基于dc的神经胶质瘤全肿瘤抗原疫苗及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物工程和生物医药领域，特别涉及基于DC的神经胶质瘤全肿瘤抗原疫苗及其制备方法。
【背景技术】
[0002]神经胶质瘤是来源于神经上皮的肿瘤，是颅内最常见的恶性肿瘤，约占全部颅内肿瘤的40-50%，以发病率高、复发率高、致死率高，成为肿瘤治疗的难题。传统治疗方法主要是手术和放化疗来提高患者的生存机率。但是位于重要功能区的胶质瘤很难做到全切除。放射治疗几乎是各型胶质瘤的常规治疗，但疗效评价不一，除髓母细胞瘤对放疗高度敏感，室管膜瘤中度敏感外，其他类型对放疗均不敏感。化疗药物限于血脑屏障及药物的毒副作用，疗效尚不肯定。近年来，免疫治疗成为脑胶质瘤继手术、放化疗后的有效治疗手段。与其他方式联合应用，具体有很强的互补作用，对患者受损的免疫系统能够起到恢复与重建的独特疗效，从而进一步防止肿瘤的复发和转移。
[0003]目前，现有技术中存在的神经胶质瘤的双向调节治疗性疫苗及其制备方法，但经ELISP0T法(固相酶联免疫斑点技术)检测该治疗性疫苗发现激发T细胞分泌IFN-γ的能力较弱，治疗效果不够显著。另外，目前本领域技术人员也已研究出将DC与神经胶质瘤抗原共培养制成的治疗性疫苗，但所采用的神经胶质瘤抗原是通过血清培养法对神经胶质瘤干细胞进行增殖培养后裂解得到的，由于该抗原只具备胶质瘤干细胞携带的抗原信息，只能杀死神经胶质瘤中的肿瘤样干细胞和少量的肿瘤细胞，而由于血清培养液中存在一定的微生物污染，以及动物源免疫原性，因此通过血清培养法获得的神经胶质瘤干细胞制备的抗原稳定性较差，特异性较弱，因此通过该抗原所获得的神经胶质瘤治疗性疫苗具有稳定性差、特异性较弱、杀瘤率不高以及免疫原性弱等缺陷。
【发明内容】
[0004]本发明所要解决的技术问题是，针对现有技术中神经胶质瘤治疗性疫苗性状不稳定、免疫原性较弱、杀瘤率低等缺陷，提供一种免疫原性及特异性强的基于DC的神经胶质瘤全肿瘤抗原疫苗及其制备方法。
[0005]本发明解决其技术问题所采用的技术方案是:提供一种基于DC的神经胶质瘤全肿瘤抗原疫苗的制备方法，所述制备方法包括以下步骤:
[0006]获取未成熟DC ;
[0007]加入神经胶质瘤全肿瘤抗原与未成熟DC共培养；
[0008]再加入肿瘤坏死因子-α和白介素或脂多糖继续培养，至DC成熟且负载上神经胶质瘤全肿瘤抗原；
[0009]其中，所述神经胶质瘤全肿瘤抗原包括裂解后的神经胶质瘤干细胞和神经胶质瘤非干细胞。
[0010]在本发明提供的基于DC的神经胶质瘤全肿瘤抗原疫苗的制备方法中，所述神经胶质瘤全肿瘤抗原中，神经胶质瘤干细胞与神经胶质瘤非干细胞的个数比为:1:2-2:1。
[0011]在本发明提供的基于DC的神经胶质瘤全肿瘤抗原疫苗的制备方法中，所述神经胶质瘤全肿瘤抗原浓度为50-200ug/uL、未成熟DC浓度为1_2X 106个/mL。
[0012]在本发明提供的基于DC的神经胶质瘤全肿瘤抗原疫苗的制备方法中，所述白介素为白介素-1。
[0013]在本发明提供的基于DC的神经胶质瘤全肿瘤抗原疫苗的制备方法中，所述肿瘤坏死因子-α的浓度为5-15ng/ml、白介素-1的浓度为5_15ng/ml、脂多糖的浓度为l-10ng/ml。
[0014]在本发明提供的基于DC的神经胶质瘤全肿瘤抗原疫苗的制备方法中，所述肿瘤坏死因子-α的浓度为浓度为5ng/ml、白介素_1的浓度为5ng/ml、神经胶质瘤全肿瘤抗原浓度为100ug/uL、未成熟DC浓度为2X 106个/mL。
[0015]在本发明提供的基于DC的神经胶质瘤全肿瘤抗原疫苗的制备方法中，所述肿瘤坏死因子- α的浓度为浓度为10ng/ml、白介素_1的浓度为5ng/ml、神经胶质瘤全肿瘤抗原浓度为150ug/uL、未成熟DC浓度为2X 106个/mL。
[0016]在本发明提供的基于DC的神经胶质瘤全肿瘤抗原疫苗的制备方法中，所述肿瘤坏死因子-α的浓度为浓度为15ng/ml、白介素-1的浓度为15ng/ml、神经胶质瘤全肿瘤抗原浓度为200ug/uL、未成熟DC浓度为1.5X 106个/mL。
[0017]在本发明提供的基于DC的神经胶质瘤全肿瘤抗原疫苗的制备方法中，所述神经胶质瘤全肿瘤抗原与未成熟DC在含有粒-巨噬细胞因子和白介素-4的培养基上进行共培养。
[0018]本发明还提供一种基于DC的神经胶质瘤全肿瘤抗原疫苗，由上述基于DC的神经胶质瘤全肿瘤抗原疫苗制备方法所获得。
[0019]实施本发明提供的基于DC的神经胶质瘤全肿瘤抗原疫苗及其制备方法，可以达到以下有益效果:采用神经胶质瘤全肿瘤抗原制备的的基于DC的神经胶质瘤全肿瘤抗原疫苗不仅性状较稳定，而且同时携带有神经胶质瘤干细胞抗原信息和神经胶质瘤非干细胞的抗原信息，免疫原性及特异性较强，能够很好的调节神经胶质瘤的机体免疫机制，对于有效治疗神经胶质瘤具有重大意义。
【附图说明】
[0020]下面将结合附图及实施例对本发明作进一步说明，附图中:
[0021]图1为通过蛋白质印迹法检测出的本发明提供的基于DC的神经胶质瘤全肿瘤抗原疫苗所表达的蛋白示意图。
【具体实施方式】
[0022]为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0023]本发明提供的一种基于DC的神经胶质瘤全肿瘤抗原疫苗，其制备方法包括以下步骤:
[0024]1、获取未成熟DC;
[0025]2、加入神经胶质瘤全肿瘤抗原与未成熟DC共培养7-13天；
[0026]3、再加入肿瘤坏死因子-α和白介素或脂多糖继续培养10-24小时，至DC成熟且DC负载上神经胶质瘤全肿瘤抗原。
[0027]具体地，步骤1中，未成熟DC可来源于人体血液，但由于未成熟DC在血液中仅占单核细胞总数的0.5-1.0%，数量很少；因此，本发明优选实施例中，采取诱导单核细胞的方式获取未成熟DC，具体步骤为:
[0028]11、从血液中分离出单核细胞；
[0029]12、再加入体外诱导培养液培养72h，对步骤11中获得的单核细胞进行扩增；
[0030]13、用体外诱导培养液进行半量换液，并将步骤12中扩增后的单核细胞定向诱导分化成未成熟DC。
[0031]在步骤11中，单核细胞可以为⑶34+和/或⑶14 +单核细胞，其中，⑶34 +单核细胞可以从骨髓、脐带血或脾脏等分离得到；CD14+细胞从人外周血分离得到的。由于从脐带血中纯化出CD34+单核细胞费用昂贵；骨髓采集不易，而且容易污染，患者比较痛苦，扩增费用昂贵；而脾脏来源受限等使得CD34+单核细胞获取较困难；因此，在本发明中，优选采用从人外周新鲜血液中分离筛选出CD14+单核细胞，从新鲜血液中获取，相比经过冷库储存或者培养传代之后的CD14+单核细胞，从新鲜血液中提取的CD14 +单核细胞离体时间不长，其细胞活性和状态的减弱或者形态改变程度都较少，更加利于获取DC。
[0032]⑶14+单核细胞从人外周血分离的过程为:
[0033]取人外周血20ml，用Ficon淋巴细胞分离液并根据Ficon淋巴细胞分离液使用说明书分离出CD14+单核细胞，PBS溶液洗涤后按(2.5-5) X 10 73ml/孔接种于六孔板中，并用RPM1-1640培养基(RPMI实验室出产的批号为1640的培养基)于37°C，5% C02条件下放置培养90分钟，收集贴壁细胞即CD14+单核细胞。
[0034]步骤12和步骤13中的体外诱导培养液优选为适宜于DC生长的含10%胎牛血清、粒-巨噬细胞和白介素_4的RPM1-1640培养基。需要特别注意的是，由于DC相比非贴壁细胞其能具有贴壁性，但是其贴壁性能并不强，而是偏向于半贴壁的类型，因此在步骤13的培养的过程中需采用半量换液，以避免将目的DC吹成悬浮而流失。
[0035]当然可以理解的是，本发明获得未成熟DC的途径也并不局限于此，通过其他诱导方法诱导单核细胞获得的未成熟DC同样适用于本发明。
[0036]在步骤2中，优选地，采用含有粒-巨噬细胞因子和白介素_4的培养基进行神经胶质瘤全肿瘤抗原和未成熟DC的共培养。由于DC有簇状生长的习惯，浓度太高，集结成团，位于中心的DC不易成熟，影响神经胶质瘤全肿瘤抗原的负载，从而影响疫苗的免疫效果，因此，DC浓度不易过高，优选地，在该步骤中，待未成熟DC在培养基中的浓度为(1-2) X106个/ml或将步骤1获得未成熟DC的浓度调整为(1-2) X 106个/ml时，加入神经胶质瘤全肿瘤抗原进行预负载，优选地，神经胶质瘤全肿