专利名称：：用作疫苗的融合抗原的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种融合抗原。更具体而言，本发明涉及一种用作T-细胞疫苗的融合抗原。
背景技术：
：细胞介导的免疫反应依赖T-淋巴细胞与载有T-细胞识别抗原的细胞之间的直接交互作用。在受感染的体细胞中，病毒利用细胞本身的合成机制在细胞内复制，而T-细胞则识别受病毒感染的体细胞。然而，在病毒复制过程中所产生的抗原会出现在受感染细胞的表面(MHCI类)，被杀伤性T-细胞(CD8+T-细胞)识别，杀伤性T-细胞可在病毒复制完成前杀死细胞以控制感染。用于预防病毒感染的疫苗通常为活体减毒生物，其致病性虽已减弱，但可剌激保护性免疫。当病毒复制形成内源性加工肽时，用作减毒活疫苗的活病毒的外源蛋白在抗原呈递细胞(APC)的内质网(ER)腔中被识别与加工。上述加工过程包括抗原修饰以及适度消化。然而，减毒活疫苗，尤其是RNA病毒，具有强烈的毒性和毒力恢复的倾向。例如，传染性喉气管炎病毒(ILTV)的疫苗与减毒株两者皆有毒性恢复的情形。此外，病毒必须经历多次传代。因此其唤起免疫反应的能力受到质疑。开发减毒活疫苗是一项费时的工程。为防止减毒活疫苗恢复毒性，正在开发如假狂犬病疫苗、gl基因缺失疫苗以及PRV标记疫苗等基因缺陷疫苗。使用牛痘或禽痘的病毒或细菌作为携带抗原基因载体。通过DNA重组技术，可縮短优良疫苗的研发时间，且可同时取得同一疫苗的多种血清型。这些疫苗的实例为禽痘病毒及沙门氏菌载体系统及美国的SyntroVet基因重组疫苗。另一方面，在使用微生物，尤其是RNA病毒，作为载体疫苗时，这些微生物会衍生新品种或新菌株。这些载体疫苗的安全性再次受到挑战。此外，传统重组亚单位疫苗对于触发细胞介导的免疫反应通常效果不彰。重组亚单位疫苗为外源性抗原，会被摄入巨噬细胞、树突状细胞与B-淋巴细胞内。这种来自外源性抗原且带有免疫原表位的肽是在抗原透过液相胞饮作用或膜结合受体而内化至APC之后产生。然后在APC的内体区室中产生肽，并通过空的MHCII类分子将其分类，从而基于MHCII类分子与肽间的亲合性，形成肽-MHCII类复合物。肽-MHCII类复合物然后易位至APC表面，以便被CD4+T-细胞识别。然而，由CD8+T-细胞识别的亚单位型蛋白并不能成为有效的疫苗，因为其一旦施用，便被内化至内体区室内，且可能于该处大幅降解或无法与MHCI类途径产生交互作用。此外，CD4+细胞(Th细胞)可分别通过Thl与Th2辅助T-细胞激活体液免疫反应与细胞介导的免疫反应。Thl与Th2细胞可彼此调节以达到体液免疫与细胞介导的免疫反应的平衡。可感染如T-细胞、B-细胞、树突细胞、单核细胞或巨噬细胞的免疫细胞的病毒已有相关发现与研究。这种感染猪的病毒的实例为猪生殖与呼吸综合征病毒(porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus)与II型环状病毒，以及感染人的病毒的人免疫缺陷病毒。这些病毒在抗原呈递细胞中关闭识别作为抗原的外源蛋白的能力。当免疫细胞无法唤起免疫反应并载运病毒时，已被这些类型病毒感染的动物极易受到其它病原体的二次感染。不幸的是，目前仍缺乏可针对感染病毒的免疫细胞产生作用的有效疫苗。尤其，猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)每年皆对畜牧业造成高额损失。该病毒感染巨噬细胞(肺泡及脾脏内)、脑部小胶质细胞及单核细胞，并存在于被感染动物的血液及器官中。抗体对此病毒的效果不大，甚至剌激病毒突变。在抗体依赖性增强作用(ADE)的机制中，抗体的使用反而引发更严重的感染。大约50%至80%的猪受到该种病毒感染。通常，被该病毒感染的动物无明显症状，但被感染动物的免疫力降低。由于二次感染，这导致增重率降低与死亡率升高。PRRSV为一种RNA病毒。除了猪，鸭类亦可能感染PRRSV。目前已有用于抵抗PRRSV的减毒活疫苗问世。然而，病毒于活体疫苗中的突变经常发生。所幸近期的HIV疫苗研发报告已明确指出杀伤性T-细胞(CTL)为控制HIV感染所必须(HanneG-Setal.，2000，Journalofvirology,volJ4，No.4.p.l694-1703)。开发一种安全有效的PRRS疫苗实为当务之急。因此，如何解决现有技术的缺失与不足，尤其是研发可抵抗病毒感染的T-细胞疫苗，已是产学界刻不容缓之要务。
发明内容在一个技术方案中，本发明涉及一种靶细胞特异性融合抗原，其包含(a)抗原部分；(b)配体部分，其能够与所述靶细胞上的受体反应、识别该受体或者与该受体结合；(c)假单胞菌外毒素A易位结构域II;以及(d)羧基末端部分，其包含具有氨基酸序列KDEL的多肽。该抗原部分源于猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)ORFlb。在另一技术方案中，本发明涉及一种靶细胞特异性融合抗原，其主要由以下部分组成(a)抗原部分；(b)配体部分，其能够与所述靶细胞上的受体反应、识别该受体或者与该受体结合；(c)假单胞菌外毒素A易位结构域II;以及(d)羧基末端部分，其包含具有氨基酸序列KDEL的多肽。该抗原部分源于综合征PRRSVORFlb。在又一技术方案中，本发明涉及一种靶细胞特异性融合抗原，其包含(a)抗原部分；(b)配体部分，其能够与所述靶细胞上的受体反应、识别该受体或者与该受体结合；(c)假单胞菌外毒素A易位结构域II;以及(d)羧基末端部分，其包含具有氨基酸序列KDEL的多肽。该抗原部分源于选自由马动脉炎病毒、II型环状病毒、人免疫缺陷病毒、乳酸脱氢酶增高病毒以及猴出血热病毒组成的组中的病原体。在又一技术方案中，本发明涉及一种靶细胞特异性融合抗原，其主要由以下部分组成(a)抗原部分；(b)配体部分，其能够与所述靶细胞上的受体反应、识别该受体或者与该受体结合；(c)假单胞菌外毒素A易位结构域II;以及(d)羧基末端部分，其包含4具有氨基酸序列KDEL的多肽。该抗原部分源于选自由马动脉炎病毒、II型环状病毒、人免疫缺陷病毒、乳酸脱氢酶增高病毒以及猴出血热病毒组成的组中的病原体。图IA说明PRRSVORFlb亚克隆片段Nspll(核苷酸10805核苷酸11297，上半部)与蛋白片段Nsp10及Nspll加K13的对应的氨基酸序列(下半部)。图IB说明图1A中蛋白片段对应的三字母氨基酸序列(SEQIDNO:1)。图2说明M12-K13DNA片段的核苷酸序列(SEQIDNO:2)。图3说明质粒pPE-K13图谱，其中PE代表PE(AIII)。图4说明质粒pPE-M12-K13图谱，其中PE代表PE(AIII)。图5说明融合抗原PE-M12-K13及PE-DgD-K13在免疫小鼠的脾细胞中诱发抗原特异性IFNY的分泌。图6说明融合抗原PE-M12-K13及PE-DgD-K13在免疫小鼠的脾细胞中诱发抗原特异性TNFa的分泌。具体实施例方式本说明书通篇所用术语，其在本发明范围内及在本说明书特定上下文中的解释大致均依照各术语于本领域中的通常涵义。本说明书中用以描述本发明之特定用语将于下文中或于本说明书他处加以说明，以利业界人士了解本发明的相关说明。为便于阅读，特定用语可能以斜体字和/或引号等格式特别标示。使用特别标示并不影响该用语的范围及意涵。这些用语不论是否经特别标示，其在相同上下文中之范围及意涵仍为相同。在本文中，相同之文意可能以不同方式表达。因此，本文所述之用语皆可以其替代用语及同义词代替，且一用语是否在本文中经详细说明或讨论，并无任何特别意义。在此将提供特定用语的同义词。各同义词的使用不应视为对其他同义词的排除。本说明书所用的实例，包括在此所讨论的任一用语的范例，仅供说明之用，而非用以限制本发明或任何示例用语的范围与意涵。同样地，本发明亦不限于在此所举之实施例。除非另行定义，否则在此所用的所有技术与科学用语的意涵均与熟习本发明相关领域人士所普遍了解的相同。若有相互冲突之处，则以本说明书及其中所提供之定义为解释依据。在此所述的"大约"、"约略"或"概为"一般指给出的数值或范围的百分之二十以内，较理想地为百分之十以内，更理想地为百分之五以内。在此所提供的数量为约略值，意指即便"大约"、"约略"或"概为"等用语未有书明之处，亦包含此等用语的涵义。本发明提供一种靶细胞特异性融合抗原，其包含抗原部分；配体部分，其能够与所述靶细胞上的受体反应、识别该受体或者与该受体结合；假单胞菌外毒素A易位结构域II;以及羧基末端部分，其使该融合抗原留存于该靶细胞的内质网(ER)膜内。在此所用术语"融合抗原"指可在动物体内唤起免疫反应的重组蛋白。较佳地，该融合抗原包含用于直接唤起免疫反应的表位以及用于增强免疫反应(例如媒介传递、转运、加工及呈递)或用于提供多重功能的其它部分。较佳地，该靶细胞为抗原呈递细胞。更佳地，该靶细胞选自由T-细胞、b-细胞、树突细胞、单核细胞与巨噬细胞组成的组中。在此所用术语"抗原部分"指可唤起免疫反应的肽片段。在本发明的一个实施方式中，该抗原部分为表位。根据本发明，该抗原部分为致病物种的蛋白，其可高度激活免疫反应。例如，这些蛋白质包括但不限于外壳蛋白、核蛋白或细胞膜蛋白。该抗原部分可为直接从致病物种克隆的肽以及由本领域技术人员修饰以增强免疫反应唤起能力的肽，从而成为方便制造与运送的重组蛋白。较理想地，该抗原部分源于猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、II型环状病毒或人免疫缺陷病毒。较理想地，该抗原部分可为PRRSV0RF1、lb、2、3、4、5、6或7。在本发明的一个较佳实施方式中，该抗原部分为PRRSVORFlb或M12冠状区。为唤起更强烈的免疫反应，该抗原部分包含至少一个抗原单位，且以桥接区连接相邻的抗原单位。根据本发明，该桥接区可为一小片段的肽，其唤起的免疫反应微小至免疫系统无法辨别其存在的程度。在此所用术语"配体部分"一般指能够与靶细胞上的受体进行反应、识别该受体或者与该受体结合的所有分子。这些受体的实例包括但不限于抗体受体、生长因子受体、淋巴因子受体、细胞因子受体、激素受体等等。在本发明的一些实施方式中，与配体部分结合的受体选自以下组成的组中TGFa受体、IL2受体、IL4受体、IL6受体、IGF1受体、CD4受体、IL18受体、IL12受体、EGF受体、LDL受体与a2-巨球蛋白受体。该配体部分具有与靶细胞的细胞膜结合以将该融合抗原定位于所述靶细胞的能力。免疫系统系通过融合抗原与靶细胞上的受体结合而启动。较佳地，该配体部分为假单胞菌外毒素A结合域I。假单胞菌外毒素A(PE)是由613个氨基酸组成的单一多肽链。PE分子的X光结晶学研究与突变分析显示PE由三个区域组成氨基末端细胞受体结合域(区域I);中间易位结构域(区域II);以及羧基末端活性域(结构域III)(参见美国专利第5,705,163号，于此合并参照)。在此所用术语"假单胞菌外毒素A结合域I"指与假单胞菌外毒素A的氨基末端细胞受体结合域具有相同序列或者具有功能相当片段的肽片段。假单胞菌外毒素A的氨基末端细胞受体结合域包含两个亚域，分别命名为区域Ia及区域Ib。区域Ia及区域Ib的构造可与细胞表面上的LDL受体或a2-巨球蛋白受体结合。在此所用术语"假单胞菌外毒素A结合域II"指与假单胞菌外毒素A的中间易位结构域具有相同序列或具有功能相当片段的肽片段。假单胞菌外毒素A易位结构域II具有将融合抗原易位至靶细胞的细胞质的功能。融合抗原在附着于靶细胞膜之后，易位至靶细胞中。在此所用术语"使融合抗原留存于靶细胞内质网(er)膜内的羧基末端部分"指可使融合抗原与ER膜结合并将其留存于ER腔内以实现醣基化作用并且使该融合抗原看来更接近外源蛋白的肽片段。在本发明的一个实施方式中，该羧基末端部分包含以下氨基酸残基，其沿从氨基端至羧基端的方向依序为R、r2-R3-R4-(R5)11其中W为带正电的氨基酸残基；r2为带负电的氨基酸残基；R3为带负电的氨基酸残基；R4为L;R5为带正电的氨基酸残基；且n为0或1。较佳地，该羧基末端部分为KDEL家族蛋白中的成员。在此所用术语"KDEL家族蛋白"指一组蛋白质，其具有与细胞ER膜结合的相似羧基端，并进一步具有可将该蛋白质留存于ER腔中的能力。通常，该羧基端之长度介于416个残基之间。如美国专利第5,705,163号(在此合并参照)所述，位于KDEL家族蛋白羧基端上的氨基残基，尤其是最后五个氨基酸中的氨基残基，占有十分重要的地位。根据针对存在于不同分子中且可执行特定生物机能的相似序列所做的研究显示，一种可在内质网中留存新形成蛋白的序列为LysAspGluLeu(KDEL)(SEQIDNO:9)。此发现说明根据本发明的融合抗原的羧基端上的序列可作为某种类型的识别序列，协助融合抗原从内吞区室易位至ER内并将其留置于腔中。在一个较佳实施方式中，该羧基末端部分包含KDEL的序列(SEQIDNO:9)。在一更理想的实施方式中，该羧基末端部分包含KKDL-RDEL-KDEL的序列(SEQIDNO:5)、KKDELRDELKDEL的序列(SEQIDNO:6)或KKDELRVELKDEL的序列(SEQIDNO:7)或KKDEL-RXEL-KDEL的序列，其中R为D或V。本发明的特征在于羧基末端部分的设计，其使融合抗原能够在靶细胞的ER内被加工以与MHCI类分子结合，并由T-细胞加以识别。本发明的融合抗原具有触发细胞介导的免疫反应的功效。根据本发明，该融合抗原用于动物免疫。本发明的目的之一在于提供一种药物组合物，其包含本发明的融合抗原与可药用载体。较理想地，该药物组合物为T-细胞疫苗。在此所用术语"T-细胞疫苗"指可通过激活细胞介导的免疫反应来保护受试者免受感染的疫苗。杀伤性T-细胞(亦称为杀伤性T-淋巴细胞、CD8+T-细胞和CTL)与记忆T-细胞(T。m及U为T-细胞疫苗的关键角色。本发明亦提供一种使动物免疫的方法，该方法包括以下步骤(a)提供一种靶细胞特异性融合抗原，其包含抗原部分；配体部分，其能够与所述靶细胞上的受体反应、识别该受体或者与该受体结合；假单胞菌外毒素A易位结构域II;以及羧基末端部分，其使该融合抗原留存于该靶细胞的内质网(ER)膜中；以及(b)将该融合抗原接种于所述动物体内。在本方法的步骤(b)中，可以本领域技术人员已知的任何方式对动物进行接种。例如，可经由注射或以口服疫苗的形式投送该融合抗原。并可视需要进行后续补强疫苗注射。较理想地，在感染发生前进行预防性接种。亦可对新生动物，甚至是胚胎，进行此融合疫苗的接种以助其提升免疫性。根据本发明，免疫反应过程包括以下动作(C)靶细胞膜与配体部分结合，从而将融合抗原定位于靶细胞；(d)融合抗原通过假单胞菌外毒素A易位结构域II易位至靶细胞的细胞质中；(e)靶细胞的ER膜与融合抗原的羧基末端部分结合，从而将融合抗原留置于ER腔中；7[OO53](f)抗原部分在ER腔中被加工；(g)加工后的抗原部分与MHCI类分子结合；(h)加工后的抗原部分由该MHCI类分子载运至靶细胞表面；(i)由该MHCI类分子载运的加工后的抗原部分经CD8+T-细胞识别以取得免疫信息；以及(j)记忆T-细胞储存该免疫信息以使该动物免疫。在动作(c)中，融合抗原的配体部分引导融合抗原与靶细胞膜上的受体结合，以便将融合抗原定位于靶细胞。在动作(d)中，融合抗原由假单胞菌外毒素A易位结构域II易位至靶细胞细胞质中。此易位引导融合抗原进入靶细胞。在动作(e)中，融合抗原的羧基末端部分与靶细胞的ER膜结合，从而将融合抗原留存于ER腔中，以便加工融合抗原。在动作(f)中，抗原部分在ER腔中接受加工。所谓加工包括但不限于在ER腔中进行如醣基化和由酶适度消化的抗原修饰。在动作(g)中，加工后的融合抗原可与MHCI类分子结合。MHCI类分子本身即为一种不完全折叠蛋白并且与许多伴侣蛋白结合。加工后的融合抗原与肽结合槽裂进行结合以完成折叠，且促进伴侣蛋白的释放。在动作(h)中，处理后的抗原部分通过MHCI类分子呈现于靶细胞表面。折叠后的MHCI类分子与加工后的抗原部分被送至细胞表面。在动作(i)中，由MHCI类分子所载运的加工后的抗原部分经CD8+T-细胞识别以取得免疫信息，该免疫信息系用于杀伤性T-细胞的识别且该免疫信息系存入记忆T-细胞中。记忆T-细胞之实例为Tcm以及Tem细胞。在动作(j)中，免疫信息被存入记忆T-细胞以使动物免疫。当已接受该融合抗原免疫的动物再次感染相同抗原时，记忆T-细胞可在短时间内唤起更强烈的免疫反应。T-细胞疫苗提供内源加工抗原，其可在靶细胞的ER腔内加工。在一个技术方案中，本发明提供一种靶细胞特异性融合抗原，其包含(a)抗原部分；(b)配体部分，其能够与所述靶细胞上的受体反应、识别该受体或者与该受体结合；(c)假单胞菌外毒素A易位结构域II;以及(d)羧基末端部分，其包含具有氨基酸序列KDEL的多肽。在另一技术方案中，本发明涉及一种靶细胞特异性融合抗原，其主要由以下部分组成(a)抗原部分；(b)配体部分，其能够与所述靶细胞上的受体反应、识别该受体或者与该受体结合；(c)假单胞菌外毒素A易位结构域II;以及(d)羧基末端部分，其包含具有氨基酸序列KDEL的多肽。在又一技术方案中，本发明涉及一种靶细胞特异性融合抗原，其包含(a)抗原部分；(b)配体部分，其能够与所述靶细胞上的受体反应、识别该受体或者与该受体结合；(c)假单胞菌外毒素A易位结构域II;以及(d)羧基末端部分，其包含具有氨基酸序列KDEL的多肽。该抗原部分源于选自由马动脉炎病毒、II型环状病毒、人免疫缺陷病毒、乳酸脱氢酶增高病毒以及猴出血热病毒组成的组中的病原体。在又一技术方案中，本发明涉及一种靶细胞特异性融合抗原，其主要由以下部8分组成(a)抗原部分；(b)配体部分，其能够与所述靶细胞上的受体反应、识别该受体或者与该受体结合；(C)假单胞菌外毒素A易位结构域II;以及(d)羧基末端部分，其包含具有氨基酸序列KDEL的多肽。该抗原部分源于选自由马动脉炎病毒、II型环状病毒、人免疫缺陷病毒、乳酸脱氢酶增高病毒以及猴出血热病毒组成的组中的病原体。在本发明的一个实施方式中，该抗原部分源于猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)ORFlb。该抗原部分可包含具有SEQIDNO:1所述的氨基酸序列的多肽。在本发明的另一实施方式中，该抗原部分包含多肽，该多肽是包含SEQIDNO:2所述的核苷酸序列的DNA片段的翻译产物。在本发明的又一实施方式中，该抗原部分源于PRRSVNsplO与Nspll。在本发明的一个实施方式中，该配体部分为假单胞菌外毒素A结合域I。在本发明的另一实施方式中，该羧基末端部分包含具有氨基酸序列KKDELRXELKDEL的多肽，其中X为V或D。该羧基末端部分可经由限制酶切位点接头而与该抗原部分连接。在另一技术方案中，本发明还涉及一种药物组合物，其包含如上所述的融合抗原以及可药用载体。在本发明的一个实施方式中，该药物组合物包含第一融合抗原，其中第一融合抗原包含(a)源于PRRSVORFlb的抗原部分；(b)配体部分，其能够与所述靶细胞上的受体反应、识别该受体或者与该受体结合；(c)假单胞菌外毒素A易位结构域II;以及(d)羧基末端部分，其包含具有氨基酸序列KDEL的多肽。该药物组合物可进一步包含靶细胞特异性第二融合抗原，其中第二融合抗原包含(a)源于PRRSVORF7的抗原部分；(b)配体部分，其能够与所述靶细胞上的受体反应、识别该受体或者与该受体结合；(c)假单胞菌外毒素A易位结构域II;以及(d)羧基末端部分，其包含具有氨基酸序列KDEL的多肽。在另一技术方案中，本发明再涉及一种在动物体内诱发免疫反应以对抗病原体感染的方法。该方法包括以下步骤(a)提供上述之一种药物组合物；以及(b)将该融合抗原接种于所述动物体内，其中该免疫反应针对所述病原体，所述抗原部分源于该病源体。在本发明的一个实施方式例中，本方法提供一种包含融合蛋白的组合物，该融合蛋白以抗原呈现细胞为特定标靶。例如，该靶细胞可选自由T-细胞、B-细胞、树突细胞、单核细胞与巨噬细胞组成的组中。实施例以下所述者仅为根据本发明实施例所提供之例示用设备、器材、方法与相关结果，不应视为本发明的限制。各实施例的标题或子标题仅为方便阅读之用，亦不应视为本发明之限制。此外，只要本发明系据其本身实施，不论基于任何特定学说或实行方案，均不受在此所叙及的特定学说的限制，且与所述学说正确与否无涉。材料及方法质粒构建pPE-M12-K13。质粒pPE-M12-K13包含作为抗原部分的冠状区M12;作为配体部分的PE(AIII)与易位部分；以及作为羧基末端部分的K13。该M12区序列位于PRRSVORFlb基因中。该PRRSVORFlb序列是从EMBL/GenBank核苷酸序列数据库登录码第M96262号中选取。亚克隆M12片段源于PRRSVNsplO(C末端区序列)与Nspll(N末端区序列)。抗原部分PRRSVM12(或ORFlb亚克隆片段)是以表一所列的特定引物合成。为了产生质粒pPE-M12-K13，通过AatII与EcoRl位点插入将PRRSVORFlbDNA片断nt1080511297亚克隆至pPE-K13质粒中。图1A显示M12加K13的蛋白片段，其中限制酶切位点以粗体字表示。图1A中蛋白质片段所对应的三字母氨基酸序列则显示于图1B中(SEQIDNO:1)，其中K13序列以下方划线的粗体字表示，而限制酶切位点以及Xhol与K13序列间的短桥则以粗体斜字表示。图2显示包含M12(亦即PRRSNsp10加Nspll基因)及K13的M12-K13DNA片段的核苷酸序列(SEQIDNO:2)。图3显示质粒pPE-K13，而图4则显示包含M12区(亦即冠状区)的质粒pPE-M12-K13。pPE-K13。质粒pPE-K13包含作为配体部分加易位部分的PE(AIII);以及作为羧基末端部分的K13(图3)。该PE(AIII)(在图3中标示为PE)包含假单胞菌外毒素A结合区域I与易位结构域II。质粒pPE(AIII)是根据美国专利公开案第2004/0247617号所述方法构建而成，该专利公开案的全文在此以引用的方式并入本文。该K13羧基末端部分包含肽序列KKDELRVELKDEL(SEQIDNO:7)，其由该K13片段是以上开美国专利公开案的方法稍加修改而制成，该专利公开案的全文系以引用的方式并入本文。简言之，通过连续的聚合酶链式反应(PCR)合成编码SalI位点-KKDELRVELKDEL-终止密码子-XhoI-EcoRI序列的多核苷酸。该等PCR-扩增的DNA片段以Sail及EcoRI使其切开，再以凝胶电泳及电洗脱纯化。纯化后的SalI-EcoRIDNA片段与pPE连接即形成质粒pPE-K13。pPE-DgD-K13。该编码PE-DgD-K13的质粒是以美国专利申请第10/457,574号所述的方法稍加修改而制成。简言之，以PstI及XhoI消化两种质粒pET15-H6-PE(AIII)PRRS7-DgD与pPE-K13，从而分别产生包含PE(AIII)PRRS7-DgD的片段与包含羧基末端部分的片段。继而将两种片段纯化，再通过T4连接酶进行连接，即形成pET23-H6-PE(AIII)-DgD-K13(名为pPE-DGDK13或pPE-DgD-K13)。质粒pET23-K3、pET-K13或pPE(AIII)-K13皆包含KDEL序列。pPE-ORF5-K13。此可编码PE-ORF5-K13的质粒根据上述方法制成。简言之，将PRRSVORF5基因插入pPE(AIII)-K13以构建pPE-ORF5-K13。融合抗原的表达与纯化。在37t:含有100500ppm氨苄青霉素的LuriaBertani培养液中培养用融合抗原质粒转化以表达融合蛋白PE-ORF5-K、PE-DgD-K13或PE-M12-K13的大肠杆菌(BL21(DE3)pLys细胞)。在大肠杆菌培养达到对数期前期(A600=0.10.4)后，在培养物中加入终浓度为0.5mM的异丙基-1-硫代-P-D-吡喃半乳糖苷(IPTG)以发挥诱发作用。诱发两小时后收获细胞并立即储存于零下7(TC。利用前人已披露的尿素粹取技术(Liao等人，1995，Appl.MicrobiolBiotechnol.43:498-507)，将融合抗原部分纯化。将包含6组胺酸标记(6Histag)的融合抗原分子完全曝露于变性条件下，以加强其与eNi-NTA基质(Ni-NTA琼脂糖；QiagenInc.CA)的结合。因此通过降低非特异性性结合的可能性，使纯化作用达到最大效率。以下将说明如何在变性条件下为来自大肠杆菌细胞培养的6组胺酸标记融合抗原进行分批纯化。将1毫升50%Ni-TNA浆加入4毫升溶胞产物中，并且室温下以轻摇方式(如200rpm)混合60分钟以形成溶胞产物-树脂混合物。将该溶胞产物-树脂混合物小心装入仍附有底盖的空管柱中，然后移除底盖以收集从中流过的溶液。以4毫升洗涤缓冲液(100mMNaH2PO4，10mMTris-HCl，8M尿素，pH8.0)冲洗两次。利用0.5毫升、pH5.9的洗脱缓冲液(100mMNaH2PO4，10mMTris-HCl，8M尿素，pH5.9)洗脱蛋白质四次，接着再以0.5毫升、pH4.5的洗脱缓冲液(100mMNaH.sub.2PO.sub.4，10mMTris-HCl，8M尿素，pH4.5)进行洗脱四次。将收集的级分集中在一起，并以SDS-PAGE凝胶电泳进行分析。利用标准BAS蛋白进行定量分析。表二引物SEQIDNO:序列M12-F1105，-TGGCCGGTGGTGTCAACCCAGAACAATGAAAAGTGGCCGGATCGTCTG-3'M12-F25'^CAGTTTGCCAAACTCCCAATAGAACTTGCACCACACTGGCCGGTGGTGTCA-3'M12-F3125'國AACTTGGGTTTTTATTTTTCACCTGAGTTGACACAGTTTGCCAAACTC-3'M12-F4135'-GGGTCGAGCTCTCCGCTCCCGAAGGTCGCACACAACTTGGGTTTTTAT-3'M12-F5145，-TCTCTCCGCGCCATTTGTGCTGATCTGGAAGGGTCGAGCTCTCCG-3'M12-F6IS5'-GATAAATTTCGTGCCACAGACAAGCGTGTTGTAdATTCTCTCCGCGCCATT-3'M，2-F75'-ACGGTTGCTCAGGCTCTGGGCAACGOGGATAAATTTCGTGCC-3'Mi2-FS175'-CCCCCCGACGTCAATAACAAAGAATGCACXJGTTGCTCAGGCT-3'謹2-Rl185，-GCGGCTGTATTTGTCGAGAGGGCGAAGGCTGGCAACCAGACGATCCGGCCA-3'M12-R2S，-AGGGCCCACCATATAGCCGGCACCGATGCACGCGCGGCTGTATTTGTC-3'M12-R3205'-GTATGACACGACCCCTGGAGTGCCCAGAAACACCGAAGGGCCCACCATATA-3'M12"R45'-AGCCTCGCCCTTAACAAACTTTGTGAGATAGTATGACACGACCCC-3'M12-R5225，-TCGGCCGGTACTGAAGACCGTTTCC衡AAGCACTTGAGCCTCGCCCTTAAC-3'滅12-R6235'-GATATTCACGGCAGTCTACCTCAATTTOGOCGGTACTGAA-3'M12-R7245，-ACGCAGCAACTTCTCGCTCACGATCATCAAGATATTCACGGCAGTC-3'M12-RS255，-TTTTTTCTCGAGGAATTCGTGTGGGAGGGA^_CGCAGCAACTTCTCG-3'_':M12-F1及M12-R1分别代表第一对正向引物与反向引物；M12-F2及M12-R2分别代表第二对正向引物与反向引物，以此类推。实施例1由PRRSV融合抗原诱发细胞介导的免疫反应本发明旨在发现PRRS病毒蛋白中可诱发动物体内细胞介导的免疫反应的抗原或表位部位，并利用那些抗原生产作为疫苗的融合抗原以使动物免疫，诱发免疫系统产生足量的IFNY及TNFa，并激活T-细胞免疫与杀伤性T-细胞路径。本发明披露可诱发细胞介导的免疫机制的融合抗原PE-DgD-K13(或PE-PRRSV0RF7)以及PE-M12-K13。在免疫小鼠实验模型中，发现PE-DgD-K13和/或PE-M12-K13可诱发脾细胞的细胞免疫机11制。分别接种PE-M12-K13与PE-DgD-K13的小鼠与对照组的小鼠相比较，均产生IFNY与TNFa分泌增加的情形。由ORF5及ORF6N-端-K13组成的融合抗原PE-PQGAB-K13对于诱发IFNY与TNFa分泌的效果不大(图5及图6)。ORFlb基因在病毒细胞增殖前的之复制过程中起重要作用。融合抗原PE-DgD-K13或PE-DgD-K3及PE-M12-K13或PE-M12-K3为PRRSV疫苗最重要的主要成份。根据先前的PRRSV攻击研究与血液样本测试结果，发现PE-DgD-K3能够激活幼猪免疫保护，预防幼猪感染病毒血症。实施例2PRRS融合抗原的剂量幼猪于一周、两周及五周大时分别施用l毫克抗原，总共免疫接种三次。最后一次免疫接种之后两周，测量特异性抗体IgG、IgA与IgM的滴定度。发现，抗体的滴定度在两次免疫接种后到达高峰。三次免疫接种后的抗体滴定度相较于两次接种后并未产生明显变化。若对幼猪施以0.050.5毫克，而更理想地为0.10.3毫克含有融合抗原PE-M12-K13的疫苗组合物，在二次免疫接种后发生显著的抗体反应，且抗体在三次免疫接种后到达高峰。实施例3以PE-M12-K13与其它融合抗原混合调配而成的疫苗组合物针对PRRS病毒攻击的预防动物。猪只取自无特定病原体(SPF)的农场的畜群，该农场定期以RT-PCR技术检测PRRSV，且已知无此病毒。实验前，SPF农场的母猪已确认无病毒血症。此外，SPF农场母猪的Index-RRRS诊断试剂测试结果亦呈阴性。RNA提取。为检测动物体内是否存有PRRSV，收集动物血浆成分并利用NUCLEOSPINRNA11顶试剂盒提取RNA以进行RT-PCR检测(Macherey-NagelGmbH&Co.KG，德国)。简言之，将350微升RAl溶液与3.5iUI3-巯乙醇加入100iU血浆成分中。在粘度降低并经过滤使溶胞产物澄清后，将溶胞产物与350iU的70X乙醇混合。以离心方式将RNA吸附于NucleospinRNA管柱中，之后加以洗涤。将95微升的DNA酶溶液加入管柱中进行DNA消化。重复洗涤与离心作业数次后，再以60iU不含RNA酶的水洗脱出RNA。病毒的RT-PCR检领U。利用OnestepRT-PCRKit(QiagenInc.,美国加州)进行RT-PCR来检测动物体内是否存有PRRSVRNA。提供正向引物5'-CCAGCCAGTCAATCAGCTGTG-3'(SEQIDNO:3)与反向引物5'-GCGGATCAGGCGCAC-3'(SEQIDNO:4)以合成293-bp的片段。以琼脂糖凝胶电泳进行RT-PCR的检测极限约为10个拷贝的PRRSV(TCID5。/毫升)。免疫作用。从SPF农场中挑选三至四只母猪所产的新生幼猪，分别标定身分、称重及判定性别。将幼猪随机分为六组，每组包括来自各母猪的共五或六只幼猪。以含有一种或多种融合抗原(亦即混合或未混合)的疫苗组合物或载体对幼猪以体重分层的标准进行接种。分别在哺乳阶段中4天大与至8天大时，以肌肉注射方式免疫接种2ml疫12苗组合物，共接种两次，其中该疫苗组合物含有l毫升乳化于lmlISA206(SEPPIOD，法国)中的融合抗原(50100yg每抗原成分/剂)。对照组则未接种，如常饲养。在断奶阶段时(约三至四周龄)，将各组幼猪移往设有空调与通风设备的单独的隔离室。PRRSV攻击。最后一次接种之后两周，分别利用氯胺酮(Ketamine)(100mg，IM注射)与2^利多卡因(Lidocaine)(lml，鼻腔滴注)对幼猪进行镇静及咳嗽反射抑制，而后透过鼻腔进行PRRSV攻击。将lml包含PRRSVMD-1新鲜病毒株(其每毫升50%组织培养感染剂量(TCIDJ为1X10"的接种物，经由鼻腔路径施用于每组中五只幼猪。病毒攻击后的RT-PCR。为检测病毒攻击后血液中PRRSV的水平，在第二次免疫接种的两周后以RT-PCR法检测幼猪的血液白血球样本(从全血中层析而得)。在攻击后第三、七及十四天分别取幼猪的血液白血球样本再次进行PRRSV的RT-PCR检测。结果。在病毒攻击前，所有幼猪的RT-PCR血液样本测试结果均呈PRRSV阴性。因此，在PRRSV攻击前，对照组并未发生病毒血症。在PRRSV攻击的五天后(DPI-5)，对照组幼猪的血液样本开始出现病毒血症的征象。在PRRSV攻击大约两周后，对照组所有幼猪皆出现病毒血症(表二，BK-1中五只全数患病，BK-2中六只全数患病)。明显的病毒血症症状持续一段时间。幼猪血液样本在PRRSV攻击两周后是否出现病毒血症为评估疫苗效力的重要指标。若未测得病毒血症，表示疫苗发挥作用。详言之，在接种含有PE-M12-K13、PE-ORF5-K13与PE-DgD-K13混合物的疫苗组合物的组中共有六只幼猪，仅一只的血液样本呈PRRSV阳性反应。部分接受PE-M12-K13疫苗接种的组在病毒攻击后第十四天(DPI-14)开始呈现病毒血症清除反应，如表二所示。表二显示动物组在PRRSV攻击后的检测结果。接受PE-M12-K13疫苗接种的幼猪于PRRSV攻击后之第七天，三只中即有一只攻击出现病毒血症，但病毒血症在攻击后第21天已被清除。在接种含有PE-M12-K13、PE-DgD-K13与PE-ORF5-K13混合物的疫苗组合物的组中，六只中有一只于PRRSV攻击后的第7天出现病毒血症，而病毒血症在攻击后第21天也已被清除。因此，可能PE-DgD-K13(或-K3)及PE-M12-K13(或-K3)对于动物的病毒感染保护有其效果，但PE-ORF5-K13(或-K3)在此条件下并未能提升保护效果。表二SPF幼猪模型中PRRSV攻击后的病毒血症測试结果<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>'"BK"代表未接种疫苗的对照组。实施例4由PRRSV攻毒所引致之肺部病变以变异数分析法(ANOVA)判定接种与未接种疫苗的动物组在间质性肺炎指标差异的统计显著性。统计分析显示，接种以单一PE-PRRSV融合抗原PE-M12-K13构成的疫苗组合物的动物，其肺部组织切片呈现轻微的间质性肺炎严重度。就含有一种以上单一PRRSV融合抗原的疫苗组合物而言，含有PE-DgD-K13与PE-M12-K13混合物的疫苗组合物对于肺病症状具有有效的防护作用。从接受PE-DgD-K13与PE-M12-K13疫苗接种的幼猪所取得的肺部组织切片，其间质性肺炎的严重度较轻。归纳上述实验结果，可证实包含PE-M12-K13的疫苗组合物具有以下功效L产生有效的病毒血症清除反应。II.不含其它PRRSV结构蛋白的疫苗组合物有效减少可能由PRRS病毒所引发的副作用。III.具有诱发细胞免疫机制的效用。利用ORFlb，可产生融合蛋白抗原PE-M12-K13，并有效诱发动物产生INFY与TNFa细胞因子，发挥清除病毒感染的作用。本案所参照的所有前案，其全文均以引用的方式并入本文。以上说明为本发明的实施范例，其作用仅在于说明，其所揭示者并未穷尽本发明之所有可能型态，且本发明的实施亦不限于所述型态。依据以上教示，可能实现本发明的多种修改及变化。此处所述实施方式与实施例的选用及叙述为阐明本发明的原理与这些原理的应用，以便使本领域技术人员利用本发明及依据实际需要以不同实施方式或各种领域修改实现本发明之技术。本领域技术人员可在不违本案精神之情况下，轻易想见多种替代实施例。因此，本发明的范围应取决于所附权利要求书，而非由上述实施例加以界定。序列表<110>生宝生物科技股份有限公司财团法人台湾动物科技研究所<120>用作疫苗的融合抗原<130>TI08-1898-XC37<140>200810178914.1<141>2008-ll-27<150>US11/948,327<151>2007-ll-30<160>25<170>PatentInversion3.3<210>1<211>186<212>PRT<213>人工序列<220>14<223>PRRSVORFlbM12区(部分NsplO和Nspll)加K13的氨基酸序列<400>1AspValAsnAsnLysGluCysThrValAlaGinAlaLeuGlyAsnGly151015AspLysPheArgAlaThrAspLysArgValValAspSerLeuArgAla202530lieCysAlaAspLeuGluGlySerSerSerProLeuProLysValAla354045HisAsnLeuGlyPheTyrPheSerProAspLeuThrGinPheAlaLys505560LeuProlieGluLeuAlaProHisTrpProValValSerThrGinAsn65707580AsnGluLysTrpProAspArgLeuValAlaSerLeuArgProLeuAsp859095LysTyrSerArgAlaCyslieGlyAlaGlyTyrMetValGlyProSer100105110ValPheLeuGlyThrProGlyValValSerTyrTyrLeuThrLysPhe115120125ValLysGlyGluAlaGinValLeuProGluThrValPheSerThrGly130135140ArglieGluValAspCysArgGluTyrLeuAspAspArgGluArgGlu145150155160ValAlaAlaSerLeuProHisGluPheLeuGluTyrLeuLysLysAsp165170175GluLeuArgValGluLeuLysAspGluLeu180185<210>2<211>549<212>DNA<213>人工序列<220><223>PRRSVORFlbM12区(部分NsplO和Nspll)加K13的核苷酸序列:0169]<400>2:0170]gacgtcaataacaaagaatgcacggttgctcaggctctgggcaacggggataaatttcgt60:0171]gccacagacaagcgtgttgtagattctctccgcgccatttgtgctgatctggaagggtcg120:0172]agctctccgctcccgaaggtcgcacacaacttgggtttttatttttcacctgacttgaca180:0173]cagtttgccaaactcccaatagaacttgacccacactggccggtggtgtcaacccagaac240:0174]aatgaaaagtggccggatcgtctggttgccagccttcgccctctcgacaaatacagccgc300:0175]gcgtgcatcggtgccggctatatggtgggcccttcggtgtttctgggcactccaggggtc36015<400>11c敏ttgccaaactcccaatagaacttgcaccacactggccggtggtgtca<210>12<211>48<212>DNA<213>人工序列<220><223>正向引物M12-F3<400>12aacttgggtttttatttttcacctgacttgacacagtttgccaaactc<210>13<211>48<212>DNA<213>人工序列<220><223>正向引物M12-F4<400>13gggtcgagctctccgctcccgaaggtcgcacacaacttgggtttttat<210>14<211>45<212>DNA<213>人工序列<220><223>正向引物M12-F5<400>14tctctccgcgccatttgtgctgatctggaagggtcgagctctccg<210>15<211>51<212>DNA<213>人工序列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