专利名称：一种具有提高人nk及nkt细胞杀伤肿瘤细胞活性的多肽及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于免疫学与基因工程技术领域，具体涉及一种具有提高人NK及NKT细胞杀伤肿瘤细胞活性的多肽(简称HA-FC)及其在抗肿瘤中的应用。
背景技术：
T淋巴细胞是免疫系统中主要的免疫细胞，在清除肿瘤细胞或病毒感染细胞中，T细胞的CTL发挥着重要的作用。但是CTL作用的前提是肿瘤或病毒抗原必须与自身细胞表面的MHC I类结合并递呈在细胞表面后才能被T细胞识别继而被T细胞清除，即所谓的MHC限制。然而，多数的肿瘤细胞以及部分病毒感染细胞为了逃逸机体的免疫监视，其细胞表面的MHC I类表达通常都明显下调甚至消失(称之为“缺失自我”)。此时，T细胞就无法发挥作用，机体对肿瘤细胞的免疫清除功能则主要由NK细胞来承担。与杀伤性T细胞不同，NK细胞的杀伤活性不需诱导即可直接杀灭肿瘤细胞和病毒感染细胞。因此，NK细胞在肿瘤的过继免疫治疗上，有着广泛的应用前景。NK细胞杀伤肿瘤细胞作用与T细胞的CTL细胞毒作用不同，NK的细胞毒作用不需要肿瘤抗原与MHC结合，就能够立即杀灭肿瘤细胞和病毒感染细胞。它的活性依靠其细胞表面的受体与靶细胞表面的配体相互作用来实现，这种激活是非特性的激活。此外，NK细胞还是连接特异性免疫与非特异性免疫的桥梁。抗体介导的特异性杀伤作用在NK细胞的抗肿瘤与抗病毒中也具有重要的作用。NK细胞通过自身表面的CD16与特异性抗体的Fe段结合，发挥ADCC作用(“抗体依赖性的细胞介导的细胞毒作用”，antibody-dependentcell-mediated cytotoxicity)。在抗体介导的ADCC作用过程中，抗体能与祀细胞上的相应抗原表位特异性结合，而NK细胞可杀伤任何已与抗体结合的靶细胞，抗体与靶细胞上的抗原结合是特异性的，NK细胞等对靶细胞的杀伤作用是非特异性的。在抗肿瘤与抗病毒免疫中，通过ADCC的效应，能使NK的抗肿瘤、抗病毒活性发挥更高、更强的效能。NK细胞与NKT细胞具有类似的抗肿瘤活性，但两种细胞来源不同NKT来源于T淋巴细胞。NK细胞直接由淋巴系干细胞分化而来。表面标记上NK细胞为⑶56阳性、⑶3阴性；NKT为CD56阳性、CD3阳性。噬菌体随机肽库是一种有效寻找能与某一特定目标蛋白特异结合的蛋白并确定其氨基酸序列的技术方法。曬菌体随机肽库有商品化的产品，筛选的结果取决于包被在96孔板上的目标蛋白。商品化的噬菌体随机肽库是由上亿种氨基酸随机排列的短肽与噬菌体外壳蛋白在基因水平进行连接后，以融合蛋白的形式表达(呈现)在噬菌体表面的多肽。库中上亿种多肽分别呈现在上亿个噬菌体表面，众多重组型噬菌体便组成了噬菌体随机肽库。随机肽库所用的噬菌体为丝状噬菌体。噬菌体随机肽库含有的大量不同序列结构多肽可作为筛选与任何靶蛋白表位结合的模拟肽。利用噬菌体肽库技术已经确定了许多蛋白分子的相互作用位点。
发明内容
本发明依据NK细胞借助抗体发挥ADCC作用的理论，首先，通过噬菌体随机肽库技术，分别筛选到了一条能与肿瘤抗原“天冬酰胺羟化酶”(肿瘤细胞高表达的一种抗原，广泛存在于各种恶性肿瘤细胞中)特异结合的多肽Gln His He Arg Glu Leu Pro Tyr ThrGly Gly Ser Ala Arg His Tyr Gly Ser Ser Tyr Tyr Phe Asp Tyr ;以及一条能与 CD16特异结合的多妝Ile Asn Pro Ala Trp Phe Ala Tyr Gly Gly Ser Gln Gln Ser Asn GluAsp Pro tyr Thr。在此基础上,通过人工肽合成的方式,将这两条肽的特点(氨基酸序列)合成在一条完整的肽链上，即本发明所指的多肽HA-FC。该多肽的氨基端具有模拟抗体的功能，能与肿瘤抗原“天冬酰胺羟化酶”特异结合；多肽的羧基端则模拟抗体的Fe段功能，能够与NK细胞上的CD16分子结合。通过HA-FC多肽的桥梁作用，NK细胞与肿瘤细胞更贴近、结合更加牢固，最终使NK细胞通过释放穿孔素与颗粒酶杀伤肿瘤细胞的效率更高。本发明的关键技术是获得了(筛选到了)能与天冬酰胺羟化酶特异结合的肽序列和能与CD16结合的肽序列。申请者采用噬菌体随机肽库的方法，分别以天冬酰胺羟化酶以及CD16为目标蛋白，对噬菌体肽库中能与天冬酰胺羟化酶结合的克隆以及肽库中能与CD16结合的克隆分别进行了筛选。筛选所用的目标蛋白是采用人工合成的天冬酰胺羟化酶肽段以及人工合成的⑶16肽段，以这两种合成的多肽分别包被96孔板进行筛选。本发明的目的在于公开了一种具有提高人NK及NKT细胞杀伤肿瘤细胞活性的多肽。本发明的第二个目的在于公开了具有提高人NK及NKT细胞杀伤肿瘤细胞活性的多肽在制备治疗肿瘤药物中的应用。本发明的目的是通过以下技术方案实现的一种具有提高人NK及NKT细胞杀伤肿瘤细胞活性的多肽，其中，所述多肽的序列如序列表I所示。一种具有提高人NK及NKT细胞杀伤肿瘤细胞活性的多肽，其中，所述多肽包括如序列表I所示的多肽序列。一种具有提高人NK及NKT细胞杀伤肿瘤细胞活性的多肽，其中，所述多肽为在序列表I所示序列中插入其他氨基酸后与序列表I所示序列保持80%以上同源性的多肽。上述技术方案所述的具有提高人NK及NKT细胞杀伤肿瘤细胞活性的多肽在制备治疗肿瘤药物中的应用。本发明应用噬菌体随机肽库技术，筛选到了能与天冬酰胺羟化酶特异结合的肽进而获得了其氨基酸序列信息(Gin His He Arg Glu Leu Pro Tyr Thr Gly Gly Ser AlaArg His Tyr Gly Ser Ser Tyr Tyr Phe Asp Tyr)。应用卩遼菌体随机肽库技术,筛选到了能与⑶16特异结合的肽进而获得了其氨基酸序列信息(lie Asn Pro Ala Trp Phe Ala TyrGly Gly Ser Gln Gln Ser Asn Glu Asp Pro tyr Thr)。依据这两条肽的氨基酸序列信息，随后人工合成出了一条多妝Gln His He Arg Glu Leu Pro Tyr Thr Gly Gly Ser AlaArg His Tyr Gly Ser Ser Tyr Tyr Phe Asp Tyr Gly Gly Ser He Asn Pro Ala Trp PheAla Tyr Gly Gly Ser Gln Gln Ser Asn Glu Asp Pro tyr Thr(对应序列的符号为QHIRELPYTGGSARHYGSSYYFDYGGSINPAWFAYGGSQQSNEDPYT)，其一端(氨基端)能与肿瘤抗原“天冬酰胺羟化酶”特异结合，另一端(羧基端)又能与NK及NKT细胞表面CD16分子特异结合。通过体外抗肿瘤活性的比较，确认该多肽(以下简称HA-FC)具有明显的增强NK细胞对肿瘤细胞的杀伤作用。该多肽链中能与“天冬酰胺羟化酶”特异结合的氨基端序列为Gln HisHe Arg Glu Leu Pro Tyr Thr Gly Gly Ser Ala Arg His Tyr Gly Ser Ser Tyr Tyr PheAsp Tyr ;能与⑶16特异结合的肽羧基端序列为Ile Asn Pro Ala Trp Phe Ala Tyr GlyGly Ser Gln Gln Ser Asn Glu Asp Pro tyr Thr。本发明具有以下有益效果I、本发明多肽的氨基端能与肿瘤抗原“天冬酰胺羟化酶”特异结合；其羧基端能够与NK细胞上的CD16分子结合，通过该多肽的桥梁作用，NK细胞与肿瘤细胞更贴近、结合更加牢固，最终使NK细胞通过释放穿孔素与颗粒酶杀伤肿瘤细胞的效率更高。2、将本发明的多肽应用于肿瘤的治疗时可使人NK细胞及NKT细胞对肿瘤细胞的杀伤活性提高20%以上；分别给肿瘤动物模型注射该多肽时，动物肿瘤模型上的瘤体明显缩小。
图I为能与天冬酰胺羟化酶结合的第一株噬菌体克隆DNA序列测定图；图2为能与天冬酰胺羟化酶结合的第二株噬菌体克隆DNA序列测定图；图3为能与⑶16结合的第三株噬菌体克隆DNA序列测定图；图4为能与⑶16结合的第四株噬菌体克隆DNA序列测定图。
具体实施例方式为使本发明的技术方案便于理解，以下结合具体试验例对本发明所述的多肽(以下简称“HA-FC”)作进一步的说明。实施例I :一、随机肽库的筛选PH. D.-12卩遼菌体随机肽库试剂盒购自美国NewEngland Biolabs公司。用于筛选的靶标蛋白分别为天冬酰胺羟化酶第61 —100位的氨基酸序列人工合成肽；人CD16第11-50位的氨基酸序列人工合成肽。筛选方法参照噬菌体肽库产品的说明书进行。筛选的噬菌体克隆，经序列测定，确定其基因序列并推导出其能与靶标蛋白结合的蛋白氨基酸序列。将能与天冬酰胺羟化酶结合的2株噬菌体克隆，测序，如图I和图2所示，获得的第一株噬菌体克隆的基因序列如序列表2所示为CAG CAC ATT CGA GM CTC CCA TAC ACC,第二株噬菌体克隆的基因序列如序列表4所示为GCT CGT CAC TAT GGC TCC TCC TAT TATTTC GAC TAT ;推导的氨基酸序列分别为Gln His He Arg Glu Leu Pro Tyr Thr (序列表3 所不)和 Ala Arg His Tyr Gly Ser Ser Tyr Tyr Phe Asp Tyr (序列表 5 所不)。通过连接子 Gly-Gly-Ser 将 Gln His He Arg Glu Leu Pro Tyr Thr 与 Ala Arg His Tyr GlySer Ser Tyr Tyr Phe Asp Tyr连接,获得了能与天冬酰胺轻化酶结合的氨基酸序列GlnHis He Arg Glu Leu Pro Tyr Thr Gly Gly Ser Ala Arg His Tyr Gly Ser Ser Tyr TyrPhe Asp Tyr (序列表10所示)。将能与⑶16结合的2株噬菌体克隆，测序，如图3和图4所示，获得的第三株噬菌体克隆的基因序列如序列表6所示为ATT AAC CCC GCA TGG TTT GCT TAT，第四株噬菌体克隆的基因序列如序列表8所示为CAA CAA TCT AAT GAA GAT CCA TAC ACA ;推导的氨基酸序列为Ile Asn Pro Ala Trp Phe Ala Tyr (如序列表 7 所不)和 Gln Gln Ser Asn GluAsp Pro Tyr Thr (如序列表 9 所不)。通过连接子 Gly-Gly-Ser 将 lie Asn Pro Ala TrpPhe Ala Tyr 和 Gln Gln Ser Asn Glu Asp Pro tyr Thr 连接，获得了能与 CD16 结合的氨基酸序列Ile Asn Pro Ala Trp Phe Ala Tyr Gly Gly Ser Gln Gln Ser Asn Glu AspPro Tyr Thr (如序列表11所示)；能与天冬酰胺羟化酶结合的氨基酸序列以及能够与CD16结合的氨基酸序列通过Gly-Gly-Ser 连接子连接，形成了本专利的多肽‘HA-FC’ Gln His He Arg Glu Leu ProTyr Thr Gly Gly Ser Ala Arg His Tyr Gly Ser Ser Tyr Tyr Phe Asp Tyr Gly Gly SerHe Asn Pro Ala Trp Phe Ala Tyr Gly Gly Ser Gln Gln Ser Asn Glu Asp Pro TyrThr (序列表I所示)。上述图I、图2、图3和图4中的碱基序列与峰之间从左至右依次对应。二、人工合成多肽具有ADCC活性的多肽‘HA-FC’由47个氨基酸组成，多肽的合成由美联生物科技有限公司完成，合成方法采用化学合成法，合成肽的纯度在85%以上；本发明以下的多肽合成均由美联生物科技有限公司完成。以下通过具体试验例来说明本发明的人工合成多肽所具有的提高NK细胞对肿瘤细胞杀伤活性有益效果。试验例I :多肽提高NK细胞对肿瘤细胞杀伤活性的体外实验96孔培养板，肽实验孔按照不同的肽浓度分为6个组，每组4孔。另设有不加肽的对照组4个孔。以上每孔分别加入50万个NK细胞(效应细胞)后，每孔再分别加入10万个肿瘤细胞K562 (靶细胞)，在效靶比为5:1条件下测定NK细胞对靶细胞的杀伤活性。每孔总体积200 μ I (液体为含10%小牛血清的1640培养液)，6组肽实验组，各孔中‘HA-FC’的浓度分别为 0. lmg/ml、0. 05mg/ml、O. O lmg/ml、0. 005mg/ml、0. 00 lmg/ml、0. 0005mg/ml。37°C C02培养箱4h，每孔加入20 μ I MTT细胞活性检测试剂，37°C C02培养箱2h，550nm波长测定吸光值，计算杀伤率。同时设只有NK细胞以及只有K562细胞的对照孔。按照公式(一)计算杀伤率，人NK细胞的获取，采用NK细胞分离试剂盒，从人的外周血单个核细胞中分离，杀伤实验结果如表I所示公式(一):杀伤率(%)=〔 I — (0De+t — 0De) / 0Dt) X 100% ；其中ODe :单纯效应细胞孔即NK细胞孔的OD值；ODt :单纯靶细胞孔即K562细胞孔的OD值；0De+t :效应细胞加靶细胞孔的OD值；表I不同浓度‘HA-FC’对NK细胞杀伤K562肿瘤细胞的影响
i(A-l'C5 Omg- ml 4' 0. Inigiinl (I ufijnii/jnl (J· Olmg., hi I 0. oorsmg/ml tLf),
权利要求
1.一种具有提高人NK及NKT细胞杀伤肿瘤细胞活性的多肽，其特征在于所述多肽的序列如序列表I所示。
2.一种具有提高人NK及NKT细胞杀伤肿瘤细胞活性的多肽，其特征在于所述多肽包含如序列表I所示序列。
3.一种具有提高人NK及NKT细胞杀伤肿瘤细胞活性的多肽，其特征在于所述多肽为在序列表I所示序列中插入其他氨基酸后与序列表I所示序列保持80%以上同源性的多肽。
4.权利要求1-3中任一权利要求所述的具有提高人NK及NKT细胞杀伤肿瘤细胞活性的多肽在制备治疗肿瘤药物中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种具有提高人NK及NKT细胞杀伤肿瘤细胞活性的多肽及其应用，属于免疫学与基因工程技术领域。该具有提高人NK及NKT细胞杀伤肿瘤细胞活性的多肽为(1)、如序列表1所示序列的多肽，或(2)、包含如序列表1所示序列的多肽，或(3)、为在序列表1所示序列中插入其他氨基酸后与序列表1所示序列保持80%以上同源性的多肽。本发明所述的具有提高人NK及NKT细胞杀伤肿瘤细胞活性的多肽在制备治疗肿瘤药物中的应用。本发明多肽具有氨基端能与肿瘤抗原“天冬酰胺羟化酶”特异结合；其羧基端能够与NK细胞上的CD16分子结合，通过该多肽的桥梁作用，NK细胞与肿瘤细胞更贴近、结合更加牢固，最终使NK细胞通过释放穿孔素与颗粒酶杀伤肿瘤细胞的效率更高的优点。
文档编号A61P35/00GK102924579SQ201210406318
公开日2013年2月13日 申请日期2012年10月22日 优先权日2012年10月22日
发明者曾荣南, 马旭东, 黄文华, 许慎, 黄建丽, 黄俊达 申请人:曾荣南, 马旭东, 黄文华