专利名称：利用淋巴因子激活的杀伤细胞制备肿瘤坏死因子的制作方法
本发现属细胞因子领域。具体说是利用淋巴因子激活的杀伤细胞制备肿瘤坏死因子。
1975年，Carswell发现用卡介苗和内毒素先后感染小鼠后，其血清中会有一种不同于内毒素的物质。该物质能使动物和人类肿瘤出血坏死。称之为肿瘤坏死因子(Tumor Necrosis Factor，简称TNF)。其后越来越多的研究所竞相研制生产TNF，并应用于临床治疗肿瘤患者取得了可喜的疗效。
制备TNF的方法大致有3种1、外周血单个核细胞经卡介苗(BCG)和细菌脂多糖(LPS)刺激生产TNF，该法产量低，106个单个核细胞只能产生10单位的TNF，且其水平常因供血者不同而异。
2、利用动物生产TNF。用BCG、症原虫、短小棒状杆菌或鼠麻风分枝杆菌注射动物后，再用内毒素处理，则动物血清中会有TNF活性。这些方法都有不足之处，如症原虫难得到，难培养，还需特殊处理。BCG及短小棒状杆菌价格昂贵，不宜用于大规模生产。鼠麻风分枝杆菌则不但体外难以生产，而且只能用于感染小啮齿类动物。
3、基因工程大肠杆菌生产TNF。该法虽产量高，但技术复杂，其产物会有细菌菌体和代谢产物，如内毒素等，对后处理的要求也相当高。
本发明的目的在于避免上述现有技术中的不足之处而提供一种利用淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK细胞)制备TNF的方法。
本发明的目的可以通过以下措施来达到一种利用淋巴因子激活的杀伤细胞制备肿瘤坏死因子。其特征是用诱导剂直接与淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK细胞)混合，在培养箱中放置12～36小时，其上清液就会有肿瘤坏因子(TNF)。
本发明下面将结合实施例作进一步描述1、LAK细胞的诱导，取正常人外周血(脾脏中的淋巴细胞)10ml，肝素抗凝，RPMI 1640对倍稀释，Ficoll-Hgpague分离(2000rpm×20分钟)，取单个核细胞，RPMI1640洗涤，计数，用RPMI 1640培养液加2%AB血清(或用AIMV无血清培养基替代)调整细胞数至1×106/ml，加白细胞介素-2，100μ/ml，将细胞悬液加到细胞培养并内，置37℃，5% CO2孵箱中培养，每2-4天计数一次，并加入新鲜的含有白细胞介素-2的培养液，调整细胞数至1×106/ml，培养2-3周。
2、TNF的产生，取对数生长的K562肿瘤细胞(或Raji细胞、HL-60肿瘤细胞等、或用LPS、PHA等)。用RPMI1640洗涤，调整细胞数至1×106/ml按LAK细胞对肿瘤细胞100∶1的比例混合，在37℃，5% CO2孵箱中培养24小时，离心(1000rpm×10分钟)，取上清液备用，该上清液即含有TNF。
3、TNF纯化 将含有TNF的上清液直接加入免疫亲和层析栓上，以100-200ml/h速率过栓，然后用1mol/LNaCl和0.5%Nonidet P-40Tris充分冲洗涤亲和层析栓，最后用1.5%醋酸洗脱，收集洗脱液即得纯化的TNF。
本发明相比现有技术具有如下优点1、产量高，每个LAK细胞大约为每个核细胞产生TNF的10倍;
2、体外扩增，经过2～3周的长期培养，LAK细胞可扩增到200倍;
3、可用无血清培养基培养，利于纯化;
4、不含内毒素;
5、操作简便;
权利要求
1.一种利用淋巴因子激活的杀伤细胞制备肿瘤坏死因子，其特征是用诱导剂直接与淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK细胞)混合，在培养箱中放置12～36小时，其上清液就会有肿瘤坏因子(TNF)。
2.根据权利要求1所述的利用淋巴因子激活的杀伤细胞制备肿瘤坏死因子，其特征是诱导剂为K562肿瘤细胞、HL-60肿瘤细胞或LPS。
全文摘要
一种利用淋巴因子激活的杀伤细胞制备肿瘤坏死因子。其特征是用诱导剂直接与淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK细胞)混合，在培养箱中放置12～36小时。其上清液就会有肿瘤坏因子(TNF)。本发明其优点是产量高，每个LAK细胞大约为每个核细胞产生TNF的10倍；体外扩增。经过2～3周的长期培养，LAK细胞可扩增到200倍；可用无血清培养基培养，利于纯化；不含内毒素，操作简便。
文档编号C12N5/06GK1093404SQ93110749
公开日1994年10月12日 申请日期1993年4月7日 优先权日1993年4月7日
发明者仇志根 申请人:仇志根