未分化细胞检测方法及复合糖检测方法
【专利摘要】本发明的目的是提供使用培养了干细胞的培养上清液评价细胞的分化状态的方法。本发明中，能够提供包含“Fucα1-2Galβ1-3GlcNAc”或“Fucα1-2Galβ1-3GalNAc”的糖链结构的“未分化糖链标志物”，其能够使用干细胞的培养上清液以高灵敏度判定干细胞的未分化状态。同时，发现能够以高灵敏度识别该“未分化糖链标志物”的BC2LCN凝集素或其变体是能够以培养上清液来判定细胞的未分化状态的、优秀的“未分化糖链标志物检测用探针”。
【专利说明】未分化细胞检测方法及复合糖检测方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及使用细胞培养上清液来判定细胞的状态的方法。特别地，涉及评价未分化细胞的存在、不存在的方法。另外，本发明涉及检测糖蛋白质等具有糖链的检测对象物质的方法。
【背景技术】
[0002]多能干细胞因其能够分化为构成机体的所有细胞的性质以及能够维持其未分化性的性质而获得关注，不仅限于创新药物筛选或阐明疾病机理的应用，而且在世界范围内正将其作为再生医疗的材料进行研究。
[0003]2010年世界上首次利用人ES细胞的第I期临床试验在美国针对急性脊髓损伤开始展开，进而，针对视网膜变性疾病的使用人ES细胞的第1/2期临床试验的新药临床试验申请(IND)被FDA批准，利用人多能干细胞的再生医疗研究正在持续飞跃性发展。
[0004]特别地，日本发现的作为新的人多能干细胞的iPS细胞因为不使用受精卵等理由故而伦理障碍较低，并且具有能够从自体组织建立这样的极大的优点，再生医疗临床界也对其充满期待。在日本，物理化学研究所发生.再生科学综合研究中心及先端医疗中心等计划从2013年开始以老年黄斑变性症患者为对象使用iPS细胞进行临床研究，庆应大学也有2015年开始对脊髓损伤患者进行临床研究的方针。
[0005]由此，虽然ES细胞、iPS细胞这类人多能干细胞的临床应用已被展开，但关于确保品质和安全性地供给细胞的体制尚未准备充分。对多能干细胞而言，制造方法、培养条件、保存条件等对未分化性、分化能力、增殖能力等品质产生影响。因此，如果不基于适当的方法进行管理，则有产生因生产者、使用者而异的结果的可能性。这是干细胞治疗的可靠性较低、及招致因为治疗导致发生健康损害等的弊端的原因。因此，可靠性和再现性高的维持培养法及计测.评价系统是必需的。
[0006]例如，细胞治疗中，多能干细胞并非原样使用，而是分化为目标细胞之后用于移植，但在分化为目标细胞的细胞源中混入了未分化的细胞时，有报道称该未分化细胞将是肿瘤形成的原因。因此，需要开发对细胞治疗中使用的细胞中是否混入了未分化细胞即肿瘤形成细胞进行评价的技术。
[0007] 另一方面，成体干细胞的种类和特性较之ES细胞、iPS细胞这类人多能干细胞而言更加多种多样，其在临床中的应用已作为既有技术存在。但是，稳定获得品质适于移植的细胞并不容易，因此确立充质干细胞的品质验证方法以及基于此确立稳定的培养方法一直是极其重要的课题。此外，即使在进行了对利用成体干细胞的细胞移植的有效性的评价、对其机制的理解及风险评价的基础上，仍需要开发对移植前的细胞的品质验证方法。
[0008]本发明的发明人等以前使用了凝集素微阵列，对从五种不同的体细胞(皮肤、胎儿肺、子宫内膜、胎盘动脉、羊膜)制作的人iPS细胞(114份检测样本)和人ES细胞(9份检测样本)的糖链情况进行了广泛的分析。
[0009]结果发现，尽管最初的体细胞随组织不同而具有各异的糖链情况，但制作的iPS细胞均显示出基本相同的糖链情况，通过导入重编程基因而均收敛为与ES细胞类似的糖链结构。对人ES.iPS细胞与人体细胞的凝集素阵列数据进行了详细的分析，根据分析结果，推定未分化的人ES *iPS细胞较之体细胞而言a 2_6Sia、a l_2Fuc、l型LacNAc的表达量显著增加。进而，通过利用了 DNA阵列的糖转移酶基因的表达分析以及利用质谱仪的方法，发现rBC2LCN仅与未分化的人ES.iPS细胞结合(非专利文献I)。
[0010]上述rBC2LCN是使BC2LCN凝集素(YP_002232818)(其对应于来自革兰氏阴性菌(洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderia cenocepacia))的BC2L-C蛋白质的N末端结构域)在大肠杆菌转化体中表达而得的重组体，其为识别复合糖链的非还原末端的“Fuc a l-2Gal β l_3GlcNAc” 以及 “Fuc a l-2Gal β l_3GalNAc” 的糖链结构的凝集素(非专利文献1、3)。
[0011]本发明的发明人等在利用上述凝集素阵列的实验中，发现rBC2LCN虽然与未分化的人ES.iPS细胞反应，但与分化了的体细胞(皮肤、胎儿肺、子宫内膜、胎盘动脉、羊膜)完全不反应。认为rBC2LCN与具有“ a l-2Fuc”、“l型LacNAc”及“ a 2_6Sia”中的两个(a l-2Fuc、I 型 LacNAc)的 “Fuc a l_2Gal β l_3GlcNAc ( = Hl 型结构)”及“Fuc a l-2Gal β l_3GalNAc ( = Η3型结构)”的糖链结构特异性反应。这两个糖链结构在人ES.iPS细胞中高表达，并且是在分化了的皮肤、胎儿肺、子宫内膜、胎盘动脉、羊膜的细胞中几乎不表达的糖链。
[0012]因此显示，rBC2LCN识别的糖链配体为未分化细胞特有的新颖的未分化糖链标志物，并且显示，rBC2LCN可用作针对该未分化糖链标志物“Fuca l_2Gal β l_3GlcNAc”和/或“Fuca l-2Gal β l_3GalNAc” (下文中有时将二者合称为 “Fuc a l_2Gal β l_3GlcNAc/GalNAc”)的特异性探针。
[0013]这之后，Drukker等人的团队也发现，识别“Fuc a l_2Gal β l_3GlcNAc”的抗体能识别未分化状态的ES细胞及iPS细胞(非专利文献2)，证实了本发明的发明人的上述发现。
[0014]但是，Drukker等人的上述抗体虽然与“Fuc a l_2Gal β l_3GlcNAc ( = Hl型结构)”特异性反应，但与“(Fuc a l-2Gal β l_3GalNAc = H3型结构)”不反应。与rBC2LCN比较而言，其不能检测未分化细胞中的“Fuc a l_2Gal β l_3GalNAc”或“含有Fuc a l-2Gal β l-3GalNAc的糖链”，故而较之本发明的发明人的rBC2LCN而言存在灵敏度不够充分的缺点。
[0015]专利文献1:日本特开平9-301995号
[0016]专利文献2:W02007/027495
[0017]非专利文献I:Tateno H, Toyota M, Saito S，Onuma Y, Ito Y, Hiemori K, FukumuraM, Matsushima A, Nakanishi M, Ohnuma K,Akutsu H, Umezawa A, Horimoto K, HirabayashiJ, Asashima Μ., J Biol Chem.2011，286 (23): 20345-53.[0018]非专利文献2:Tang C，Lee AS, Volkmer JP, Sahoo D, Nag D, Mosley AR, InlayMA, Ardehali R, Chavez SL, Pera RR, Behr B, Wu JC, Weissman IL, Drukker M., NatBiotechnol.2011, 29 (9): 829-34.[0019]非专利文献3:Sulak 0, Cioci G,Delia M, LahmannM, Varrot A, ImbertyA, Wimmerova M., Structure.2010, 18(I):59-72.[0020]非专利文献4:Suemori H., Yasuchika K., HasegawaK., Fujioka T., TsuneyoshiN., Nakatsuji N.Biochem.Biophys.Res.Commun.2006, 345, 926-932.[0021]非专利文献5:Draper JS, Pigott C，Thomson JA, Andrews Pff.JAnat.2000, 200, 249-58.[0022]非专利文献6 =Iijima et al.Chem.Bi0.Chem.2009，10，999-1006
[0023]非专利文献7:Tateno, H.，Nakamura-Tsuruta, S.，and Hirabayashi, J.Nat.Protoc.2007, 2, 2529-2537
[0024]非专利文献8: Ni e I sen, J.S., and McNagny, Κ.M.J Am SocNephrol, 2009，20，1669-1676.
【发明内容】
[0025]现在，检查细胞品质时，通常利用测序仪、微阵列、流式细胞术、免疫组织科学等对细胞的基因表达、表观基因组状态、细胞表面标志物等的差异进行分析。但是，这些方法必须要使用细胞本身进行分析，因此存在下述大问题:不仅必需繁杂的细胞回收工序，还要将珍贵的用于细胞治疗的细胞在检查中就使用消耗掉。
[0026]此外，如上文所述，根据本发明的发明人等，能够确定作为识别未分化细胞和分化细胞的未分化糖链标志物的糖链结构自身。但是，不仅限于Drukker等人的方法,在本发明的发明人等以前使用rBC2LCN的技术在观察细胞表面的糖蛋白或糖脂质等具有的糖链这一点上均停留在现有技 术阶段。即，这些技术同样需要回收被测细胞的工序或者进一步纯化的工序，并没有解决检测评价工序中的工序繁杂、浪费有效细胞这样的一直以来的问题。
[0027]因此，本发明的主要目的在于提供不减少被测细胞、非侵袭性地调查细胞的状态的方法。
[0028]本发明的发明人等制作了将rBC2LCN作为针对“Fuc a l-2Gal β l_3GlcNAc/GalNAc"的特异性探针固定化于载玻片上的基板，使用该基板评价ES细胞及iPS干细胞的分化状态时，还尝试了同时评价研究与培养上清液的反应性以代替评价研究细胞自身(破碎物)。
[0029]结果，出人意料地发现，将从被测细胞培养基采集的I滴培养上清液(相当于I μ L)以不施加任何纯化工序的状态直接供给至基板表面的凝集素，仅通过上述操作就能够使用基板上的rBC2LCN评价分化状态。具体而言，rBC2LCN与对照培养基及视黄酸存在下进行培养并分化了的iPS细胞的培养上清液不反应，但是与不存在视黄酸时维持了未分化状态的iPS细胞的培养上清液发生特异性反应。
[0030]从以上结果可见，其显示:具有上述“Fuca l_2Gal β l_3GlcNAc/GalNAc”糖链结构的未分化糖链标志物在未分化细胞的培养上清液中通常被分泌，但随着通过分化诱导分化逐渐进行而减少，若完全分化则该未分化糖链标志物会消失。
[0031]由此，本发明中，不仅首次发现“Fuc a l_2Gal β l_3GlcNAc/GalNAc”糖链作为培养上清液中可观察到的未分化糖链标志物发挥作用，并且，通过本发明相当于首次提供了培养上清液中可观察到的未分化糖链标志物。需要说明的是，仅就本发明的发明人等知道的内容而言，在此之前，从来不存在表明在培养下维持未分化状态的ES细胞及iPS干细胞的细胞表面的糖蛋白或糖脂质等能够以在培养液中能被检测的状态溶出的教导。[0032]即表明，在对分化诱导ES细胞、iPS细胞等未分化细胞时的分化状态进行评价时，或者为了评价将这些未分化细胞以维持未分化状态的形式保存时的保存状态，可采集这些未分化细胞的培养上清液，通过培养上清液中“Fuc a l-2Gal β l_3GlcNAc/GalNAc”的存在.不存在(利用该糖链结构特异性的凝集素及抗体等)来进行评价。使用了培养上清液的该手段不需要回收作为靶标的被测细胞自身的工序，也不需要纯化特定靶标分子的工序，可以说是极其简便的技术。特别地，“BC2LCN凝集素”具有能以高灵敏度识别“Fuc a l-2Gal β l_3GlcNAc”及“Fuc a l_2Gal β l_3GalNAc”中任一的糖链结构的特性，因此通过使用该凝集素，能够提供更可靠的未分化状态评价系统。
[0033]基于上述发现完成了本发明。
[0034]即，本发明包含以下的发明。
[0035](I) 一种判定干细胞的分化状态的方法，其特征在于，测定干细胞的培养上清液中下述(式I)或(式2)表示的未分化糖链标志物的是否存在或存在量:
[0036](式I)
[0037]
【权利要求】
1.一种判定干细胞的分化状态的方法，其特征在于，测定干细胞的培养上清液中下述(式I)或(式2)表示的未分化糖链标志物的是否存在或存在量: (式I)
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，使用特异性识别(式I)或(式2)表示的糖链结构的蛋白质来测定所述未分化糖链标志物的有无或存在量。
3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述蛋白质为下述蛋白质:所述蛋白质包含序列号I所示的氨基酸序列或该氨基酸序列的一个或数个氨基酸被缺失、取代、插入或添加而得的氨基酸序列，并且特异性识别所述(式I)或(式2)表示的糖链结构。
4.根据权利要求1~3中任一项所述的方法，其特征在于，所述干细胞的培养上清液为对该干细胞施加了分化诱导处理后的培养上清液。
5.根据权利要求1~4中任一项所述的方法，其特征在于，测定来源于足糖萼蛋白的上述(式I)和/或(式2)表示的所述未分化糖链标志物的是否存在或存在量。
6.根据权利要求1~5中任一项所述的方法，其特征在于，通过使用下述蛋白质的凝集素-凝集素夹心法检测所述未分化糖链标志物，所述蛋白质特异性识别所述(式I)或(式2)表示的糖链结构，包含序列号I所示的氨基酸序列或该氨基酸序列的一个或数个氨基酸被缺失、取代、插入或添加而得的氨基酸序列，并且没有糖链。
7.一种获得没有混入未分化细胞的分化细胞的方法，其特征在于，确认施加了分化诱导处理的干细胞的培养上清液中不存在下述(式I)或(式2)表示的未分化糖链标志物并进行采集，(式1)
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，关于所述未分化糖链标志物不存在的确认使用下述蛋白质来进行，所述蛋白质特异性识别所述(式I)或(式2)表示的糖链结构，并且包含序列号I所示的氨基酸序列或该氨基酸序列的一个或数个氨基酸被缺失、取代、插入或添加而得的氨基酸序列。
9.一种用于判定干细胞的分化状态的方法的试剂盒，其特征在于，包含特异性识别下述(式1)或(式2)表示的糖链结构的蛋白质， (式1)
10.根据权利要求9所述的试剂盒，其中，所述蛋白质为下述蛋白质:所述蛋白质特异性识别所述(式I)或(式2)表示的糖链结构，并且包含序列号I所示的氨基酸序列或该氨基酸序列的一个或数个氨基酸被缺失、取代、插入或添加而得的氨基酸序列。
11.检测对象物质的检测方法，其中，使具有糖链的检测对象物质与针对所述糖链具有结合性的凝集素I和凝集素2接触，形成由所述凝集素I与所述检测对象物质与所述凝集素2构成的复合体，通过检测该复合体来进行所述检测方法，其中所述凝集素I和所述凝集素2中的至少一者为不具有糖链的凝集素。
12.根据权利要求11所述的检测方法，其中，所述检测对象物质为选自糖蛋白、糖脂质、蛋白聚糖、糖肽、脂多糖、肽聚糖及在类固醇化合物上结合了糖链的糖苷的复合糖。
13.根据权利要求11或12所述的检测方法，其中，所述凝集素I与所述凝集素2具有针对互相不同的糖链结构的结合性。
14.根据权利要求11~13中任一项所述的检测方法，其中，所述不具有糖链的凝集素为在原核细胞中表达了的重组型凝集素或改变了天然型蛋白质的糖链结构而得的突变型凝集素。
15.根据权利要求11~14中任一项所述的检测方法，其中，使所述检测对象物质与结合至不溶性载体的不具有糖链的所述凝集素I和未结合至不溶性载体的所述凝集素2接触形成所述复合体，通过检测该复合体来进行所述检测方法。
16.根据权利要求15所述的检测方法，包括: 第一步骤:使所述检测对象物质与结合至不溶性载体的不具有糖链的所述凝集素I接触，获得由所述凝集素I与所述检测对象物质构成的复合体1，和 第二步骤:使所述复合体I与所述凝集素2接触，获得由所述凝集素I与所述检测对象物质与所述凝集素2构成的复合体2。
17.根据权利要求11~16中任一项所述的检测方法，其中，所述凝集素I与所述凝集素2两者均为不具有糖链的凝集素。
18.用于检测具有糖链的检测对象物质的试剂盒，所述试剂盒包含针对所述糖链具有结合性的凝集素I和凝集素2，所述凝集素I和所述凝集素2中的至少一者为不具有糖链的凝集素。
19.根据权利要求18所述的试剂盒，包含: 不溶性载体， 结合至所述不溶性载体的、不具有糖链的所述凝集素1，和未结合至所述不溶性载体的凝集素2。
20.根据权利要求18或19所述的试剂盒，其中，所述凝集素I和所述凝集素2两者均为不具有糖链的凝集 素。
【文档编号】C07K14/47GK103987855SQ201280053624
【公开日】2014年8月13日 申请日期:2012年10月31日 优先权日:2011年11月1日
【发明者】馆野浩章, 平林淳, 伊藤弓弦, 小沼泰子, 浅岛诚, 久野敦, 藁科雅岐, 福田雅和 申请人:独立行政法人产业技术综合研究所, 和光纯药工业株式会社