时。在最后12小时的培养中通过[3H]胸苷掺入来评估增殖。顶部图绘示来自三个独立实验(每一实验均一式三份)并根据单独的应答细胞的增殖标准化的增殖抑制平均值 (均值士SEM)。底部图显示2 1比率下(8000个调节细胞比4000个应答细胞)的代表性实验的数据。对增殖的抑制具有统计学显著性(n = 3, *Ρ < 0. 05)。(b)添加抗-GITR 而非抗-ILlOR封闭抗体消除抑制效应(n = 4，**Ρ < 0. 01)。(c)将Foxp3+iNKT细胞与如 (a)中经刺激的应答细胞一起以1 1的比率在转孔培养板中进行培养。黑色柱状图代表当这些细胞与R)xp3+iNKT细胞一起在同一孔中进行培养时的应答细胞增殖；灰色柱状图代表当这些细胞与R)xp3+iNKT细胞分开在单独的孔中培养时的应答细胞增殖，点线柱状图代表不存在调节细胞时的应答细胞增殖。百分比表示在指定闸门内三种情况的应答细胞的频率。图6显示，Foxp3+iNKT细胞的体内转变与TGF- β相关。(a)分析在从幼稚 C57B1/6小鼠的肝、混合淋巴结、派尔集合淋巴结、脾和胸腺分离的淋巴细胞中的R)xp3 表达。在淋巴细胞闸门内，通过与负载有PBS57的⑶Id四聚体和泛TCR-β抗体(pan TCR-β antibody)共染色来识别iNKT细胞。用空的⑶Id四聚体平行染色来评估每一器官的 iNKT细胞背景染色(仅显示肝的图)。(b)通过细胞内抗体染色分析R)xp3表达。R)xp3+ 细胞仅存在于⑶ld/PBS57-细胞之中。我们证实，这些R)xp3+细胞是⑶4+T淋巴细胞(右侧点图，仅显示淋巴结的图)。结果代表来自两个独立实验的三只小鼠。(c)分析R)xp3在来自C57BL/6小鼠或dnTGFi3RII小鼠的肠系膜淋巴结的iNK细胞中的表达，这些小鼠暴露至一周α-GalCer的胃内递送(在iNKT细胞上门选)。(d)分析在从慢性或急性过敏性气道疾病小鼠肺分离的iNKT或⑶4T细胞中的R)xp3表达以及家务基因EF1A。从每一动物的肺中，通过流式细胞术分选1，000至5，000个iNKT细胞，并在单个的道(lane)中绘示。因为细胞数目较少，所以将来自五只未经处理的幼稚对照小鼠的肺iNKT和CD4T细胞汇集在一起。该实验在C57B1/6小鼠和BALB/c小鼠中独立进行。图7显示，来自幼稚Balb/c小鼠和R)xp3gfp基因敲入小鼠的iNKT细胞缺乏R)xp3 表达。分析从Balb/c小鼠和R)xp3gfp幼稚小鼠的肝、混合淋巴结、派尔集合淋巴结、脾和胸腺分离的淋巴细胞中的你即3表达。在淋巴细胞闸门内，通过与负载有PBS57的⑶Id四聚体和泛TCR-β抗体共染色来识别iNKT细胞。图8显示从患过敏性气道疾病的Balb/c小鼠和C57B1/6小鼠的肺分离iNKT细胞。在指定的天数上，将由5只雌性Balb/c小鼠或C57B1/6小鼠组成的多个组用OVA-明矾(腹膜注射)敏化并用在盐水中的50yg0VA进行鼻内激发，以诱导过敏性气道疾病的慢性或急性形式。(a)诱导慢性或急性过敏性气道疾病所遵照的方案的示意图。(b)支气管肺泡灌洗(bronchoalveolarlavage ;BAL)中的嗜酸性粒细胞增多及肺中的细胞含量。(c) FACS数据，绘示来自每一实验组的一只代表性小鼠的肺中的iNKT细胞和⑶4T细胞染色，显示在双重排除(图未示出)后和定量RT-PCR分析之前的用于分选iNKT (左侧栏)和CD4T 细胞(右侧)的闸门。(d)来自慢性小鼠(上部图)、急性小鼠(中部图)和幼稚小鼠(下部图)的用苏木精/伊红染色的肺组织的组织切片。图9显示，Foxp3+iNKT细胞聚集在被保护免于遭受EAE的小鼠的颈淋巴结中。通过共同投予MOG肽和CFA及百日咳毒素在C57B1/6小鼠中诱导EAE。如别处所述，同时用 α -GalCer对一些小鼠进行治疗26。对EAE进行临床评分并对中枢神经系统浸润液以及颈淋巴结(LN)和脾的淋巴细胞群进行评价。(a)左侧图显示颈淋巴结中的iNKT群，而右侧图显示iNKT闸门内的R)xp3表达。(b)绘示iNKT细胞(顶部图)和R)xp3+iNKT细胞(底部图) 的绝对数目，每一符号对应于来自幼稚实验组、经MOG诱导的实验组及经MOG+ α -GalCer治疗的实验组的一只个别小鼠。薄横条表示平均值，而厚横条表示组间的统计显著性(η = 4 或 5，*Ρ < 0. 05)。图10显示，可在人类iNKT细胞中诱导R)xp3表达。将来自外周血的人类iNKT细胞和⑶4+T细胞以磁性方式浓集并在存在或不存在含TGF-β、抗-IL4、抗-IL12、抗-IFN-γ 和抗-OT^MAb的转变混合剂的情况下共培养5天。在淋巴细胞闸门内，通过负载有PBS57 的⑶Id四聚体和抗-TCR-Vβ 11 MAb的共染色来识别iNKT细胞(顶部)。在用空的人类 CDld四聚体的平行染色中评价iNKT细胞的背景染色(顶部左侧)。CD4T细胞在CDld/ PBS57-阴性区域(顶部右侧)门选。下部图显示Foxp3与CD25、CD127、GITR或CD161 一起在iNKT(上列)和CD4+T细胞闸门(下列)中的共表达。结果代表来自不同供血者的三个独立实验，每一情况至少有三份复制培养物。
具体实施例方式一方面，本发明提供分离的R)xp3+天然杀伤T细胞及包含R)xp3+天然杀伤T细胞的细胞群。一方面，本发明提供使用TGF-β及一或多种NKT刺激剂产生R)Xp3+天然杀伤T细胞的方法。R)xp3+天然杀伤T细胞可在体外产生，且其可在个体中原位产生。本文中指出，Foxp3+天然杀伤T细胞具有与Treg细胞类似的免疫抑制特性，且因此R)xp3+天然杀伤T细胞可用于治疗多种免疫病症及病状。Foxp3+天然杀伤T细胞一方面，本发明提供分离的R)xp3+天然杀伤T细胞及包含R)xp3+天然杀伤T细胞的分离的细胞群。天然杀伤T细胞(Natural Killer T-cell ；NKT)是衍生自胸腺的淋巴细胞，其表达识别由⑶Id分子呈递的糖脂抗原的α β TCR及NK谱系受体(包括NKl. 1及NKG2D) (19)。 天然杀伤T细胞可分为1型NKT (不变)、2型NKT及类ΝΚΤ。研究最多的NKT细胞亚群具有半不变TCR，其包含不变α-链(在小鼠中为Va 14-Ja 18，在人类中为V a M-J a 18)及有限的TCR-β链谱(在小鼠中为\^8.2、￥3 7、￥3 2，在人类中为\^11)。这些细胞被称为I型经典或不变NKT(iNKT)细胞，且在MHC I类相关分子CDld情形下能够识别糖脂。虽然具有可用于其识别的独特的几！？，但iNKT细胞与T细胞共享许多表面分子，即在小鼠中为⑶3及⑶4，且在人类中还有⑶8 (19) (20)。T细胞及NKT细胞二者均在胸腺中产生。基于其不变TCR的NKT细胞的阳性选择是由担当CDld+抗原呈递细胞的双阳性胸腺细胞来介导，而非用于常规T淋巴细胞的胸腺上皮细胞01)。NKT细胞通常视为分离自T淋巴细胞的谱系，其在分子层面上的特征在于表达谱系标记物PLZF02)。在体内发现的iNKT细胞亚群呈现与Thl细胞(产生IFN_Y)、Th2细胞(产生IL_4 及IL-13)及(最近阐述的)Thl7细胞(产生IL-17)类似的功能特性⑴(2) (3)⑷(5)。 令人感兴趣的是，由TCR刺激引起的iNKT细胞细胞因子产生似乎不受控制常规T淋巴细胞的功能专门化的相同转录因子所影响03)。一方面，本发明提供经转化以表达R)xP3的NKT细胞。在本文中，表达R)xP3的 NKT细胞称为R)xp3+NKT细胞、Foxp3+天然杀伤T细胞、Foxp3+TregNKT细胞、NKTreg细胞、 天然杀伤iTreg细胞、TregNKT细胞、Foxp3+Treg天然杀伤T细胞及R)Xp3+T调节天然杀伤 T细胞。在一些实施例中，本发明提供已转化成R)xp3+细胞的不变NKT细胞(iNKT)，在本文中也称为iNOreg。在一些实施例中，本发明提供已转化成NKT R)Xp3+细胞的非-iNKT 细胞O型NKT或类NKT细胞)。Foxp3表达通常与Treg细胞有关，且先前在NKT细胞中未发现。Treg细胞具有强效免疫抑制特性，且被认为可预防病理性自反应(即，自身免疫性疾病)及免疫病症，例如过敏症、炎性肠病、移植物抗宿主病及移植排斥。令人感兴趣的是， Foxp3+NKT细胞展示与R)xp3+Treg淋巴细胞类似的表型即CD25+、CTLA-4+及GITR+，且在功能上，其能够以与R)Xp3+Treg细胞相当的效率抑制T细胞增殖。本文所述的R)xp3+天然杀伤T细胞具有NKT表型(例如，标记物)及Treg表型 (例如，FoxP3标记物)二者。另外，本文所述的R)xp3+天然杀伤T细胞具有与Treg细胞同等的功能(抑制T细胞增殖的能力)。然而，应了解，Foxp3+天然杀伤T细胞不同于R)xp3 天然杀伤T细胞、Treg细胞以及实际上任何其他细胞类型。最低程度上，Foxp3+天然杀伤T 细胞可通过识别NKT细胞所特有的至少一种标记物及R)xP3标记物来鉴定。在一些实施例中，Foxp3+天然杀伤T细胞的特征在于结合负载有糖脂(例如a-GalCer)的⑶Id的能力， 且具有标记你计3。下文进一步介绍用于测定各种NKT细胞与⑶Id的结合的特异性分析以及分析中所用的各种配体。在一些实施例中，Foxp3+天然杀伤T细胞具有以下标记表型中的任一者或任一组合CD25+、CTLA-4+、GITR+、CD103+、IL7_Ra -、CD27-、CD62L-、NKl. 1_、 DX5-、NKGD2+及PLZF+。Foxp3+天然杀伤T细胞可为CD4+或CD4-。应了解，并非所有这些标记物都必须存在于拟分类为R)xp3+NKT细胞的细胞上。诱导iNKT细胞上的R)xp3表达与上调同样由i^oxpS+I^reg细胞表达的一组基因配合。在功能上，Foxp3+NKT细胞展示较强的调节潜力。然而，T细胞-特异性表型的采用并非绝对的，其中Foxp3+NKTreg细胞保留一些区别性特征。例如，Foxp3+iTreg的⑶62L表达不均一，表明一些细胞保留通过高内皮小静脉(high endothelial venule ；HEV)再循环至次级淋巴器官的能力。相比之下，NKTreg细胞缺少⑶62L，且因此将限于干扰外周中的免疫情况。
应了解，R)xp3+天然杀伤T细胞可通过功能分析予以表征。Foxp3+NKT细胞已失去以与NKT细胞相同的量及组成分泌细胞因子的能力。R)xp3+天然杀伤T细胞具有与Treg细胞相同的免疫抑制特性。细胞的免疫抑制特性可通过(例如)细胞抑制经刺激CD4+CD25-应答细胞增殖的能力来测量。据认为，Foxp3+NKT细胞的免疫抑制功能由 GITR-GITRL相互作用来介导，这是因为阻断此相互作用导致免疫抑制特性消除。本发明涵盖分离的R)xp3+天然杀伤T细胞、仅由R)xp3+天然杀伤T细胞组成的细胞群及包含 ^οχρβ+天然杀伤T细胞的细胞群。当关于细胞或细胞群时，术语“分离的” 是指不在个体(即，人类或非人类动物)中的细胞或细胞群。在一些实施例中，所述细胞与其他细胞充分分开或细胞数目相对于其他细胞增加，使得可根据本文所述方法确认其身份并测试或利用其特性。例如，分离的细胞或细胞群已自个体收获，在体外生长或已自其他细胞产生。在一些实施例中，包含R)xp3+天然杀伤T细胞的细胞群具有至少0. 001 %、至少 0. 01%、至少0. 05%、至少0. 1%、至少0. 5%、至少1%、至少5%、至少10%、至少20%、至少30 %、至少40 %、至少50 %、至少60 %、至少70 %、至少80 %、或至少90 %的R)xp3+天然杀伤T细胞。在一些实施例中，包含R)xp3+天然杀伤T细胞的细胞群具有至少1个、至少 10个、至少50个、至少100个、至少500个、至少1，000个、至少5，000个、至少10，000个、 至少50，000个、至少100，000个、至少Ix IO6个、至少Ix IO7个、或至少IxlO8个Foxp3+天然杀伤T细胞。细胞群中的其余细胞(即，非R)xP3细胞)可为任何性质。因此，例如，本发明涵盖你即3+天然杀伤T细胞与R)xP3_天然杀伤T细胞的群、Foxp3+天然杀伤T细胞与T细胞(属于任一亚类)的群。在一些实施例中，所述细胞群是R)xp3+天然杀伤T细胞与血细胞(属于任一亚类，例如红细胞)的组合。在一些实施例中，所述细胞群是 ^οχρβ+ 天然杀伤T细胞与非血细胞的组合。在一些实施例中，所述细胞群是R)Xp3+天然杀伤T细胞、血细胞及非血细胞的组合。本发明涵盖 ^οχρβ+天然杀伤T细胞及包含任何来源(例如， 动物，例如人类或小鼠)或得自任何组织(例如，脾、胸腺等)的你@3+天然杀伤T细胞的细胞群。Foxp3+天然杀伤T细胞的产生一方面，本发明提供产生R)xp3+天然杀伤T细胞的方法。在一些实施例中，产生 Foxp3+天然杀伤T细胞的方法包含使包含天然杀伤T细胞的细胞群与足以产生R)xp3+天然杀伤T细胞的量的TGF-β与一或多种NKT刺激剂的组合接触。在一些实施例中，也使所述细胞群与IL-2接触。在一些实施例中，也使所述细胞群与IL-7、IL-15及/或IL-21接触。在一些实施例中，也使所述细胞群与中和抗体抗-IFN γ、抗-IL-4、抗-IL-6、抗-IL12 及/或抗-IL-27接触。在一些实施例中，所述细胞群是血细胞群、白细胞群、T细胞群或天然杀伤T细胞群。在一些实施例中，所述细胞群收获自个体。本文介绍自R)xP3-天然杀伤T细胞(即，“规则(regular) "NKT细胞)产生R)xp3+ 天然杀伤T细胞的方法。在一些实施例中，R)Xp3+天然杀伤T细胞的产生是在体外实施。 在一些实施例中，Foxp3+天然杀伤T细胞的产生是在体内。在一些实施例中，Foxp3+天然杀伤T细胞的产生是在特定解剖学位置(例如，器官)原位实施。产生R)xp3+细胞的NKT 细胞可为任何来源。在一些实施例中，NKT细胞是鼠科动物细胞。在一些实施例中，NKT细胞是人类细胞。在一些实施例中，NKT细胞收获自肝、脾及胸腺。在一些实施例中，NKT细胞收获自血液。
本文介绍的产生R)Xp3+天然杀伤T细胞的方法最低程度上包含使NKT细胞与一或多种NKT刺激剂及TGF- β接触。本发明涵盖使用导致R)xP3在经刺激NKT细胞中表达的任何TGF- β或TGF- β类似物。因此，用于产生你即3+天然杀伤T细胞的TGF-β包括三种TGF-β同种型中的每一者(TGF-β 1、TGF-β 2、TGF-β 3)、TGF-β的蛋白质前体及成熟的TGF-β。本文所用的 TGF-β还包括变体TGF-β及具有与TGF-β类似功能的TGF-β类似物(例如，细胞调节素-IO(Cytomodulin-IO))。本发明还涵盖使用分泌TGF-β的细胞。另外，应了解，一些器官天然地富集TGF-β，且任选地不投予额外TGF-β来在所述器官中体内产生R)xp3+天然杀伤T细胞。天然地富集TGF-β的器官包括肠及肺、骨髓、肝及含有某些癌细胞的器官。应了解，并非器官中的所有细胞都需要富集TGF-β以提供TGF-β富集环境而容许NKT细胞转化成你即3+阳性细胞。然而，在TGF-β富集器官中产生R)xp3+天然杀伤T细胞仍然需要投予一或多种NKT刺激剂。在一些实施例中，自NKT细胞产生R)Xp3+NKT细胞的条件包括将所述细胞暴露于至少lng/ml TGF-β、至少2ng/ml TGF-β、至少3ng/ml TGF-β、至少 4ng/ml TGF-β、至少 5ng/ml TGF-β、至少 10ng/ml TGF-β、至少 lOOng/mlTGF-β、至少 1 微克/ml TGF-β或至少10微克/ml TGF-β。在一些实施例中，Foxp3+NKT细胞的产生是在体外实施且TGF-β的浓度为至少lOng/ml。TGF-β的浓度最低程度上取决于包含NKT 细胞的细胞群的组成的性质以及NKT细胞的性质。在所有实施例中，导致在NKT细胞中表达R)XP3的TGF-β浓度较佳。所属领域的技术人员可容易地确定R)xP3是否表达并(如果需要)调节TGF-β的浓度。NKT细胞刺激剂已为所属领域的技术人员所习知，且包括可由⑶Id呈递的任何糖脂(例如α-GalCe)以及可作用于受体下游路径的任何药剂，例如抗_CD3抗体。NKT刺激剂包括抗-CD3抗体、植物血凝素(phytohemaglutinin ；PHA)、伴刀豆球蛋白A(concanavalin A ；ConA)、佛波醇 12-肉豆蔻酸酯 13-乙酸酯(phorbol 12-myristate 13-acetate ；PMA)、 离子霉素(ionomycin)及TCR激动剂，例如载有配体(CDld配体，包括α-GalCer、PBS57、 GSL-1、0CH及其他配体)的⑶Id四聚体。可由⑶Id呈递的所有糖脂均可用作NKT刺激剂。 此外，存在诸多可刺激NKT细胞的糖脂类似物。NKT刺激剂还可在功能分析中予以识别。例如，可将NKT细胞与抗原呈递细胞及推定的刺激剂一起培养，且可通过评价NKT细胞是否分泌诸如IL-2、IL-4及IFN-Y等细胞因子针对刺激对NKT细胞进行分析。可通过例如使 NKT细胞与固定的抗-CD3抗体接触或通过向NKT细胞的生长培养基中添加NKT刺激剂来刺激NKT细胞以在体外产生R)xp3+NKT细胞。另外，也可将载有这些NKT刺激剂中任一者的抗原呈递细胞与NKT群混合。体内NKT细胞的刺激可通过向个体投予NKT刺激剂(例如 α -GalCer)来实施。应了解，也可将NKT细胞暴露于多种NKT刺激剂。NKT刺激剂的浓度最低程度上取决于NKT刺激剂的性质、NKT细胞的性质以及包含NKT细胞的细胞群的组成。 在所有实施例中，导致NKT细胞受刺激的NKT刺激剂浓度较佳。所属领域的技术人员可容易地确定NKT细胞是否受刺激并(如果需要)调节NKT刺激剂的浓度。在一些实施例中，除TGF-β及一或多种NKT刺激剂外，还使NKT细胞与IL-2接触。本文所用的IL-2是指IL-2及具有与IL-2类似的生物功能的任何变体。本文所用的与IL-2接触不限于特定的IL-2种类或特定的IL-2变体。因此，可使人类NKT细胞与非人类IL-2接触，只要非人类IL-2可交叉反应。此外，已阐述IL-2的功能变体(例如，包括
11氨基酸突变，例如R38A或F42K)，且本发明也涵盖这些变体以及IL-2及这些IL-2变体的功能片段。在一些实施例中，将细胞暴露于至少5ng/ml浓度的IL-2。在一些实施例中，除 TGF-β、一或多种NKT刺激剂及视情况IL-2外，也向NKT细胞中添加一或多种细胞因子或细胞因子-中和抗体。在一些实施例中，使NKT细胞与IL-7、IL-15及/或IL-21或其功能变体及类似物接触。在一些实施例中，使NKT细胞与抗-IFN γ、抗-IL-4、抗-IL-6、抗-IL12 及抗-IL-27接触。应了解，细胞因子及细胞因子-中和抗体的浓度及组合可有所变化，这取决于NKT细胞的性质(例如，鼠科动物或人类)、NKT细胞的来源(例如，得自胸腺、得自血液)、包含NKT细胞的细胞群的组成、或所用细胞因子或中和抗体的性质。例如，在主要包含 NKT细胞的细胞群或主要包含非NKT血细胞及仅少量NKT细胞的细胞群中，细胞因子及中和抗体的组合及浓度可不同。所属领域的技术人员可根据本文所介绍的方法来调节细胞因子及细胞因子-中和抗体的组合及浓度，以达到期望的R)xp3+NKT细胞水平。在一些实施例中，NKT细胞是人类细胞，且将人类NKT细胞暴露于至少lOng/ml TGF-β、至少5微克/ml 抗-IL12、至少5微克/ml抗-IL-4、至少5微克/ml抗-IFN- γ、至少2微克/ml抗-⑶观及 20U/ml IL-2。Foxp3+NKT细胞可自包含至少一 NKT细胞的任何细胞群产生。例如，Foxp3+NKT可自包含介于0，001%与之间的NKT细胞的外周血产生。在一些实施例中，外周血收获自个体。在一些实施例中，使外周血与引起你计3NKT细胞产生的NKT刺激剂及TGF- β接触。即使仅有较小百分比的血细胞是NKT 细胞，通过暴露于NKT刺激剂来选择性刺激NKT细胞也将增加血细胞群中NKT细胞的数目且由此增加所产生的 ^οχρβ+ΝΚΤ细胞群。在一些实施例中，在使细胞经受TGF-β及NKT刺激剂处理之前，纯化或冲洗血细胞群。每一纯化步骤均可将不含有NKT细胞的细胞群移除， 且因此剩余部分中NKT细胞的百分比将增加。例如，可对血液实施离心并冲洗细胞以移除可溶性物质。同样，可纯化血液以仅仅分离出白细胞(其包含NKT细胞)，且可随后使白细胞经受TGF-β及NKT刺激剂处理，以将白细胞群内的NKT细胞转变成R)xp3+NKT细胞。类似地，可进一步纯化血液以仅仅分离出T细胞及包含NKT细胞的T细胞群。可随后使T细胞与TGF-β及NKT刺激剂接触。在一些实施例中，自血细胞群纯化NKT细胞，且仅使(基本上)NKT细胞群经受TGF- β及NKT刺激剂处理。NKT细胞及包含NKT细胞的细胞群(例如T细胞)也可自非血液来源获得。在一些实施例中，NKT细胞收获自脾或胸腺或任何其他器官。在一些实施例中，自器官收获细胞群(例如，T细胞)并随后将其暴露于TGF-β及 NKT刺激剂。如果需要，可在暴露于TGF-β及NKT刺激剂之前自收获自器官的细胞群纯化 NKT细胞。应了解，也可颠倒R)xp3+NKT细胞的纯化及产生步骤。因此，可使血细胞群与 TGF-β及NKT刺激剂接触，且可随后自其余血细胞纯化R)xp3+NKT细胞或所有NKT细胞 (Foxp3+NKT 细胞及 FoxP3-NKT 细胞)。对于R)xp3+NKT细胞的产生方法，本发明并不限于特定产率。在一些实施例中，至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%的NKT细胞转变成R)xp3+NKT细胞。在一些实施例中，至少40%的NKT细胞转变成 R)xp3+NKT细胞。应了解，Foxp3+NKT细胞的产率至少取决于NKT细胞的性质(例如，自来人类还是小鼠，得自器官还是得自血液)及包含NKT细胞的细胞群。还应了解，Foxp3+NKT细胞的最终百分比将取决于细胞群中NKT细胞的初始百分比。因此，仅具有介于0，001%与 1 %之间的NKT细胞的血细胞群可仅包含少数几个NKT细胞，且因此在NKT刺激剂及TGF- β 暴露结束后，可仅包含较小百分比的R)xp3+NKT细胞。然而，NKT细胞的百分比可能高于最初的0，001 %至1 %，这是因为仅NKT细胞受到刺激，且因此NKT细胞将以比存在于细胞群中的任何其他细胞要快的速率生长。一方面，本发明提供自包含一或多个R)xp3+天然杀伤T细胞的细胞群开始增加 Foxp3+天然杀伤T细胞数目的方法。在一些实施例中，所述方法包含使包含至少一 R)xp3+ 天然杀伤T细胞的细胞群与足以增加R)xp3+天然杀伤T细胞数目的量的TGF- β、一或多种 NKT刺激剂、一或多种增殖诱导细胞因子与一或多种中和抗体的组合接触。应了解，此方案可对单独R)xp3+天然杀伤T细胞群、或包含R)xp3+天然杀伤T细胞及其他细胞的细胞群实施。如果细胞群包含非R)xp3+NKT细胞，则可能的情形是大量NKT细胞将转变成R)xp3+ 天然杀伤T细胞，随后可将其扩增。因此，刺激包括R)xp3+天然杀伤T细胞及非R)xp3+天然杀伤T细胞的细胞组合物实际上是通过增殖与转变来增加R)xp3+天然杀伤T细胞数目的组合。在一些实施例中，增殖诱导细胞因子是IL-2、IL-7、IL-15及/或IL-21。在一些实施例中，中和抗体是抗-IFN γ、抗-IL-4、抗-IL-6、抗-IL-12及/或抗-IL-27。应了解， 增殖诱导细胞因子及中和抗体的期望最佳组合及浓度将取决于细胞群中你@3+天然杀伤 T细胞的性质、Foxp3+天然杀伤T细胞的百分比及非R)xp3+天然杀伤T细胞的性质。在一些实施例中，1^0即3+天然杀伤T细胞的数目增加至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少50 倍、至少100倍、至少200倍、至少500倍、至少1000倍、至少10，000倍、至少100，000倍、 至少IO6倍、至少IO7倍。应了解，本发明包括增加NKT细胞数目、增加R)Xp3+天然杀伤T细胞数目的方法与将NKT细胞转变成R)Xp3+天然杀伤T细胞的方法的组合。因此，例如，R)xp3+天然杀伤T细胞群可通过扩增NKT细胞群、随后将NKT细胞转变成R)xp3+天然杀伤T细胞并扩增 Foxp3+天然杀伤T细胞来产生。Foxp3+NKT细胞的免疫抑制特性本文中指出Foxp3+NKT细胞具有与Treg细胞类似的免疫抑制特性。Treg细胞呈 Foxp3+,已显示其可有效地预防移植排斥、移植物抗宿主病(graft versus host disease ； GVHD)、过敏性疾病、自身免疫及其他基于炎症的病状(24)。事实上，所述报导为目前正在实施的R)xp3+Treg细胞临床试验提供了理由0 。假定R)xp3+NKTreg细胞与R)xp3+Treg 细胞具有类似的功能特征，预期它们应具有相同的临床应用潜能。另外，由于NKTreg具有不变TCR，所以NOreg细胞优于Treg细胞。包含不变TCR的细胞比不具有不变TCR的细胞 (例如iTreg细胞)可更容易地加以分离及刺激。NKTreg细胞不变特异性的结果是抗原非特异性免疫调节。因此，相对于抗原特异性作用，Foxp3+NKTreg细胞可能具有普遍免疫抑制作用，且可能对于施加Treg细胞所要实现的治疗目的有用。多克隆Treg细胞群可能具有(至少部分)类似的非特异性免疫抑制效应，这可能缘于与自身抗原的交叉反应性06)。正是此非特异性效应作为Treg抑制淋巴细胞减少驱动的增殖及预防移植物抗宿主病GVHD的基础07，观)。GVHD是容许基于Treg 的干预的一种临床疾病，且已针对此疾病开始Treg临床试验09-32)。器官移植也可受益于基于Treg的表观非特异性调节以预防移植物排斥(33，34)。可能的情形是，通过提供一定程度的非特异性抑制，天然的抗原特异性调节机制有机会将免疫应答重新设定为耐受。将R)Xp3+NKT细胞递送至肝及肺的方法一方面，本发明提供将R)xp3+天然杀伤T细胞递送至肝的方法及抑制肝中免疫应答的方法。一方面，本发明提供将你@3+天然杀伤T细胞递送至肺的方法及抑制肺中免疫应答的方法。一方面，本发明提供将i^Xp3+天然杀伤T细胞递送至粘膜组织的方法及抑制粘膜组织中免疫应答的方法。在上述实施例中，所述方法包含向个体全身投予你@3+天然杀伤T细胞。在一些实施例中，R)xp3+天然杀伤T细胞是自体细胞。在一些实施例中，通过使天然杀伤T细胞与足以产生R)xp3+天然杀伤T细胞的量的NKT细胞刺激剂及TGF- β 接触来产生你即3+天然杀伤T细胞。在一些实施例中，以有效抑制肝中免疫应答的量投予你即3+天然杀伤T细胞。在一些实施例中，以有效诱导能够抑制粘膜(例如肠或肺)中免疫应答的足量你即3+天然杀伤T细胞的量投予NKT细胞刺激剂或TGF- β。在一些实施例中，抑制肝中的免疫应答旨在治疗移植物抗宿主病、与胰岛移植有关或由其引起的不期望免疫应答、与肝移植有关或由其引起的不期望免疫应答或免疫介导的肝炎症。在一些实施例中，免疫介导的肝炎症是自身免疫性肝炎、原发性胆汁性肝硬化或脂肪性肝炎。在一些实施例中，R)xp3+天然杀伤T细胞与胰岛移植或肝移植结合投予。在一些实施例中，Foxp3+ 天然杀伤T细胞的基因组包含编码多肽的核酸，其中将R)xp3+天然杀伤T细胞递送至肝使所述多肽在肝中得以表达。本文中令人惊奇地发现，在将R)xp3+NKTreg细胞静脉内递送至个体体内后，聚集在肝中(而非聚集在淋巴结中)的iNKT细胞使R)xp3表达保持稳定。也在肺粘膜组织内及脾中(在投予后最初)发现一些R)Xp3+NKTreg细胞。因此，在一个实施例中，本发明提供将R)xp3+天然杀伤T细胞递送至肝、肺或脾的方法，其包含全身投予R)Xp3+天然杀伤T 细胞。然而，应了解，也可将你即3+天然杀伤T细胞通过局部投予直接投予至肝、肺或脾。 在一些实施例中，将你即3+天然杀伤T细胞递送至肝的方法包含使包含天然杀伤T细胞的细胞群与足以产生你即3+天然杀伤T细胞的量的一或多种NKT细胞刺激剂及TGF- β接触。 随后全身投予 ^οχρβ+天然杀伤T细胞。在一些实施例中，投予包含R)xp3+天然杀伤T细胞的医药组合物。在一些实施例中， ^οχρβ+天然杀伤T细胞是自体细胞。因此，在一些实施例中，所述方法包含自个体收获血液并使血细胞群与足以产生你即3+天然杀伤T细胞的量的一或多种NKT细胞刺激剂及TGF-β接触，且随后向个体投予现已包含R)xp3+天然杀伤T细胞的血细胞群。应了解，可在与一或多种NKT细胞刺激剂及TGF-β接触之前对血细胞群实施纯化或浓集以增加NKT细胞的数目。另外，也可在产生R)xp3+天然杀伤T细胞后纯化细胞群，以提高你即3+天然杀伤T细胞的百分比。在一些实施例中，在投予之前扩增R)Xp3+天然杀伤T细胞。R)xp3+天然杀伤T细胞寻靶至肝及肺的能力容许在肝及肺中实施通过利用你即3+天然杀伤T细胞的固有特性(即，免疫抑制能力)的治疗方法。当期望抑制肺及/ 或肝中的免疫应答时，可全身投予(例如通过静脉内投予)Foxp3+天然杀伤T细胞。另外， Foxp3+天然杀伤T细胞寻靶至肝及肺的能力也使得能够利用这些细胞的寻靶特性将由这些细胞产生或这些细胞中所含有的重组多肽及/或其他药剂递送至肺及肝。因此，NKTreg 细胞为免疫介导的肝病提供了细胞疗法不仅对于肝自身免疫或肝移植，而且将肝用作免疫特权部位以沉积免疫原性细胞或分子(即，胰岛移植或基因疗法)。此外，肝特异性作用降低了与全身免疫抑制有关的脱靶效应。iNKTreg细胞的肝特异性聚集也对治疗肝炎症 (例如与移植有关)、自身免疫性疾病、病毒有关的炎性变化、脂肪性肝炎及肝中毒具有治疗用途。在一些实施例中，以有效抑制肝中免疫应答的量投予你即3+天然杀伤T细胞，其中抑制肝中的免疫应答旨在治疗移植物抗宿主病、与胰岛移植有关或由其引起的不期望免疫应答、与肝移植有关或由其引起的不期望免疫应答或免疫介导的肝炎症。在一些实施例中，Foxp3+天然杀伤T细胞与胰岛移植或肝移植结合投予。应了解，在一些实施例中，R)Xp3+天然杀伤T细胞的寻靶特性被改变。拟投予的 Foxp3+天然杀伤T胞可配备有助于细胞寻靶至特定器官的细胞器官标记物(例如，细胞表面蛋白)，例如肾标记物或肠标记物。器官标记物已为所属领域的技术人员所习知，而且修饰R)Xp3+天然杀伤T细胞以包括标记物的方法(例如，通过在细胞基因组中引入编码标记物的核酸)也已习知。因此，在一个实施例中，本发明提供包含细胞表面蛋白的 ^οχρβ+天然杀伤T细胞。在一些实施例中，包含细胞表面蛋白的R)Xp3+天然杀伤T细胞是通过将编码细胞表面蛋白的核酸引入至 ^οχρβ+天然杀伤T细胞的基因组中来产生。将药剂及多肽递送至肝及肺递送具有免疫抑制特性的R)xp3+天然杀伤T细胞容许产生免疫特权部位(肝或肺)而无全身免疫抑制。此发现可在治疗上与其他免疫原性治疗法组合利用以将此类免疫原性治疗法安全递送至肝中，例如通过门静脉或通过直接投予。实例是用于治疗糖尿病的胰岛移植(通常通过门静脉给予)及细胞产生可溶性产物的其他细胞替代疗法(例如用于凝血功能障碍的凝血因子、或用于治疗溶酶体贮积症的酶替代疗法)。一方面，本发明提供将药剂(例如，治疗剂、多肽、诊断剂)递送至肝或肺的方法。 在一个实施例中，所述方法包含修饰你@3+天然杀伤T细胞，使得其能够将药剂递送至肝或肺。修饰可通过(例如)将药剂附着至你即3+天然杀伤T细胞的细胞表面蛋白或细胞表面糖来实施。另外，可对你即3+天然杀伤T细胞的基因组实施修饰以包括编码多肽的核酸，所述多肽在你即3+天然杀伤T细胞迁移至肝或肺时会表达。因此，在一个实施例中，本发明提供将多肽递送至肝或肺的方法，其包含对你即3+天然杀伤T细胞的基因组实施修饰以纳入编码多肽的核酸，及投予包含经修饰基因组的R)xp3+天然杀伤T细胞，其中投予 Foxp3+天然杀伤T细胞使得R)Xp3+天然杀伤T细胞递送至肝或肺，进一步使得在肝或肺中表达所述多肽。在一些实施例中，递送至肝的多肽是代谢酶。因此，在一个实施例中，本发明提供治疗溶酶体贮积症的方法，其通过将功能代谢酶递送至肝并由此补偿患有溶酶体贮积症的个体中缺乏的代谢酶来实施。在一个实施例中，递送至肝的多肽是在血液内稳态中起作用的多肽(例如，凝血因子)。因此，在一个实施例中，本发明提供通过将在血液内稳态中起作用的功能多肽递送至肝来治疗血液疾病的方法。在一些实施例中，递送至肺的多肽是酶。因此，在一个实施例中，本发明提供用于可通过投予治疗性多肽予以治疗的肺病的方法。例如，可递送阿法淀粉酶来治疗囊性纤维化。在一些实施例中，使用自体细胞将药剂(例如多肽)递送至肝或肺。自体细胞将被身体识别为“自身”，由此防止任何不期望的免疫效应。在一个实施例中，自个体收获血细胞，且视情况实施纯化以增加NKT细胞的数目。随后修饰NKT细胞以将药剂附着至细胞或将编码期望多肽的核酸纳入至细胞基因组中。修饰NKT细胞后，使细胞与TGF-β及NKT刺激剂接触，以将细胞转变成你@3+天然杀伤T细胞。随后可向个体投予包含附着药剂或编码多肽的核酸的经修饰你即3+天然杀伤T细胞以将经修饰细胞递送至肝或肺。应了解，也可改变步骤的顺序。例如，可首先将NKT细胞转变成R)xp3+天然杀伤T细胞且随后实施修饰以纳入核酸或药剂。器官特异性免疫应答一方面，本发明提供在特定解剖学部位(例如器官)中原位产生R)xp3+天然杀伤 T细胞的方法以及抑制这些部位中免疫应答的方法。一方面，本发明提供抑制个体器官中的免疫应答的方法，所述方法包含将一或多种NKT细胞刺激剂以足以抑制器官中免疫应答的量局部递送至器官。在一些实施例中，所述方法进一步包含将TGF-β以足以抑制器官中免疫应答的量局部递送至器官。在一些实施例中，所述免疫应答是针对抗原的免疫应答。在一些实施例中，所述免疫应答是自身免疫应答。在一些实施例中，所述器官是肠。在一些实施例中，抑制免疫应答旨在治疗炎性肠病。在一些实施例中，局部递送至器官是递送至粘膜组织。在一些实施例中，局部递送至器官是递送至肺粘膜组织。在一些实施例中，在投予一或多种NKT细胞刺激剂后，若产生R)xp3+NKT细胞的身体部位含有足量驱动其产生的TGF- β， 则在身体内产生 ^οχρβ+ΝΚΤ细胞。在一些实施例中，在投予TGF-β后，若产生R)xp3+NKT细胞的身体部位含有足量驱动其产生的NKT细胞刺激剂，则在身体内产生R)xp3+NKT细胞。一方面，本发明提供一种通过将一或多种NKT细胞刺激剂以足以抑制器官中免疫应答的量局部递送至器官来在个体器官中原位产生你即3+天然杀伤T细胞的方法。将一部分局部递送至特定器官的方法已为所属领域的技术人员所习知，且在下文更详细地阐述。 例如，本文中指出，在富集TGF-β的环境中在胃内递送NKT细胞激动剂α-半乳糖苷基神经酰胺(a -Galactosylceramide ； α -GalCer)后，可在肠中诱导 NKTreg 细胞。富集 TGF-β 的其他器官实例是肺、肝、骨髓及某些癌细胞。应了解，并非这些器官中的所有细胞都富集 TNF-β。并非所有器官都富集TGF-β，且不富集TGF-β的器官中R)xp3+天然杀伤T细胞的原位产生可通过向器官局部投予TGF-β及一或多种NKT细胞刺激剂来实施。当然也可将TGF-β与NKT刺激剂的组合递送至富集TGF-β的器官。在天然存在足够浓度的NKT刺激剂的器官中，原位产生你即3+天然杀伤T细胞仅需要投予TGF-β。当然也可将TGF-β 与NKT刺激剂的组合递送至富集NKT刺激剂的器官。在特定解剖学部位(例如器官)中自NKT细胞原位产生R)xp3+天然杀伤T细胞使得能够在所述器官中诱导免疫抑制效应而不抑制其他器官中的免疫应答。因此，例如，本文所述方法可用于治疗肠免疫相关病症(例如，克罗恩氏病、炎性肠病、溃疡性结肠炎)、肝免疫相关病症(例如自身免疫性肝炎、原发性胆汁性肝硬化、非酒精性及酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic and alcoholic steato-h印atitis ;NASH及 ASH)、肝硬化、丙型肝炎病毒及乙型肝炎病毒(hepatitis C virus and hepatitis B virus ；HCV 及 HBV))、肺免疫相关病症(例如，哮喘)、中枢神经系统炎症及关节炎。局部产生免疫抑制性i^Xp3+天然杀伤 T细胞也使得能够抑制拟实施移植手术的任何器官或部位中的免疫应答。Foxp3+天然杀伤T细胞的检测Foxp3+天然杀伤T细胞的特征在于能够结合⑶Id分子呈递的糖脂且具有标
16记物R)Xp3+。II型NKT细胞可通过细胞与负载有硫脑苷脂的⑶Id四聚体的结合来鉴定(参见例如，J Exp Med. 2004年4月5日；199 (7) :947-57)。I型NKT细胞也称为不变NKT细胞，其可通过与负载有以下化合物中的一种化合物的CDld四聚体的结合来鉴定α-半乳糖苷基-神经酰胺(α-GalCer)、PBS-57、OCH、GSL-1、异红细胞三己糖基神经酰胺(isoglobotrihexosylceramide ；iGb3), α-C-半乳糖苷基神经酰胺。也参见(http//www. bdbiosciences. com/external_f iles/pm/doc/tds/dimerx/1ive/web_ enabled/557764, pdf)。I型NKT细胞也可借助其不变标记物予以鉴别。CDld分子是非经典MHC分子，其特征是非多形、种类保守且具有窄而深的疏水性配体结合袋。这些结合袋能够将糖脂及磷脂呈递至天然杀伤T (Natural Killer T ；NKT)细胞。表征最充分的CDld配体是α-半乳糖苷基神经酰胺(a-GalCer)，其最初得自海洋海绵提取物。⑶Id分子呈递α -GalCer导致NKT细胞识别及快速产生大量IFN- γ及IL_4， 使得α-GalCer具有治疗功效。近来，溶酶体鞘脂异红细胞三己糖基神经酰胺(WM)已被确认为⑶Id配体。认为此内源性鞘脂引起NKT细胞产生。ftOlmmime提供荧光标记的小鼠CDld四聚体，出于方便起见其预负载有α-GalCer，或者是空白的以负载使用者选择的配体。四聚体CDld-脂质复合物结合具有特定特异性的NKT细胞的TCR(由所使用的脂质配体决定)，此容许通过流式细胞术来识别及列举限于CDld的抗原特异性NKT细胞。针对细胞内细胞因子(例如IFN- y /IL-2)及/或表面标记物(例如CD69)实施额外共染色可获得关于抗原特异性亚群的功能数据。PBS-57是Paul Savage博士及同事最近研发的α -半乳糖苷基神经酰胺类似物。 三个独立的实验室已指出，PBS-57的活性与a_半乳糖苷基神经酰胺无差别。NIH Tetramer Facility提供与CDld单体或四聚体复合的PBS-57配体。OCH是具有截短侧链的α -半乳糖苷基神经酰胺类似物，其在天然杀伤T细胞中刺激偏向Th2的细胞因子产生。已显示此配体在动物模型中延迟实验性自身免疫性脑脊髓炎发作。也可获得纯化的OCH配体以在体外刺激NKT细胞或用于体内动物研究。将OCH溶解在Tween/蔗糖/组氨酸缓冲液中，无菌过滤，放置于高压釜处理的小瓶中，并冻干。所得粉末可在水中以0. 2mg/mL的最终浓度重构。最新研究显示，来自鞘氨醇单胞菌科(Sphingomonadaceae)细菌家族的糖脂能够通过将配体呈递于⑶Id分子上而刺激天然杀伤T细胞。GSL-I与PBS-57及α -半乳糖苷基神经酰胺结构类似。也可获得纯化的GSL-I配体以在体外刺激NKT细胞或用于体内动物研究。将GSL-I溶解于Tween/蔗糖/组氨酸缓冲液中，无菌过滤，放置于高压釜处理的小瓶中，并冻干。所得粉末可在水中以0. 2mg/mL的最终浓度重构。α -半乳糖苷基神经酰胺的α _C_半乳糖苷基神经酰胺类似物是天然杀伤T细胞的强效刺激剂，且已显示可保护动物免于遭受某些感染及癌症。NKT细胞的刺激本发明提供转变NKT细胞及扩增NKT (包括R)Xp3+NKT细胞)细胞群的方法。刺激NKT细胞的方法已为所属领域的技术人员所习知，且包括使细胞与一或多种以下NKT刺激剂接触抗-CD3抗体(结合板或在另一表面上，例如珠粒；抗原呈递细胞可以溶解)、植物血凝素(Phytohemaglutinin ；PHA)、伴刀豆球蛋白 A (Concanavalin A ；ConA)、佛波醇 12 肉豆蔻酸酯13-乙酸酯(PMA)+离子霉素、上文所述的⑶Id呈递的特异性配体以及添加至具CDld细胞(或涂敷CDld的珠粒)的配体。存在大量的也可刺激NKT细胞的糖脂类似物 (例如α-GalCer)。应了解，也可使用NKT刺激剂的组合来接触细胞。免疫病症在一个实施例中，本发明提供产生具有免疫抑制特性的细胞的方法。在一个实施例中，本发明提供使用这些细胞治疗免疫病症的方法。本文所用的免疫病症包括具有不期望免疫应答(包括自身免疫应答及针对过敏原的免疫应答)的任何疾病或病症。本文所用的免疫病症还包括在移植(包括器官移植)及引入任何期望的非自身实体(例如，细胞及蛋白质，例如用于替代疗法中)情形下发生或由其引起的不期望免疫应答。免疫病症包括但不限于全身性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus ;SLE)、 干燥综合征(Sjogren' s syndrome)、类风湿性关节炎、青少年发作型糖尿病、韦格纳氏肉芽肿病(Wegener' s granulomatosis)、炎性肠病、多发性肌炎、皮肌炎、多发性内分泌衰竭、施密特氏综合征(Schmidt' s syndrome)、自身免疫性葡萄膜炎、阿狄森氏病 (Addison' s disease)、肾上腺炎、格雷夫斯病(Graves' disease)、甲状腺炎、桥本甲状腺炎(Hashimoto' s thyroiditis)、自身免疫性甲状腺疾病、恶性贫血、胃萎缩、慢性肝炎、类狼疮性肝炎、动脉粥样硬化、早衰性痴呆、脱髓鞘疾病、多发性硬化、亚急性皮肤红斑狼疮、甲状旁腺功能减退症、德雷斯勒综合征(Dressier' s syndrome)、重症肌无力、 自身免疫性血小板减少、特发性血小板减少性紫癜、溶血性贫血、寻常天疱疮、天疱疮、疱疹样皮炎、斑秃、类天疱疮、硬皮病、进行性全身性硬化、CREST综合征(钙质沉着症、雷诺现象(Raynaud' s phenomenon)、食管活动不良、指端硬化、及毛细管扩张)、成年发作型糖尿病(II型糖尿病)、男性及女性自身免疫性不育、强直性脊柱炎、溃疡性结肠炎、克罗恩氏病、混合性结缔组织病、结节性多动脉炎、全身性坏死性血管炎、青少年发作型类风湿性关节炎、肾小球肾炎、特应性皮炎、特应性鼻炎、古德帕斯丘综合征(Goodpasture' s syndrome)、恰加斯氏病(Chagas' disease)、结节病、风湿热、哮喘、复发性流产、抗-磷脂综合征、农民肺(farmer' s lung)、多形红斑、心切开术后综合征(post cardiotomy syndrome)、库兴氏综合征(Cushing' s syndrome)、自身免疫性慢性活动性肝炎、养鸟人肺(bird-fancier' s lung)、过敏性疾病、过敏性脑脊髓炎、中毒性表皮坏死松解症、秃发、阿尔波特氏综合征(Alport' s syndrome)、肺泡炎、过敏性肺泡炎、纤维化肺泡炎、间质性肺病、结节性红斑、坏疽性脓皮病、输血反应、麻风、疟疾、利什曼病(leishmaniasis)、 锥虫病、高安动脉炎(Takayasu' s arteritis)、风湿性多肌痛、颞动脉炎、血吸虫病、巨细胞动脉炎、蛔虫病、曲霉菌病、塞姆特综合征(Sampter' s syndrome)、湿疹、淋巴瘤样肉芽肿病、贝切特氏病(Behcet' s disease)、卡普兰综合征(Caplan‘ s syndrome)、川畸病 (Kawasaki' s disease)、登革热、脑脊髓炎、心内膜炎、心内膜心肌纤维化症、眼内炎、持久性隆起性红斑(erythema elevatum et diutinum)、银屑病、胎儿成红细胞增多症、嗜酸性筋膜炎(eosinophilic faciitis)、输血后紫癜综合征(Shulman ‘ s syndrome)、费尔提氏综合征(Felty' s syndrome)、丝虫病、睫状体炎、慢性睫状体炎、虹膜异色性睫状体炎 (heterochronic cyclitis)、弗斯睫状体炎(Fuch‘ s cyclitis)、IgA 肾病变、过敏性紫癜(Henoch-khonlein purpura)、肾小球肾炎、移植物抗宿主病、移植排斥、人类免疫缺陷病毒感染、埃可病毒(echovirus)感染、心肌病、阿兹海默氏症(Alzheimer' s disease), 细小病毒感染、风疹病毒感染、疫苗接种后综合征、先天性风疹感染、何杰金氏淋巴瘤(Hodgkin' s lymphoma)及非何杰金氏淋巴瘤(Non-Hodgkin' s lymphoma)、肾细胞癌、多发性骨髓瘤、兰伯特-伊顿综合征(Eaton-Lambert syndrome)、复发性多软骨炎、恶性黑色素瘤、冷球蛋白血症、沃尔登斯特伦巨球蛋白血症(Waldenstrom' s macroglobulemia)、爱泼斯坦-巴尔病毒感染(Epstein-Barr virus infection)、流行性腮腺炎、埃文斯综合征 (Evan' s syndrome)及自身免疫性生殖腺衰竭。应了解，本文所用的免疫病症特定而言包括哮喘。本文所用的“哮喘”是指一种发作性的且以发炎并伴有气道变窄及气道对吸入剂的反应性增强为特征的呼吸系统病症。哮喘通常(但非全部如此)与特应性或过敏性症状有关。哮喘的症状公认包括呼吸困难、咳嗽及哮鸣；尽管全部三种症状通常共存，但哮喘的诊断并不需要三种症状共存。在一个实施例中，治疗哮喘的方法进一步涉及投予选自由下列组成的群组的抗哮喘药物糖皮质激素、β肾上腺素能激动剂、甲基黄嘌呤、抗胆碱能药、色甘酸钠、奈多罗米(nedocromil)、抗组织胺药及抗-IgE。在多个实施例中，抗哮喘药物是丙酸倍氯米松(beclomethasone dipropionate) (VANCERIL ，Schering)、氟尼缩松(f lunisolide) (AEROBID Forest)、丙酸氟替卡松(fluticasone propionate)(FLOVENT GlaxoSmithKline)、泼尼松(prednisone)、甲泼尼龙(methylprednisolone)、曲安奈德 (triamcinolone acetonide) (AZMACORT Aventis)、硫酸舒喘灵(albuterol sulfate) (VENTOLIN GlaxoSmithKline ；PROVENTIL Schering)、肾上腺素、盐酸异丙肾上腺素 (isoproterenol hydrochloride)、硫酸间轻异丙肾上腺素(metaproterenol sulfate) (ALUPENT Boehringer Ingelheim)、特布他林(terbutaline) (BRETHINE LAMISIL Novartis)、异丙托溴铵(ipratropium bromide) (ATROVENTBoehringer Ingelheim)、茶碱(theophylline)、色甘酸钠、奈多罗米、或抗-IgE (奥马佐单抗(omalizumab) ；XOLAIR ； Genentech/Novartis)。溶酶体贮积症在一个实施例中，本发明提供治疗溶酶体贮积症的方法。溶酶体贮积症是由溶酶体功能障碍而引起，其通常是由于脂质、糖蛋白(含有糖的蛋白质)或所谓的粘多糖代谢所需单一酶缺乏。溶酶体贮积症已为所属领域的技术人员所习知，且包括激活剂缺乏症/GM2神经节苷脂贮积症、α -甘露糖苷贮积症、天冬氨酰基葡萄糖胺尿症 (Aspartylglucosaminuria)、胆固醇酯贮积症、慢性己糖胺酶A缺乏症、胱氨酸贮积症、达农病(Danon disease)、法布里病(Fabry disease)、法伯病(Farber disease)、岩藻糖苷贮积症、半乳糖唾液酸苷贮积症、戈谢病(Gaucher Disease) ,GMl神经节苷脂贮积症、1_细胞病/粘脂质贮积症II、婴儿游离唾液酸贮积症/ISSD、青少年己糖胺酶A缺乏症、克拉伯病(Krabbe disease)、异染性脑白质营养不良、粘多糖贮积症、假性胡尔勒多种营养不良 (Pseudo-Hurler polydystrophy) /粘脂质C积症 IIIA、MPS I 胡尔勒综合征(MPS I Hurler Syndrome)、MPS I 谢伊综合征(MPS I Scheie Syndrome)、MPS I 胡尔勒-谢伊综合征(MPS I Hurler-Scheie Syndrome)、MPS II 亨特综合征(MPS II Hunter syndrome)、桑菲列普综合征(Sanfilippo syndrome) A型/MPS III A、桑菲列普综合征B型/MPS III B、桑菲列普综合征C型/MPS III C、桑菲列普综合征D型/MPS III D、莫尔丘症A型(Morquio Type A) /MPS IVA、莫尔丘症B型/MPS IVB,MPS IX透明质酸酶缺乏症、MPS VI马-兰二氏症(MPS VI Maroteaux-Lamy)、MPS VII 斯莱综合征(MPS VII Sly ^mdrome)、粘脂质C积症I/唾液酸贮积症、粘脂质贮积症IIIC、粘脂质贮积症IV型、多发性硫酸脂酶缺乏症、尼曼皮克病(Niemarm-Pick Disease)、神经元蜡样脂褐质贮积症、CLN6病、巴-斯-沃三氏症(Batten-Spielmeyer-Vogt)/ 青少年型 NCL/CLN3 病、Finnish 变异型晚期婴儿型 CLN5、 Jansky-Bielschowsky病/晚期婴儿型CLN2/TPP1病、Kufs/成年发作型NCL/CLN4病、北方癫痫(Northern Epil印sy) / 变异型晚期婴儿型 CLN8、Santavuori-Haltia/婴儿型 CLNl/ PPT病、β-甘露糖苷贮积症、庞皮病(Pompe disease) /糖原贮积症II型、致密性成骨不全症、Sandhoff病/成年发作型/GM2神经节苷脂贮积症、Sandhoff病/GM2神经节苷脂贮积症-婴儿型、Sandhoff病/GM2神经节苷脂贮积症-青少年型、Schindler病、Salla病/唾液酸贮积症、Tay-SaChs/GM2神经节苷脂贮积症及沃尔曼病(Wolman disease)。血液病症在一个实施例中，本发明提供治疗血液病症的方法。在一个实施例中，血液病症是患者不具有血液内稳态(例如凝血)所需要的足量多肽的遗传病症。血液病症包括(但不限于)血友病、冯·威利布兰德症(von Willebrand Disease)、巨血小板综合征(Bernard-Soulier syndrome)、威斯科特-奥尔德里奇综合征(Wiskott-Aldrich syndrome)及格兰兹曼血小板机能不全(Glanzmann' s thrombasthenia)。多肽在R)Xp3+NKT细胞中的表达一方面，本发明提供将多肽递送至肝或肺的方法。在一些实施例中，对R)xp3+NKT 细胞的基因组或拟转变成R)Xp3+NKT细胞的NKT细胞的基因组实施修饰以纳入编码拟在肝或肺中表达的多肽的核酸。修饰基因组以纳入拟在肝或肺中表达的核酸的方法已为所属领域的技术人员所习知。使编码拟由R)xp3+细胞表达的多肽的核酸可操作地连接至调节序列。当编码序列与调节序列共价连接而使得编码序列的表达或转录处于调节序列的影响或控制下时，认为编码序列与调节序列“可操作地连接”。为使编码序列转译至功能蛋白质中，使编码序列可操作地连接至调节序列。以下情形下认为两个DNA序列可操作地连接5调节序列中的启动子经诱导导致编码序列转录，且所述两个DNA序列间连接的性质不会(1)导致引入移码突变，(2)干扰启动子区引导编码序列转录的能力，或C3)干扰对应RNA转录物转译至蛋白质中的能力。因此，如果启动子区能够实现所述DNA序列的转录而使得所得转录物可转译至期望蛋白质或多肽中，则所述启动子区可操作地连接至编码序列。基因表达所需调节序列的准确性质可因物种或细胞类型而变化，但通常应视需要包括分别参与转录及转译起始的5'非转录及5'非转译序列，例如TATA盒、加帽序列 (capping sequencehCAAT序列及诸如此类。此类5'非转录调节序列尤其包括启动子区， 所述启动子区包括用于可操作地连接基因转录控制的启动子序列。启动子可为组成型或诱导型的。调节序列也可视需要包括增强子序列或上游激活序列。视宿主性质而定，可使用多种转录及转译调节序列。转录及转译调节信号可自病毒来源获得，例如腺病毒、牛乳头瘤病毒、猿猴病毒或诸如此类，其中调节信号与具有高水平表达的特定基因序列有关。或者，可使用来自哺乳动物表达产物的启动子，例如肌动蛋白、胶原、肌球蛋白及诸如此类。可选择容许阻遏或激活且由此能够调节基因序列表达的转录起始调节信号。令人感兴趣的是具有温度敏感性且由此可通过改变温度来阻遏或起始表达的调节信号，或者受化学物质(例如代谢物)调节支配的调节信号。
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核酸在个体中的表达需要使用真核调节区。此类区域通常包括足以引导RNA合成起始的启动子区。真核启动子包括(例如)小鼠金属硫蛋白I基因序列的启动子(Hamer等人，1982，J. Mol. Appl. Gen. 1，273-288)；疱疹病毒的 TK 启动子(McKnight, 1982 Cell 31， 355-365)；及 SV40 早期启动子(Benoist 等人，1981 Nature (London) 290, 304-310) 应了解，用于核酸表达的调节元件可以是导致核酸在靶组织(例如，肝及肺)中表达的调节元件。因此，在一些实施例中，使核酸可操作地连接至能够在肝或肺环境中表达核酸的启动子。此类启动子包括用于肝细胞的启动子及用于肺细胞的启动子。在一些实施例中，将核酸插入载体中。本文所用的“载体”可以是其中可通过限制及连结插入期望序列以用于不同遗传环境间转运或宿主细胞中表达的诸多种核酸中的任一种核酸。表达载体是其中可通过限制及连结插入期望DNA序列以使其可操作地连接至调节序列且可作为RNA转录物表达的载体。载体可进一步含有适用于识别经或未经载体转变或转染的细胞的一或多种标记序列。标记物包括(例如)编码会增强或减弱对抗生素或其他化合物的抗性或敏感性的蛋白质的基因、编码活性可通过业内已知的标准分析法检测的酶(例如，β-半乳糖苷酶或碱性磷酸酶)的基因、及明显影响所转变或转染细胞、宿主、菌落或噬斑的表型的基因。在一个实施例中，使用能够将期望基因序列整合至宿主细胞染色体中的载体。所引入DNA稳定整合至染色体中的细胞还可通过引入容许选择含有表达载体的宿主细胞的一或多种标记物加以选择。可将可选标记基因序列直接连接至拟表达的DNA基因序列或通过共转染引入至相同细胞中。核酸mRNA的最佳合成也可需要其他元件。这些元件可包括剪接信号、以及转录启动子、增强子及终止信号。纳入此类元件的cDNA表达载体包括 Okayama (1983, Molec. Cell. Biol. 3，280)所阐述的载体。优选真核质粒包括(例如)BPV、EBV、SV40、2_微米环Q-micron circle)、及诸如此类、或其衍生物。此类质粒已为所属领域的技术人员所熟知(1982，Botstein等人， Miami ffntr. Symp. 19,265-274 ；Broach,1981,T :The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces :Life Cycle and Inheritance, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY,第 445-470 页；Broach，1982，Cell 28 :203-204 ；Bollon 等人，1980， J.Clin. Hemato1. Oncol. 10 :39-48 ；Maniatis,1980,于Cell Biology :A Comprehensive Treatise,第 3 卷，Gene Sequence Expression, Academic Press, NY,第 563-608 页)。其他优选真核载体是病毒载体。例如且不作为限制，可使用痘病毒、疱疹病毒、腺病毒及各种反转录病毒。病毒载体可包括DNA病毒或RNA病毒，以表达插入物DNA或插入物RNA。含有构建体的载体或DNA序列准备好用于表达后，可将DNA构建体通过多种适宜手段中的任一种手段引入至合适宿主细胞(例如R)xp3+NKT细胞)中，即，转化、转染、接合 (conjugation)、原生质体融合、电穿孔、磷酸钙沉淀、直接显微注射及诸如此类。引入载体后，在选择生长含载体细胞的选择性培养基中生长受体细胞。克隆基因序列的表达将产生核酸。此可在原样转化细胞中或在诱导这些细胞分化(例如，通过向神经母细胞瘤细胞投予溴脱氧尿嘧啶(bromodeoxyuracil)或诸如此类)后实施。将药剂附着至细胞的方法一方面，本发明提供将药剂递送至肝或肺的方法。在一个实施例中，将药剂附着至 Foxp3+NKT细胞或拟转变成R)xp3+NKT细胞的NKT细胞。附着药剂的方法已为所属领域的
21技术人员所习知，且本发明并不限于任一特定方法。例如，可通过使药剂与天然存在于细胞表面上的分子(例如糖或蛋白质)反应来将药剂共价附着至细胞。也可通过使药剂非共价结合至存在于细胞表面上的分子来将药剂附着至细胞。例如，可使药剂连接至抗表面蛋白抗体并随后可使抗体-药剂结合至表面蛋白。也可使药剂连接至配体(例如受体配体)并随后可使配体-药剂组合附着至细胞。在所有实施例中，较佳地，药剂结合至细胞，使得在细胞局部化至肝或肺中之前药剂不会自细胞释放。可附着至细胞的药剂包括毒素或药物(S卩，以治疗肝或肺特异性疾病)、递送至肝或肺时具有有益效果的治疗性多肽(即，多肽，例如溶酶体贮积症酶)、及诊断剂。个体一方面，本发明提供治疗个体病症的方法。本文所用的“个体”是人类或其他脊椎动物类哺乳动物，包括但不限于小鼠、大鼠、狗、猫、马、牛、猪、绵羊、山羊或非人类灵长类动物。治疗有效量在一些实施例中，本文所述的所有化合物、药剂及细胞(例如，TGF-β、NKT刺激剂、Foxp3+天然杀伤T细胞、IL-2、细胞因子、抗-细胞因子抗体)可以治疗有效量使用。术语“治疗有效量”或“有效量”可互换使用，其是指实现期望治疗效果(例如，抑制特定器官中的免疫应答)所必需的或足以实现期望治疗效果的量。结合本文所提供的教示，通过选择不同活性化合物及权衡例如效能、相对生物利用度、个体体重、不利副作用的严重程度及优选投予模式等因素，可选择出不会造成实质毒性且仍可有效地治疗特定个体的有效预防性或治疗性治疗方案。用于任何特定应用的有效量可视例如所治疗疾病或病状、拟投予的本文所述特定化合物、药剂及细胞、个体体格、或疾病或病状的严重程度等因素而有所变化。所属领域的技术人员可根据经验确定本文所述特定化合物、药剂及细胞及/或一或多种其他治疗药剂的有效量，无需进行过多实验。通常，较佳使用最大剂量，即，根据某一医学判断的最高安全剂量。可涵盖每天、每周或每月多次剂量以实现本文所述化合物、药剂及细胞的合适全身水平。合适全身水平可通过(例如)测量患者的本文所述化合物、药剂及细胞的峰值或持续血浆水平来确定。化合物或药剂的治疗有效量通常介于0. 001mg/kg与1000mg/kg之间。预期可用于本发明的化合物将以所述范围投予。在一些实施例中，所述范围介于0. 01mg/kg与IOOmg/ kg之间。在其他实施例中，所述范围介于0.05mg/kg与50mg/kg之间。在一些实施例中，治疗有效量小于50mg/kg，例如小于45mg/kg、小于40mg/kg、小于35mg/kg、小于30mg/kg、小于 25mg/kg、小于20mg/kg或小于15mg/kg。在一些实施例中，治疗有效量小于10mg/kg，例如小于 9mg/kg、小于 8mg/kg、小于 7mg/kg、小于 6mg/kg、小于 5mg/kg、小于 4mg/kg、小于 3mg/ kg或小于ang/kg。在一些实施例中，治疗有效量小于1. 5mg/kg，例如小于1. %ig/kg、小于 1. 3mg/kg、小于 1. 2mg/kg、小于 1. lmg/kg、小于 lmg/kg、小于 0. 9mg/kg、小于 0. 8mg/kg、小于 0. 7mg/kg、小于 0. 6mg/kg、小于 0. 5mg/kg、小于 0. 4mg/kg、小于 0. 3mg/kg、小于 0. 2mg/kg 或小于0. lmg/kg TGF-β、NKT刺激剂或本文所述的其他药剂或化合物。R)xp3+天然杀伤T细胞的治疗有效量通常介于10个细胞与Ix IO8个细胞之间。 在一些实施例中，Foxp3+天然杀伤T细胞将以Ix IO2个细胞至IxlO7个细胞的范围投予。在一些实施例中，Foxp3+天然杀伤T细胞将以Ix IO3个细胞至Ix IO6个细胞的范围投予。 在一些实施例中，治疗有效量小于IxlO7个R)Xp3+天然杀伤T细胞，例如小于Ix IO6个、小于Ix IO5个、小于Ix IO4个或小于Ix IO3个R)xp3+天然杀伤T细胞。在一些实施例中，以一个剂量投予治疗有效量。在一些实施例中，以多个剂量投予治疗有效量。可视投予模式适当调节剂量以实现本文所述化合物、药剂及细胞的期望水平 (局部或全身)。在个体中的应答在所述剂量下不充分的情况下，可在个体耐受性允许的条件下使用甚至更高剂量(或通过不同的更局部化递送途径达成更高有效剂量)。本发明涵盖每天多个剂量以实现化合物的合适全身水平。医药组合物设投予途径本文所述化合物、药剂及细胞通常以医药组合物的形式投予给个体，这些医药组合通常可含有医药上可接受浓度的盐、缓冲剂、防腐剂、相容性载剂、佐剂及视情况其他治疗成分。医药组合物的药物载剂和其他组分的性质将取决于投予方式。在实施本文所述治疗方法时，本发明的医药组合物可通过所属领域的技术人员所熟知的任何方式和途径投予。在一些实施例中，本文所述化合物、药剂和细胞局部投予。局部投予方法在业内被人所熟知且将取决于靶部位或靶器官。局部投予途径包括使用标准局部投予方法，例如经皮(印icutaneous)(施加在皮肤上)、吸入、经直肠(例如使用灌肠剂或栓剂)、通过滴眼剂 (滴在结膜上)、通过滴耳剂、鼻内途径、及经阴道。可通过经肠投予途径向胃肠道局部给药。经肠投予途径包括经口、通过胃饲管、通过十二指肠饲管、胃造口术或经直肠。局部投予也可通过输注进行。输注入特定器官或与特定器官直接接触的静脉(例如门静脉)将至少在开始时将实现所输注实体的局部投予。除输注至特定静脉外，局部输注也能够递送至骨髓(骨内输注)、腹膜以及递送至膀胱中(膀胱内输注)。本文所用局部投予也包括本文所述化合物、药剂和细胞的局部注射。局部注射几乎可在任何部位或器官中进行，可进行局部投予的部位的实例是肌内、大脑内、脑室内、心脏内、皮下、皮内、鞘内、腹膜内、及海棉体腔内(intracavernosal)。应了解，局部投予也包括使用缓释基质。因此，本文所述的化合物、药剂和细胞可通过手术或注射引入个体体内，且实体的缓释将促进特定实体的局部释放。本文所用局部投予也涵盖使用载剂进行局部递送。因此，拟局部递送的本文所述化合物、药剂和细胞可偶联至在投予时寻靶至特定身体部位的载剂。对于经口投予，药剂和化合物可通过将化合物与业内熟知的医药上可接受的载剂组合而容易地加以调配。此类载剂使本发明化合物能够调配成可由欲治疗患者经口摄取的片剂、药丸、糖衣丸、胶囊、液体、凝胶、糖浆、浆液、悬浮液及类似剂型。用于经口使用的医药制剂可通过以下获得使用固体赋形剂，视情况研磨所得混合物，并在添加其他适宜助剂 (若需要)后处理粒料混合物以获得片剂或糖衣丸芯。适宜赋形剂尤其为填充剂，例如糖， 包括乳糖、蔗糖、甘露醇、或山梨醇；纤维素制剂，例如，玉米淀粉、小麦淀粉、水稻淀粉、马铃薯淀粉、明胶、黄蓍胶、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠及/或聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrrolidone ；PVP) 0需要时，可添加崩解剂，例如，交联聚乙烯吡咯烷酮、 琼脂、或海藻酸或其盐(例如海藻酸钠)。视情况，口服调配物也可调配在盐水或缓冲剂(例如，用于中和内部酸性环境的EDTA)中，或可在无任何载剂的情况下调配。对于经口递送，释放位置可为胃、小肠(十二指肠、空肠、或回肠)、或大肠。所述领域的技术人员已经利用在胃中不溶解、而将在十二指肠或者在肠中其他部位释放材料的调配物。用作肠溶包衣的更常用惰性成分的实例有乙酸偏苯三酸纤维素(cellulose acetate trimellitate ；CAT)、邻苯二甲酸羟丙基甲基纤维素(hydroxypropylmethyl-cellulose phthalate ;HPMCP)、HPMCP 50、HPMCP 55、聚乙酸邻苯二甲酸乙烯酯(polyvinyl acetate phthalate ；PVAP)、Eudragit L30D、Aquateric、乙酸邻苯二甲酸纤维素(cellulose acetate phthalate ；CAP) > Eudragit L> Eudragit S 及 Shellac。这些包衣可作为t昆合膜使用。包衣或包衣混合物也可用在片剂上，其并非意欲抵抗胃。这可包括糖衣、或使片剂易于吞咽的包衣。胶囊可由用于递送干治疗粉末的硬壳(例如明胶)组成；对于液体形式，可使用软明胶壳。扁囊剂的壳材料可为稠淀粉或其他可食用纸。对于药丸、菱形片剂、模制片剂或研制片剂，可使用湿密集技术(moist massing technique)。本文所述药剂和化合物可包括在作为微细多微粒呈微粒或丸粒形式的调配物中。 用于胶囊投予的材料的调配物也可为粉末、略微压缩的柱块或甚至为片剂。医药组合物可通过压缩制备。可利用惰性材料稀释医药组合物或增加其体积。这些稀释剂可包括碳水化合物，尤其是甘露醇、α -乳糖、无水乳糖、纤维素、蔗糖、经改性葡聚糖及淀粉。某些无机盐也可用作填充剂，包括三磷酸钙、碳酸镁及氯化钠。一些市售稀释剂是hst-FlcKEmdex、 STA-Rx 1500、Emcompress 及 Avicellο崩解剂可包括在呈固体剂型的医药组合物的调配物中。用作崩解剂的材料包括(但不限于)淀粉，其包括基于淀粉的市售崩解剂Explotab。淀粉羟乙酸钠、安伯莱特(Amber 1 ite)、羧甲基纤维素钠、超支链淀粉(ultramylopectin)、海藻酸钠、明胶、橙皮、酸性羧甲基纤维素、天然海绵及膨润土均可使用。粘合剂可用于将治疗剂保持在一起以形成硬片剂且包括来自天然产物的材料，例如阿拉伯胶、黄蓍胶、淀粉及明胶。抗磨剂可包括在治疗剂的调配物中，以防止在调配过程期间粘着。润滑剂可用作治疗剂与模具壁之间的层，且这些润滑剂包括(但不限于)硬脂酸(包括其镁盐及钙盐)、聚四氟乙烯 (polytetrafluoroethylene ；PTFE)、液体石蜡、植物油及蜡。可添加可改良调配期间药物的流动性且有助于压缩期间的重新布置的助流剂。助流剂可包括淀粉、滑石粉、火成二氧化硅及水合硅铝酸盐。对于通过吸入投予，本文所述药剂和化合物可借助适当推进剂(例如，二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其他适宜气体)方便地以气溶胶喷雾形式由压力包或雾化器递送。本文也打算涵盖本文所述药剂和化合物的肺部递送。本文所述药剂和化合物可递送到哺乳动物的肺以实现局部或全身递送。对吸入分子的其他报导包括Adjei等人，， 1990，Pharmaceutical Research，7 :565-569 ；Adjei 等人，1990，International Journal of Pharmaceutics,63 :135-144( ZjM^(leuprolide acetate)) ；Braquet ^A 1989, Journal of Cardiovascular Pharmacology, 13 (suppl. 5) :143-146 (内管月太-1) ；Hubbard 等人，1989，Annals of Internal Medicine，Vol. III，pp. 206—212 (al_ 抗胰蛋白酶)；Smith 等人，1989，J. Clin. Invest. 84 :1145-1146 (a_l_ 蛋白酶)；Oswein 等人，1990，“Aerosolization of Proteins”， Proceedings of Symposium on Respiratory
24Drug Delivery II, Keystone, Colorado, March,(重组人类生长激素)；Debs 等人，1988， J. Immunol. 140 :；3482-3488(干扰素-g和肿瘤坏死因子α)及Platz等人，美国专利第 5，观4，656号(粒细胞集落刺激因子)。用于肺部递送药物以实现全身作用的方法及组合物在1995年9月19日颁予Wong等人的美国专利第5，451，569号中予以描述。本文也打算涵盖包含本文所述药剂和化合物的医药组合物的经鼻递送。经鼻递送使得将治疗产品投予至鼻子后本发明的医药组合物直接流至血流，而产品无需在肺中沉积。本文所述的药剂和化合物也可调配在例如栓剂或留滞灌肠剂等含有(例如)常规栓剂基质(例如，可可油或其他甘油酯)等直肠或阴道组合物中。除上述调配物外，化合物亦可调配成储积制剂。此类长效调配物可用适宜聚合或疏水性材料(例如作为在可接受油中的乳液)或离子交换树脂调配，或作为微溶性类似物(例如，微溶性盐)。用于投予细胞(包括最佳化的医药组合物)的方法在业内为人熟知。细胞可通过输注、注射(例如注射至关节中)或通过外科插入而投予。然而，本发明并不限于这些实施例，而是打算涵盖任何细胞投予方法。医药组合物还可包含适合的固相或凝胶相载剂或赋形剂。此类载剂或赋形剂的实例包括(但不限于)碳酸钙、磷酸钙、各种糖、淀粉、纤维素类似物、明胶、及聚合物(例如聚
乙二醇)。适宜的液体或固体医药制剂形式为(例如)用于吸入的水溶液或盐水溶液、经微胶囊化、呈螺旋状、涂敷在微型金颗粒上、包含在脂质体中、呈喷雾状、气溶胶、用于植入皮肤中的丸粒、或干燥至拟刺入皮肤中的尖锐物体上。医药组合物还包括微粒、粉末、片剂、包衣片剂、(微)胶囊、栓剂、糖浆、乳液、悬浮液、乳霜、滴剂或活性化合物延长释放的制剂，在其制备中通常如上所述使用赋形剂及添加剂及/或一或多种助剂，例如崩解剂、粘合剂、包衣剂、溶胀剂、润滑剂、矫味剂、甜味剂或增溶剂。这些医药组合物适合用于各种药物递送系统。关于药物递送方法的综述，参见Langer，1990，Science M9，1527-1533，其以引用的方式并入本文中。本文所述药剂和化合物可以自身(纯净)形式或以医药上可接受的盐的形式投予。当用于药品中时，盐应为医药上可接受的，但非医药上可接受的盐可方便地用于制备其医药上可接受的盐。此类盐包括但不限于从以下酸制备的盐盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、 磷酸、马来酸、乙酸、水杨酸、对甲苯磺酸、酒石酸、柠檬酸、甲烷磺酸、甲酸、丙二酸、琥珀酸、 萘-2-磺酸、及苯磺酸。并且，此类盐也可制备成碱金属盐或碱土金属盐，例如羧酸基的钠盐、钾盐或钙盐。 本发明的医药组合物含有包括在医药上可接受载剂中的有效量的本文所述药剂、 化合物及细胞以及视情况另外的治疗剂。术语医药上可接受的载剂是指适用于投予给人类或其他脊椎动物的一或多种相容固体或液体填充剂、稀释剂或囊封物质。术语载剂指天然或合成的有机或无机成分，其可与活性成分组合以有利于应用。医药组合物的各组分也能与本发明化合物及相互之间以没有实质上消弱期望医药功效的相互作用的方式混合。
非生物可降解及生物可降解两种聚合物材料均可用于制备递送本发明化合物的粒子。此类聚合物可为天然或合成聚合物。根据期望释放的时间周期选择聚合物。特别令人感兴趣生物粘结聚合物包括Sawhney等人在1993，Macromolecules 26，581-587中所述的可生物蚀解的水凝胶，其教示并入本文中。这些聚合物包括聚透明质酸、酪蛋白、明胶、明胶蛋白、聚酸酐、聚丙烯酸、藻酸盐、壳聚糖、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(甲基丙烯酸乙酯)、 聚(甲基丙烯酸丁酯)、聚(甲基丙烯酸异丁酯)、聚(甲基丙烯酸己酯)、聚(甲基丙烯酸异癸酯)、聚(甲基丙烯酸月桂基酯)、聚(甲基丙烯酸苯基酯)、聚(丙烯酸甲酯)、聚(丙烯酸异丙酯)、聚(丙烯酸异丁酯)、及聚(丙烯酸十八烷基酯)。本文所述的药剂和化合物可包含在控释系统中。术语“控释”意欲指其中本文所述的药剂和化合物从调配物中释放的方式和曲线受到控制的任何含有本文所述药剂和化合物的调配物。这是指立即释放调配物以及非立即释放调配物，其中非立即释放调配物包括但不限于持续释放调配物及延迟释放调配物。术语“持续释放”(亦称为“延长释放”)是以其习知含义使用，意指提供化合物在延长时间周期内的逐渐释放、且较佳(尽管未必一定) 在延长时间周期内获得实质恒定的血液药物含量的药物调配物。术语“延迟释放”是以其习知含义使用，意指其中调配物的投予与化合物自其中的释放之间有时间延迟的药物调配物。“延迟释放”可包括或可不包括药物在延长时间周期内的逐渐释放，且因此可为或可不为“持续释放”。使用长期持续释放植入物可尤其适用于治疗慢性病状。本文所用“长期”释放是指植入物构造并布置成持续至少7天、且较佳30至60天递送治疗量的活性成分。长期持续释放植入物已为所述领域的技术人员所熟知且包括以上所述的一些释放系统。试剂盒一方面，本发明提供试剂盒，其包括包含本文所述药剂和化合物的医药组合物以及关于投予医药组合物的用法说明。在本发明的一些方面，试剂盒可包括医药制剂小瓶、医药制剂稀释小瓶、以及本文所述化合物和药剂。稀释小瓶含有稀释剂，例如生理盐水，用以稀释可能的本发明化合物的浓缩溶液或冻干粉末。在一些实施例中，用法说明包括关于将一定量的稀释剂与一定量的经浓缩医药制剂混合而由此制备用于注射或输注的最终调配物的说明。在一些实施例中，用法说明包括关于在注射器或其他投予装置中使用的说明。在一些实施例中，用法说明包括关于用有效量的本发明化合物治疗患者的说明。还应理解，含有制剂的容器，无论容器是瓶子、带隔片的小瓶、带隔片的安瓿、输注袋及类似容器，其均可含有标记，例如在制剂已经过高压灭菌或以其他方式灭菌时会改变颜色的常规标签等。将通过以下实例对本发明进行进一步说明，无论如何不能将这些实例视为进一步限制。本说明书全文所引用的所有参考资料(包括参考文献、已授权专利、公开专利申请案及共同待决专利申请案)的全部内容均以引用方式明确并入本文中，尤其是上文所参考的教示。实例实例的材料和方法小鼠将C57BL/6小鼠、Balb/c小鼠、TGF β RIIdn小鼠及FoxP3gfp基因敲入小鼠(由华盛顿大学(University of Washington)(西雅图，华盛顿州)的A. Y. Rudensky慷慨提供) 在化8丨^肚0 Gulbenkian de Cigncia (奥埃拉斯(Oeiras)，葡萄牙)处在无特定病原体条件下饲喂和供养。实验小鼠性别相匹配并为6至8周龄。所有实验均根据动物使用者和机构伦理委员会(Animal User and Institutional Ethical Committee)的指导原则进行。 对于iNKT细胞的体内转变，通过胃内灌服法递送30 μ g α -GalCer (Alexis，圣地亚哥，加利福尼亚州)，每隔一天进行3次。器官加工所有所分析的器官均借助BD细胞滤器和注射器活塞加工成单细胞悬浮液。脾进一步在冰冷的三-氯化铵红细胞溶胞液中培育5分钟。在加工前，将肝用含肝素的PBS冲洗3次，随后用补充有10%胎牛血清的RPMI冲洗。将肝细胞通过覆盖35% (vol/vol)珀可(Percoll) (Sigma)溶液(Ilml)并随后在室温下在1360g下无降速度(with no brake) 离心25min而进行分级分离。通过抽吸弃除上清液并将片状沉淀物在冰冷的三_氯化铵红细胞溶胞液中培育5分钟。人类外周血细胞的分离在获得知情同意后，从两种性别的健康志愿者获得经肝素化的静脉血试样。程序经里斯本大学的医学系(Faculty of Medicine, University of Lisbon)(里斯本 (Lisbon)，葡萄牙)审查和批准。通过在Histopaque-1077 Hybri-Max密度梯度(Sigma) 上离心而分离夕卜周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cell ；PBMC)并如下所述浓集T细胞。流式细胞术和细胞分选偶联至PE的小鼠和人类CDld_PBS57四聚体由NIH Tetramer Facility提供。抗小鼠 CD3(145-2C11)、CD4 (GK1. 5 和 RM4-5)、CD8 (53-6. 7)、CD25(PC61. 5)、CD27 (LG. 7F9)、 CD62L(MEL-14)、CD103 (2E7)、CTLA-4(UC10-4B9)、DX5 (DX5)、Foxp3 (FJK_16s)、 GITR(DTA-I)、NKl. 1 (PK136)、NKG2D (CX5)、TCR-β 链(Η57-597)、Thyl. 1 (HIS51)、 Thyl. 2 (53-2. 1)的荧光染料标记的单克隆抗体(括号中指示的克隆)自eBioscience或 BD Biosciences 购得。抗人类 CD4(SK3)、CD25 (2A3), CD127 (eBioRDR5)、CD161(DX12)、 CTLA-4(14D3)、Foxp3 (PCHlOl)、GITR(eBioAITR)和 TCR V β 11 (C21)的荧光颜料标记的单克隆抗体自 eBioscience、BD Biosciences 或 Beckman Coulter 购得。对于鼠科NKT细胞浓集，用未经偶联的抗_CD16/32(克隆2.4G2)大鼠抗体(内部自行生产)培育细胞，以阻断与FcR的非特异性结合，并用偶联PE的CDld-PBS57四聚体标记，但不进行冲洗。加入抗-PE磁性珠粒并在autoMACS细胞分离器(Miltenyi Biotech) 中分离出经磁性标记的部分。将试样在FACSCanto I (Becton Dickinson)进行分析或在 FACSAria(Becton Dickinson)上进行分选，在所有实验中均执行双重排除。对于人类NKT 细胞浓集，用生物素化的抗CD14(61D3)、CD19(HIB19)和CD123(6H6)的抗体标记细胞，将其结合至抗生物素磁性珠粒并在autoMACS细胞分离器(Miltenyi Biotech)上进行浓集， 弃除经磁性标记的部分。对于细胞内流式细胞术染色，首先针对表面标记物对细胞进行标记，用购自eBioscience的渗透和固定缓冲液“套装R)xp3染色缓冲液(Foxp3 Staining Buffer kt)”进行冲洗和固定。在进行细胞内抗体染色前，用未经偶联的抗_CD16/32(克隆2. 4G2)大鼠抗体(内部自行生产)培育鼠科细胞，并用正常大鼠血清(eBioscience)培育人类细胞。用FlowJoCTree Star)对数据进行分析。细胞培养在先前已涂覆有3μ g/mL的抗_CD3(克隆145_2Cll，eBioscience)的M孔或96 孔平底板中培养所分选出的小鼠细胞。培养基为含GlutaMAX的RPMI-1640，补充有10% 胎牛血清、IfepesU %盘尼西林(penicillin)/链霉素(str印tomycin)、1 %丙酮酸钠和0.1% β-巯基乙醇(Invitrogen)。在一些情况下，将以下细胞因子和抗体添加至培养物中TGF-3 (5ng/mL, R&DSystems)、重组 IL-1 β (10ng/mL, eBioscience)、IL_2(5ng/mL， eBiocience)、IL-4(20ng/mL, eBioscience)、IL-6(20ng/mL, R&D Systems)、IL-15 (lOOng/ mL, eBioscience)、IL-7 (5ng/mL, R&D Systems)、禾口抗-CD28 (2 μ g/mL，eBioscience)。在进行细胞内细胞因子检测前，在Brefeldin A(Sigma)的存在下用50ng/mL的- α -佛波醇 12-肉豆蔻酸酉旨 13-乙酸酯 α -phorbol 12-mystrate 13-acetate ；PMA)及 500ng/mL 的离子霉素(Sigma)将细胞在37°C、5% CO2下刺激3小时。在先前已涂覆有lyg/mL的抗_CD3(克隆0KT3，BD eBiosciences)的M孔平底板中培养人类细胞。培养基为含GlutaMAX的RPMI-1640，补充有10%胎牛血清、 !fepes和盘尼西林/链霉素(Invitrogen)。在一些情况下，将以下细胞因子和抗体添加至培养物中TGF-3 (10ng/mL, R&D Systems)、重组 IL-2 (10U/mL，Roche)、抗 IL12 和抗-IFN- γ (5 μ g/mL, eBioscience)、抗-IL-4 (5 μ g/mL, R&D Systems)、禾口抗-CD28 (2 μ g/ mL, eBioscience)。细胞因子检测从各孔中取出培养物的上清液并在-80°C下冷冻，直到进行细胞因子检测为止。使用仏-川⑴印！^丨一油)和IL-4(BD-Pharmingen)试剂盒进行ELISA。使用细胞因子珠粒矩阵小鼠 IL-9Flex 亚群(Mouse IL_9Flex Set) (BD-Pharmingen)进行 IL-9 检测。所有检验均按照制造商的说明书进行。体外增殖和抑制检验为追踪细胞增殖，在培养前用5μΜ的羧基荧光素琥珀酰亚胺酯 (carboxyfluorescein succinimidyl ester ；CFSE, Invitrogen)标记分选出的鼠禾斗细胞。为评估调节iNKT和CD4T细胞的抑制能力，将各亚群以一式三份或一式四份在60孔 Terasaki板(Greiner)中与经丝裂霉素C(Sigma)处理的脾细胞和新分选出的⑶4+⑶25_T 细胞一起共培养，并添加2. 5 μ g/mL的可溶性抗-CD3 (BD Pharmingen) 0在一些实验中， 添加 200 μ g/mL 的抗-ILlORdBl. 2)、200 μ g/mL 的抗-IL-4 (IlBll)和 100 μ g/mL 的抗-GITR(YGITR)22。将细胞在37°C下培养96小时并在培养的最后12小时中向各孔中添加 1 μ Ci [3H]胸苷(Amersham)。将各板收获到纤维玻璃过滤器上并使用Microbeta Trilux闪烁计数器(Perkin Elmer)来评估[3H]胸苷掺入。所有培养物均以一式三份或一式四份进行测试。转孔试验(Transwell Assay)在跨膜培养中，在平底96孔培养板的底部孔中用经丝裂霉素C处理的脾细胞和 1 μ g/mL可溶性抗-CD3抗体来刺激经CFSE标记的“应答者(responder) ”CD4+CD25—T细胞。 将调节群或者在底部孔中用“应答者”细胞培养，或者在0.2ym Anopore膜插入皿(Nunc) 的上部孔中仅用经丝裂霉素C处理的脾细胞培养。72小时后，通过流式细胞术分析来评估底部孔中的CFSE稀释度。过敏性气道疾病在第O天和第14天通过腹腔注射20yg的卵清蛋白(ovalbumin ;0VA，V级； Sigma，圣路易斯，美国)或β-乳球蛋白(Sigma)来敏化Balb/c小鼠，卵清蛋白或β-乳球蛋白预先按照制造商说明书通过DetoxyGel柱(Pierce，罗克福德(Rockford)，美国)并悬浮在2. Omg的无内毒素的氢氧化铝(Alu-gel-S, Serva，海德尔堡(Heidelberg)，德国) 中。在第0天、第7天和第14天用一半的OVA剂量来敏化C57/B16小鼠。随后，所有动物均在图14中所示日期用在无致热源的盐水中的50 μ g的OVA进行激发，并在最后一次激发后M小时杀死。为量化BAL嗜酸性粒细胞增多，经由气管通过缓慢输注并抽吸Iml冷PBS 10% BSA(Sigma)来冲洗气道，冲洗三次。接着，将BAL离心，移除上清液并将片状沉淀物重悬浮在PBS中。用血球计数器计数细胞。对用Giemsa-Wright (Sigma)染色的细胞离心涂片器(cytopsin)试样进行差示细胞计数。使用遮光载玻片(blinded slide)对每份试样的至少200个细胞进行计数，以确定每个细胞类型的相对频率。对于组织分析，用4%的甲醛溶液(Sigma)对肺进行灌注，收集并进行切片。使用苏木精(hematoxylin)/伊红(eosin) 进行染色，并使用过碘酸-希夫(periodic acid-Schiff ；PAS)染料来显示含粘液的细胞。 使用Leica DM2500显微镜和Leica DFC420照相机拍照。实验性自身免疫性脑脊髓炎(Experimental autoimmune encephalomyelitis ； EAE)在C57BL/6小鼠中，通过注射在CFA中乳化的髓磷脂少突胶质细胞糖蛋白(myelin oligodendrocyte glycoprotein ；M0G)35_55Jft (MEVGWYRSPFSRVVH LYRNGK, SEQ ID NO :1)并两次静脉内注射百日咳毒素(第0天，200ng;第2天，400ng)而诱导EAE。一些小鼠在第0 天(在M0G35_55CFA混合物中乳化)和第4天(腹腔注射)用两份4 μ g剂量的α -GalCer 进行处理。每天均监测疾病严重程度并将EAE分级如下1分尾部软弱无力；2分，后足部分瘫痪；3分，后足完全瘫痪；4分，前足软弱无力；5分，奄奄一息。聚焦显微镜检查法将R)xp3_GFP+细胞在FACSAria(Becton Dickinson)中进行分选，涂布在预先涂覆有聚-L-赖氨酸(Sigma)的盖玻片上，并在37°C下培育1小时进行粘附。将载玻片用经 PE标记的⑶ld/PBS57四聚体在4°C下培育1小时并小心地用冰冷的PBS冲洗。将细胞在 PBS 3%低聚甲醛(Sigma)中在4°C下固定15分钟并通过用冰冷的PBS冲洗来除去过量的固着剂。将载玻片在DAPI Fluoromount G(Southern Biotech)荧光封固剂中进行封固并用激光扫描聚焦显微镜(LSM 510 ΜΕΤΑ, Carl Zeiss)检查。RNA 提取、RT 禾口 PCR用RNeasy Micro Kit ^jiagen)按照制造商说明书从 1，000-50，000 个经 FACS 分选的细胞中提取RNA，例外之处是将细胞直接分选入RLT缓冲液中。使用随机引物 (Invitrogen)和 Superscript III 逆转录酶(Invitrogen)进行 cDNA 合成。用以下引物 (购自 Bonsai Technologies)检测转录物:PLZF(Zbtbl6)正向cagtttgcgactgagaatgc， (SEQ ID NO :2)， 反向:ttcccacacagcagacagaa (SEQ ID NO :3) ；Foxp3 正向 cccaggaaagacagcaacctt(SEQ ID NO -A) ； Jx. ( :ttctcacaaccaggccacttg(SEQ ID NO 5)； EFAl 正向acacgtagattccggcaagt (SEQ ID NO :6)，反向aggagccctttcccatctc (SEQ ID NO :7)。使用 Power SYBRGreen PCR Master Mix (Applied Biosystems)和 ABI-PRISM 7000 测序系统(Applied Biosystems)进行PCR。所有的PCR产物均在琼脂糖凝胶中进行试验并确认是否具有正确的尺寸。统计分析通过非参数不成对t检验和Wfelch校正来计算P值。
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实例1 在TGF- β的存在下讲行培养后， ΝΚΤ细胞表汰Foxp3我们研究了在TGF-β的存在下(已知可将常规T细胞转变为R)Xp3+ “诱导的”Treg的条件(35，36))被激活时iNKT在上调R)Xp3表达中的可塑性。用板结合的抗-⑶3 刺激自幼稚C57B1/6小鼠的脾分选出的iNKT细胞并在IL-2和TGF-β的存在下进行培养。 使用幼稚CD4+CD25_T淋巴细胞的平行培养物作为对照。3天后，对经培养细胞的细胞内染色揭示，在很大比例的iNKT ( . 35% ±11.80)细胞培养物和CD4 (53. 21 % 士 12. 03) T细胞培养物中均可检测到R)Xp3表达(图la)。来自具有GFP-Foxp3融合蛋白-报导子(importer) 基因敲入等位基因的小鼠(Foxp3gfp小鼠)(37)和Balb/c小鼠的iNKT细胞也给出类似的结果(图Ib和图2)。从胸腺分选出的iNKT淋巴细胞也可分化成R)xp3+iNKT细胞，但是转变效率较低(图Ic)。在转变后分选R)xp3+iNKT并通过聚焦显微镜检查法分析各细胞。如图 Id中所示，用负载有PBS57配体的CDld四聚体进行的染色证实，这些表达R)xp3的细胞的表面具有会识别糖脂抗原的不变TCR，这是iNKT细胞所独有的特征。因此，真正的iNKT细胞在于特定条件下受到刺激时上调i^Xp3转录因子的能力方面与常规CD4T细胞类似。需要注意的是，例如Y S T细胞等其他非常规(非MHC限制的)T细胞并不具有这一特性，这些非常规T细胞当在TGF- β存在下被激活时并不能上调R)xp3 (数据未显示)。为进一步界定将iNKT细胞转变为Foxp3表达细胞的最佳条件，我们对冲击 TCR-信号强度、共刺激、及细胞因子的添加进行了测试。在3 μ g/mL板结合抗-⑶3和5ng/mL TGF-β和IL-2的存在下实现转变成R)xp3+NKT细胞的最佳转变(图Ie)。进一步将IL-15 或IL-7添加至先前的细胞因子混合剂对iNKT细胞转变几乎没有影响(图幻。可以在不存在IL-2的情况下实现转变，但R)xp3+细胞的频率却大大降低(降低至约5%的水平)，这可能是因于这些细胞的扩增受损而造成的。相反，在含IL-2或IL-15但不存在TGF-β的培养物中可能不会诱导I^oxpS+iNKT细胞(图2)。确实，TGF-β浓度的滴定清楚地揭示，该细胞因子对于在iNKT细胞中诱导R)xp3至关重要(图If)。对于不同的TGF-β和胎牛血清批次，我们观察到经转变R)xp3+iNKT细胞的频率有一定变化(在20%与50%之间)。也对将抗-CD^单克隆抗体添加至培养物进行了测试，但并没有提高转变成R)Xp3+iNKT细胞的转变率(数据未显示)。这些数据清楚地证明，在iNKT细胞激活时，TGF-β信号会促进 Foxp3表达的诱导。实例2 :Foxp3+iNKT细胞展示和NKT细胞表型特性在确定iNKT淋巴细胞可表达R)Xp3后，我们对经转变细胞的表型进行了检验。 Foxp3+iNKT细胞的许多表型特性为体外经转变R)xp3+CD4 Treg细胞所共有两种细胞群均主要是CD25+、CTLA-4+、GITR+、⑶103+和IL_7Ra_(图3a)。然而，我们在两种细胞群之间观察到一些不同之处R)xp3+⑶4T细胞主要是⑶27+且对于⑶62L表达是不均一的，而 Foxp3+iNKT细胞主要是⑶27—和⑶6217。不存在⑶62L与⑶103的高表达联系在一起表明， 在体内，Foxp3+iNKT细胞被从淋巴结逐出并优先迁移至周边组织。确实，在将R)xp3+iNKT 细胞静脉注射至RAG2+小鼠后三周，我们可在肝中优先检测到这些细胞(见下文)。⑶4表达在iNKT淋巴细胞中的不均一性已得到确认9。令人感兴趣的是，我们发现表达R)Xp3的可能性并不限于⑶4+iNKT细胞亚群，而是⑶4+和⑶4—iNKT细胞均有可能(图 3b) 0我们还发现，大多数R)xp3+iNKT淋巴细胞为NKl. Γ、Κ 5_、和NKG2D+。另外，我们检测到在所分选的Γ^οχρβ+和R)xp3_iNKT细胞中存在PLZF的转录物，PLZF是据报导为NKT谱系特征的转录因子02)(图3c)。这些观察合在一起表明，在iNKT淋巴细胞中诱导R)xp3表达并不破坏它们基于来自T谱系和NK谱系二者的分子的非种系选择性表达(promiscuous expression)的 NKT 性质。实例3 :Foxp3+iNKT细胞i千移至肝并体内维持Foxd3表汰诱导基因表达程序后需考虑的基本方面是它的稳定性。此外，可明显看出，常规 Treg细胞的R)xp3表达的稳定性要低于最初的预期(38)。为了研究能否体内在iNKT细胞中维持R)Xp3表达，我们将转变后的R)xp3gfpiNKT或作为对照将体外诱导的R)xp3gfp CD4细胞注射入RAG2+小鼠体内。7天和21天后，评估脾、淋巴结(LN)、肺、肠和肝中iNKT细胞的表型。⑶4T细胞优先迁移至淋巴结，但也可在脾和肝中发现，而与⑶4T细胞不同，iNKT细胞不在淋巴结中，而是大部分在肝和肺中检测到，并且在早期的时间点上，还存在于脾中。 然而，三周后，Foxp3+iNKT细胞在脾中便不再检测到，而是存在于肝中，在肝中，高达80% 的iNKT细胞仍保持对R)xp3的表达(图4)。这些结果合起来表明，转变后iNKT的R)Xp3 表达的体内稳定性并不比转变后i^oxpS+Treg细胞差，尽管这两个群具有不同的生理生态位(physiological niche) :iNKT细胞优先寻靶至非淋巴器官，例如肝，而CD4Treg主要迁移至次级淋巴器官。实例4 =INKTreR细胞展示接触依赖GITR介导的抑制功能Foxp3是据报导可在外周⑶25TD4+T细胞中诱导基因程序、进而导致Treg表型和抑制功能的转录因子(39-41)。为评价R)Xp3+iNKT细胞的调节功能，我们对其抑制用APC和可溶性抗_CD3MAb刺激的CD25—CD4+ “应答者”细胞的增殖的能力进行了测试。我们使用从 Foxp3gfp小鼠获得的在TGF-β的存在下转变的iNKT细胞，并使用天然CD25highCD4+(nTreg) 细胞和体外转变的R)xp3+⑶4+T细胞(也来自Foxp3gfp小鼠)作为对照。调节细胞与应答细胞比率的滴定揭示，转变后的R)xp3+iNKT细胞确实能抑制靶CD25TD4+T细胞的增殖， 其效率类似于转变后的R)xp3+CD4+T细胞，且仅略微次于nTreg细胞的效率(图fe)。将抗-GITR(4 而非抗-IL10R中和抗体添加至培养物会使抑制作用逆转，表明GITR在由 Foxp3+iNKT淋巴细胞介导的调节功能中起主导作用(图恥)。与这些结果一致，当与应答细胞分开在转孔培养板(transwell)中培育时，Foxp3+iNKT细胞表现出严重受损的抑制功能(图5c)。这些结果证明，类似于常规Treg细胞，在iNKT淋巴细胞中诱导R)xp3会通过由GITR介导的接触依赖机制而赋予这些细胞以抑制功能。实例5 :Foxp3+iNKT细胞的体内分化为TGF-β依赖性在产生R)xp3gfp小鼠时，针对R)xp3的表达对主要的造血谱系进行筛选。在T淋巴细胞和B淋巴细胞、NKl. 1+细胞、巨噬细胞和树突细胞中，观察到R)xp3表达局限于α βΤ 细胞(37)。在该项研究中，NKT细胞被认为是NKl. I+TCRiT淋巴细胞且排除在该细胞亚群中的R)xp3表达。然而，有一小亚群的NKT细胞缺乏NKl. 1受体的表达。另外，常规T淋巴细胞的一些亚群可在激活时表达NKl. 1。因此，我们尝试用特异性识别不变NKT细胞的TCR 的四聚体来明确地找出不变NKT细胞，以此来证实那些观察结果。我们从幼稚C57B1/6小鼠的肝、脾、混合淋巴结(pooled LN)、派尔集合淋巴结(Peyer's Patches ；PP)以及胸腺收集单核细胞(图6a，b)。虽然一部分⑶4+T细胞表达R)xp3，但未在来自任何器官的iNKT细胞闸门(gate)内观察到可检测到的Foxp3表达。对于Balb/c小鼠和Foxp3gfp小鼠，获得类似的结果(图7)。
我们研究了肠暴露至α-GalCer是否可导致在肠系膜淋巴节(mesenteric lymph node ；MLN)中找到R)xp3+iNKT细胞，并以相同的方式研究了口服耐受(oral tolerance)是否会导致在MLN中再一次诱导R)xp3+Treg细胞03)。当通过胃内途径递送α-GalCer时， 我们观察到I^oxpS+iNKT细胞在MLN中的聚集，达到每只小鼠1383个(士 206，SD)的均值 (图6c)。值得注意的是，大多数来自MLN的R)Xp3+iNKT细胞表达低水平的CD25。为了测试 Foxp3+iNKT细胞的体内产生是否需要TGF-β，我们观察到当通过胃内灌服法将α -GalCer 递送至dnTGF0 RII小鼠时，未诱导R)xp3+iNKT细胞，在dnTGF0 RII小鼠中，T细胞和NKT 细胞不能转导TGF-β信号(图6c) (44)。我们还对过敏性气道疾病的小鼠模型进行了研究，在该模型中，已知iNKT细胞存在于含包括TGF-β在内的细胞因子的环境中，TGF-β是表征组织重塑的纤维化的关键介体G5)。我们对R)xp3在iNKT细胞以及对照CD4+T淋巴细胞中的表达进行了分析，这些细胞是从Balb/c小鼠和C57B1/6小鼠的肺分离出来的，而这些Balb/c小鼠和C57B1/6小鼠已根据已知可导致急性或慢性过敏性气道疾病的方案而用在氢氧化铝(明矾)中的卵清蛋白(OVA)敏化(腹腔注射)并随后用递送至气道的OVA激发(图8) (45)。我们发现，无论是急性还是慢性疾病，从大多数过敏小鼠的肺分选出的iNKT细胞均表达R)xp3，尽管表达水平要比所分选出的CD4+T细胞低(图6d)。值得注意的是，与CD4T细胞不同，从幼稚的未经处理的对照小鼠分选出的iNKT细胞不显示R)xp3表达(图6d)。合在一起，我们的观察表明，Foxp3+iNKT细胞并不天然地由胸腺产生，但是可在存在TGF-β的环境中在外周诱导。实例6:实骑件过敏脑炎(Experimental Allergic Encephalitis :EAE)保护与 Foxp3+iNKTreg细胞的局部存在有关我们使用多发性硬化症(multiple sclerosis ；MS)的实验性小鼠模型来验证先前被认为是由iNKT细胞的存在所产生的保护作用06)是否与R)Xp3+iNKTreg细胞的局部聚集有关。我们发现，在被征集至颈淋巴结的iNKT细胞中，存在R)xp3+iNKT细胞的过度表现(over-r印resentation)(图9)。令人注意的是，Foxp3+iNKT细胞的这一增加仅限于中枢神经系统(central nervous system ;CNS)-引流淋巴结，并未在全身中观察到(即，在不引流CNS的脾或淋巴结中)。这一观察结果表明，iNKTreg细胞可介导局部抗炎作用，但不导致全面的免疫抑制。我们还将α-GalCer投送至经受EAE诱导的小鼠。所有的经α-GalCer 处理的小鼠仍受到保护而没有罹患该病，并且在CNS-引流淋巴结中观察到R)xp3+NKTreg 细胞增多，进一步证实了我们的数据，即可以将NKT细胞激动剂用于NKTreg细胞的体内产生，能够预防免疫介导的疾病。实例7 人类iNKT细胞能转变成Foxp3+iNKI~reg细胞我们还对是否能在人类iNKT细胞中诱导R)xp3表达进行了评价。考虑到iNKT淋巴细胞在人类外周血液中的出现频率较低(47)，我们通过磁性分离来浓集全部的T细胞并将这些混合群在不仅含有TGF-β而且也含有抗IL-12、IFN-Y和IL-4的封闭抗体的混合剂的极化条件(被认为有利于人类CD4T细胞转变成R)Xp3+Treg的条件08))下进行培养。 培养5天后，高达40%的人类iNKT细胞已上调R)xp3，这一转变效率与常规⑶4+T细胞相当(图10)。转变后的人类R)xp3+NKT细胞为⑶25+、GITR+，且主要为⑶161+，而近乎一半的 Foxp3+iNKT 细胞表达 CD127。
实例8 通过原位产牛FoXD3+iNKT细胞来预防过敏件气道疾病(哮喘)我们使用得到确认的过敏性气道疾病小鼠模型(基于在第0天和第14天用在明矾中的卵清蛋白(OVA)或常见过敏原房尘螨(house dust mite ；HDM)敏化，随后在第20天、 第21天和第22天用过敏原进行鼻内激发)。我们对alpha-GalCer (NKT细胞刺激性化合物)单独或与TGF-β —起的鼻内给药是否能导致NKTreg细胞在气道中聚集并预防该疾病的临床表现进行测定。在用过敏原进行鼻内激发的日期里，同时给予NKTreg诱导治疗。通过组织切片中炎性浸润液的减少、肺勻浆中Th2细胞因子(IL-4、IL-5、IL-13)的减少、BAL 中嗜酸细胞含量的降低、以及气道超敏反应性的重大降低(通过对增加吸入乙酰甲胆碱的剂量的响应(在气道阻力方面)来判断)来评估疾病严重程度的降低。我们对不同的给药时间与过敏原进入气道的时间的关系进行了测试是否可以通过预先使气道暴露至NKTreg诱导治疗来预防这些表现；( 是否可以在与过敏原接触时以及伴随而来的在小鼠将具有明显的过敏性气道炎症时，通过给予NKTreg诱导治疗来降低疾病表现。参考文献1. Kronenberg, M.于 2005 年所发表的 Toward an understanding of NKT cell biology :progress and paradoxes。Annual review of immunology 23 :877_900o2. Gumperz，J. E.、S. Miyake、T. Yamamura> 以及 M. B. Brenner 于 2002 年所发表的 Functionally distinct subsets of CDld-restricted natural killer T cells revealed by CDld tetramer staining。 The Journal of experimental medicine 195 625-636。3. Michel, M. L. 、A. C. Keller> C. Paget、M. Fujio、 F. Trottein、 P. B. Savage> C. H. Wong、E. Schneider, M. Dy、以及 Μ. C. Leite-de-Moraes 于 2007 年所发表的 Identification of an IL-17-producing NKl. 1 (neg)iNKT cell population involved in airway neutrophilia。The Journal of experimental medicine 204 :995-1001。4. Coquet, J. M. 、 S. Chakravarti> K. Kyparissoudis> F. W. McNab> L. A. Pitt、 B.S.McKenzie、S.P.Berzins、M. J.Smyth、以及 D. I. Godfrey 于 2008 年所发表的 Diverse cytokine production by NKT cell subsets and identification of an IL-17-producing CD4-NK1. I-NKT cell population。 Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 105 :11287_11292。5. Rachitskaya, A. V.、A. M. Hansen、R. Horai> Z. Li、R. VillasmiK D. Luger、 R. B. Nussenblatt、以及 R. R. Caspi 于 2008 年所发表的 Cutting edge :NKT cells constitutively express IL—23 receptor and RORgammat and rapidly produce IL—17 upon receptor ligation in an IL-6-independent fashion。J Immunol 180 :5167_517106. Lee，K. A.、M. H. Kang、Y. S. Lee、Y. J. Kim、D. H. Kim、H. J. Ko、以及 C. Y. Kang 于 2008 年所发表的 A distinct subset of natural killer T cells produces IL—17, contributing to airway infiltration of neutrophils but not to airway hyperreactivity。 Cellular immunology 251:50_55o7. Niemeyer, Μ.、A. Darmoise>H. J. Mollenkopf >K. Hahnke>R. Hurwitz>G. S. Besra、 U. E.Schaible、以及 S.H.Kaufmann 于 2008 年所发表的 Natural killer T-cellcharacterization through gene expression profiling :an account of versatility bridging T helper type 1(Th l)，Th2 and Th 17 immune responses。 Immunology 123 45-56 ο8. Raftery, M. J. 、F. Winau^ T. Giese、 S. H. Kaufmann^ U. E. Schaible^ 以 R G· Schonrich于2008年所发表的 Viral danger signals control CDld de novo synthesis and NKT cell activation。 European journal of immunology 38 :668_679。9.Biburger，M.、以及 G. Tiegs 于 2008 年所发表的 Activation-induced NKT cell hyporesponsiveness protects from alpha-galactosylceramide hepatitis and is independent of active transregulatory factors。Journal of leukocyte biology 84 264-279 ο10. Moreno, M. 、 J. W. Moiling、 S. von Mensdorff-Pouilly^ R. H. Verhei jen、 E.Hooijberg、D. Kramer、A.W. ReursΛ A. J. van den EertweghΛ B. Μ. von Blomberg、 R. J. Scheperλ 以及 H· J· Bontkes 于 2008 年所发表的 IFN-gamma-producing human invariant NKT cells promote tumor-associated antigen-specific cytotoxic T cell responses。J Immunol 181 :2446_2454。11. Akbari，0.、P. Stock、E. Meyer、M. Kronenberg、S. Sidobre、T. NakayamaΛ Μ. Taniguchi、Μ. J. Grusby、R. H. DeKruyff、以及 D. Τ. Umetsu 于 2003 年所发表的 Essential role of NKT cells producing IL_4 and IL-13 in the development of allergen-induced airway hyperreactivity。 Nature medicine 9 :582_588012. Gober, M. D. 、R. Fishelevich^ Y. Zhao、D. Unutmaz^ 1 A. A. Gaspari T 2008 ^Bf^^WHuman natural killer T cells infiltrate into the skin at elicitation sites of allergic contact dermatitis。 The Journal of investigative dermatology 128 :1460-1469o13. Mattner, J. 、 P. B. Savage^ P. Leung、 S. S. Oertelt、V. Wang^ 0. Trivedi、 S. T. Scanlon、K. Pendem、L. Teyton、J. Hart、W. M. Ridgway、L S. Wicker、Μ. E. Gershwin、 以及 A· Bendelac 于 2008 年所发表的 Liver autoimmunity triggered by microbial activation of natural killer T cells。 Cell host & microbe 3 :304_315o14. Jiang, X. 、T. Shimaoka^ S. Kojo、M. Harada^ H. Watarai ^H. Wakao^N. Ohkohchi、 S. Yonehara、M. Taniguchi、以及K. Seino 于 2005 年所发表的 Cutting edge :critical role of CXCL16/CXCR6 in NKT cell trafficking in allograft tolerance。 J Immunol 175 2051-2055。15. Meyer, E. H.、S. Goya、0. Akbari、G. J. Berry、P. B. Savage、M. Kronenberg、 T. Nakayama^R. H. DeKruyff、以及 D. Τ. Umetsu 于 2006 年所发表的 Glycolipid activation of invariant T cell receptor+NK T cells is sufficient to induce airway hyperreactivity independent of conventional CD4+T cells。 Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 103 :2782_2787016. Hong, S. 、Μ. T. Wilson、I. Serizawa^ L. Wu^ N. Singh、0. V. Naidenko^ T. Miura^ T. Haba、D. C. Scherer、J. Wei、M. Kronenberg、Y. Koezuka、以及 L· Van Kaer 于 2001 年 Bf ^ ^ W The natural killer T一cell ligand alpha-galactosylceramide prevents
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权利要求
1.一种分离的1^0即3+天然杀伤T细胞。
2.一种分离的细胞群，包含(a)至少0.001 % Foxp3+天然杀伤细胞，或(b)至少10个R)xp3+天然杀伤T细胞。
3.如权利要求2所述的细胞群，其中R)xp3+天然杀伤T细胞所占百分比为至少 0. 001%、至少0. 01%、至少0. 05%、至少0. 1%、至少0. 5%、至少1%、至少5%、至少10%、 至少20 %、至少30 %、至少40 %、至少50 %、至少60 %、至少70 %、至少80 %、或至少90 %。
4.如权利要求2所述的细胞群，其中R)Xp3+天然杀伤T细胞的数目为至少1个、至少 10个、至少50个、至少100个、至少500个、至少1，000个、至少5，000个、至少10，000个、 至少50，000个、至少100，000个、至少1 X IO6个、至少1 X IO7个、或至少1 X IO8个细胞。
5.如权利要求2至4中任一项所述的细胞群，其中所述细胞群为血细胞群、白细胞群、 T细胞群、或天然杀伤T细胞群。
6.如权利要求2至4中任一项所述的细胞群，其中所述细胞群为T细胞群。
7.—种产生R)Xp3+天然杀伤T细胞的方法，所述方法包含使包含天然杀伤T细胞的细胞群与足以产生R)xp3+天然杀伤T细胞的量的TGF- β与一或多种NKT刺激剂的组合接触。
8.如权利要求7所述的方法，进一步包含使所述细胞群与IL-2接触。
9.如权利要求7或8所述的方法，进一步包含使所述细胞群与IL-7、IL-15及IL-21中的任一者或任一组合接触。
10.如权利要求7至9中任一项所述的方法，进一步包含使所述细胞群与选自由抗-IFN γ、抗-IL-4、抗-IL-6、抗-IL12及抗-IL-27组成群组的中和抗体中的任一者或任一组合接触。
11.如权利要求7至10中任一项所述的方法，其中所述细胞群是血细胞群、白细胞群、 T细胞群或天然杀伤T细胞群。
12.如权利要求7至11中任一项所述的方法，其中所述细胞群收获自个体。
13.一种增加R)xp3+天然杀伤T细胞的数目的方法，所述方法包含使包含至少一你即3+天然杀伤T细胞的细胞群与足以增加R)xp3+天然杀伤T细胞的数目的量的TGF-β、一或多种NKT刺激剂、一或多种增殖诱导细胞因子、及一或多种中和抗体的组合接触。
14.如权利要求13所述的方法，其中R)xp3+天然杀伤T细胞的数目增加至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少50倍、至少100倍、至少200倍、至少500倍、至少1000倍、至少 10，000倍、至少100，000倍、至少IO6倍、至少IO7倍。
15.如权利要求13或14所述的方法，其中所述增殖诱导细胞因子是IL-2、IL-7、IL-15 及IL-21中的一者或任一组合。
16.如权利要求14至16中任一项所述的方法，其中所述中和抗体是抗-IFNy、 抗-IL-4、抗-IL-6、抗-IL12及抗-IL-27中的任一者或任一组合。
17.一种将天然杀伤T细胞递送至个体的肝或粘膜组织的方法，所述方法包含向所述个体全身投予你即3+天然杀伤T细胞。
18.一种将天然杀伤T细胞递送至个体的肝或粘膜组织的方法，所述方法包含向所述个体局部投予你即3+天然杀伤T细胞。
19.如权利要求17或18所述的方法，其中所述R)xp3+天然杀伤T细胞是自体细胞。
20.如权利要求17至19中任一项所述的方法，其中通过使天然杀伤T细胞与足以产生 Foxp3+天然杀伤T细胞的量的一或多种NKT细胞刺激剂及TGF- β接触来产生所述R)xp3+ 天然杀伤T细胞。
21.如权利要求17至20中任一项所述的方法，其中以有效抑制肝或粘膜组织中的免疫应答的量投予所述你即3+天然杀伤T细胞。
22.如权利要求21所述的方法，其中抑制肝中的所述免疫应答旨在治疗移植物抗宿主病、由胰岛移植引起或与其有关的不期望的免疫应答、由肝移植引起或与其有关的不期望的免疫应答、或免疫介导的肝炎症。
23.如权利要求21所述的方法，其中所述R)xp3+天然杀伤T细胞与胰岛移植或肝移植结合投予。
24.如权利要求17至19中任一项所述的方法，其中所述R)xp3+天然杀伤T细胞的基因组包含编码多肽的核酸，以及其中将所述你即3+天然杀伤T细胞递送至肝使所述多肽在肝中得以表达。
25.—种抑制个体器官中的免疫应答的方法，所述方法包含将一或多种NKT刺激剂以足以抑制所述器官中的所述免疫应答的量局部递送至所述器官。
26.如权利要求25所述的方法，进一步包含将TGF-β以足以抑制所述器官中的所述免疫应答的量局部递送至所述器官。
27.如权利要求25或沈所述的方法，其中所述免疫应答是针对抗原的免疫应答。
28.如权利要求25或沈所述的方法，其中所述免疫应答是自身免疫应答。
29.如权利要求25至观中任一项所述的方法，其中所述器官是肠、或肺。
30.如权利要求四所述的方法，其中对所述免疫应答的所述抑制旨在治疗炎性肠病、 克罗恩氏病或哮喘。
31.如权利要求25至观中任一项所述的方法，其中所述局部递送至所述器官是递送至粘膜组织。
32.一种医药组合物，包括包含R)xp3+天然杀伤T细胞的细胞群。
33.如权利要求32所述的医药组合物，其中所述细胞群是血细胞群。
34.如权利要求32所述的医药组合物，其中所述细胞群是白细胞群。
35.如权利要求32所述的医药组合物，其中所述细胞群是T细胞群。
36.如权利要求32所述的医药组合物，其中所述细胞群是NKT细胞群。
37.一种医药组合物，包含TGF-β及一或多种NKT刺激剂。
全文摘要
本发明提供包含Foxp3+天然杀伤T细胞的细胞群、产生Foxp3+天然杀伤T细胞的方法以及抑制包括肝和肺在内的特定器官中的免疫应答的方法。
文档编号A61K35/12GK102216448SQ200980145224
公开日2011年10月12日 申请日期2009年11月13日 优先权日2008年11月13日
发明者玛尔塔·索非亚·费雷拉·蒙泰罗, 路易斯·里卡多·西蒙斯·达·席尔瓦·格拉萨 申请人:分子医学研究院, 里斯本大学