通过超滤制备包含高度浓缩的抗体的组合物的方法

通过超滤制备包含高度浓缩的抗体的组合物的方法
【专利摘要】本发明提供一种采用分批浓缩模式，通过超滤制备包含高度浓缩的抗体的组合物的方法，所述模式具有第一恒定进料速率步骤和第二受控进料速率步骤。
【专利说明】通过超滤制备包含高度浓缩的抗体的组合物的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物科学领域，更具体地，本发明涉及抗体制备领域。特别是，本发明涉及一种通过超滤制备包含高度浓缩的抗体的组合物的方法。用于本发明的方法能够使抗体治疗在环境温度下达到高浓度制剂，例如超过100 g/L，优选超过200 g/L，特别优选超过250 g/L。
【背景技术】
[0002]持续需要用于皮下给予的抗体治疗的高度浓缩的低体积制剂，尤其是在慢性病治疗领域，通过提供门诊治疗，以改进患者方便性和顺从性。
[0003]对于抗体药品生产，超滤/渗滤(UF/DF)通常是最终的过程步骤。超滤为基于膜的分离过程，其基于尺寸分离溶液中的分子。渗滤为一种特定类型的超滤，其中将含水缓冲液加入到截留物质中。在该步骤中，将纯化的药品浓缩，并且经缓冲液更换(exchange)为药品配制所需的蛋白质浓度和赋形剂组成。
[0004]用于超滤/渗滤(UF/DF)过程行业的主导技术为切向流过滤(TFF)形式(一般来说，参见Shiloach J.等人，1988,Van Reis R.等人,2001)。在该技术中，在压力下,蛋白质溶液切向再循环至超滤膜。该TFF方法对于低至中等浓度下的药品良好地起作用，并且在大多数情况下，对于一种抗体的UF/DF过程高度适应于另一抗体，具有极小变化。然而，在具有高蛋白质浓度的情况下，在过程性能方面存在一系列技术挑战(一般来说，参见ShireSJ.等人，2004，Luo R.等人，2006，Shire SJ.，2009)。
[0005]通过TFF技术达到高浓度制剂可能困难，因为，高度浓缩的蛋白质溶液可导致由降低的通量所致的有限传质和最终的膜污染(参见例如，Suki A.等人，1984，1986，KimKJ.等人，1992)。虽然可通过提高膜表面积或更换膜而克服这一点，但是可导致较低的收率。另一个限制是高粘度可导致高进料压力，在过程期间超过膜完整性的上限(参见例如，Turker M.等人，1987，Liu J.等人，2005)。虽然实施适当的制剂设计(例如提高离子强度或加入特定的化合物)可帮助降低粘度(参见例如，Liu J.等人，2006)，但是降低粘度同时确保稳定的制剂组合物可能是具有挑战性的实践。在需要粘度更大降低的情况下，通过在升高的温度下处理可解决这一点(参见例如,Winter C.，2009)。然而，在这种情况下，由于长时间暴露于较高的温度，可能损害蛋白质稳定性。因此，本发明要解决的问题是，提供一种通过操控其他处理参数的新处理方法以实现高蛋白质浓度。
[0006]引用列举 专利文献
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[0018]发明概述
在生产规模下，用于浓缩蛋白质的行业标准技术是通过切向流超滤。具有高最终浓度的产物的关键挑战是防止膜污染和克服高进料压力。
[0019]总的来说，本公开描述成功浓缩蛋白质(例如抗体制备物、含有所述制备物的药物制剂)的过程参数的具体操控及其在人类治疗或动物治疗中的用途。
[0020] 在实施方案中，本公开提供一种方法，其中进料流速保持在高流速直至优化的蛋白质浓度，随后降低至较低的值以继续进一步浓缩。例如，在等于或大于200 LMH的进料流速下进行浓缩，直至将截留物质溶液浓缩至蛋白质浓度大于200 g/L，其中进料压力累积至超滤膜的指定最大进料压力的85-100%，随后在等于或小于120 LMH的进料流速下继续进一步浓缩。在操作限度内可达到的蛋白质浓度高于常规过程，其包含具有恒定进料流速的一步或包含对早期转变具有逐步降低(step-down)进料流量控制的两步。[0021]在实施方案中，本公开还提供了一种更优选的方法，其中进料流速保持尽可能高，直至浓缩过程结束。例如，进料流速采用一定的方式自动化控制，以在恒定进料流速下，一旦进料压力达到超滤膜的指定最大进料压力的85-100%，保持进料压力在超滤膜的指定最大进料压力的85-100%内。
[0022]在实施方案中，本公开还提供在浓缩过程的中间插入的循环步骤的有效性。例如，在恒定进料流速下，一旦进料压力达到超滤膜的指定最大进料压力的85-100%,插入在10-80 LMH的进料流速下的20分钟循环。该循环步骤可减轻在随后的超滤过程期间进料压力累积。
[0023]概括地说，本发明的一个目标是提供以下[1]_[33]。
[0024][I] 一种通过超滤制备包含高度浓缩的抗体的组合物的方法，其中所述方法包括以下步骤:
1)调节进料流速，使得施用于超滤膜的进料压力的值提高至超滤膜的指定最大进料压力的85-100% ;和
2)降低进料流速，以保持或降低在步骤(I)之后施用于超滤膜的进料压力的值。
[0025][2] [I]的方法，其中抗体制备物在环境温度下处理。
[0026][3] [I]的方法，其中抗体制备物在10_30°C温度下处理。
[0027][4] [I]的方法，其中抗体制备物在15_30°C温度下处理。
[0028][5] [I]的方法，其中所述高度浓缩的抗体具有超过100 g/L的高浓度或超过2mPa.s的粘度。
[0029][6] [I]的方法，其中所述高度浓缩的抗体具有超过200 g/L的高浓度或超过10mPa.s的粘度。
[0030][7] [I]的方法，其中所述高度浓缩的抗体具有超过250 g/L的高浓度或超过40mPa.s的粘度。
[0031][8] [I]的方法，其中在步骤⑴中所述进料流速保持在200 LMH (L/m2/h)或更闻。
[0032][9] [I]的方法，其中在步骤⑴中所述进料流速保持在250 LMH (L/m2/h)或更闻。
[0033][10] [I]、[8]和[9]的方法，其中在步骤(I)中所述进料流速保持在恒定速率。
[0034][11] [I]的方法，其中在步骤(I)中施用于超滤膜的进料压力的最大值为2.0巴-4.0巴。
[0035][12] [I]的方法，其中在步骤(I)中施用于超滤膜的进料压力的最大值为3.5巴。
[0036][13] [I]的方法，其中在步骤⑴中施用于超滤膜的进料压力的最大值为超滤膜的指定最大进料压力的85-100%。
[0037][14] [I]的方法，其中当将截留物质溶液浓缩至大于200 g/L的蛋白质浓度时，步骤⑴转变为步骤⑵。
[0038][15] [I]的方法，其中当将截留物质溶液浓缩至等于或大于220 g/L的蛋白质浓度时，步骤⑴转变为步骤(2)。
[0039][16] [I]的方法，其中当将截留物质溶液浓缩至等于240 g/L的蛋白质浓度时，步骤⑴转变为步骤⑵。[0040][17] [13]的方法，其中在步骤(2)中在进料压力的值降低后，所述进料流速保持在恒定速率。
[0041][18] [13]或[17]的方法，其中在步骤(2)中在进料压力的值降低后，所述进料流速保持在120 LMH (L/m2/h)或更低。
[0042][19] [13]或[17]的方法，其中在步骤(2)中在进料压力的值降低后，所述进料流速保持在80 LMH (L/m2/h)或更低。
[0043][20] [I]的方法，其中在步骤(2)中施用于超滤膜的进料压力的值保持在恒定值。
[0044][21] [I]的方法,其中通过缓慢降低(ramp down)进料流速,在步骤⑵中施用于超滤膜的进料压力的值保持在超滤膜的指定最大进料压力的85-100%内。
[0045][22] [20]或[21]的方法，其中所述进料流速采用一定的方式自动化调节，以通过进料压力和进料流速之间的反馈控制，保持进料压力在超滤膜的指定最大进料压力的85-100% 内。
[0046][23] [I]的方法，所述方法在步骤(I)和步骤(2)之间还包括以下步骤:
3)使抗体制备物再循环通过膜，其中渗透物阀关闭。
[0047][24] [23]方法，其中使抗体制备物再循环，其中截留物质压力控制阀完全打开。
[0048][25] [23]方法，其中在步骤(3)中进料流速保持在5_120 LMH (L/m2/h)的恒定流速。
[0049][26] [23]方法，其中在步骤(3)中进料流速保持在10_80 LMH (L/m2/h)的恒定流速。
[0050][27] [I]的方法，其中抗体制备物的缓冲组合物为10-30 mmol/L组氨酸。
[0051][28] [I]的方法，其中抗体制备物的缓冲组合物为20 mmol/L组氨酸。
[0052][29] [I]的方法，其中抗体制备物的pH为pH 3.Ο-pH 10.0。
[0053][30] [I]的方法，其中抗体制备物的pH为pH 5.5-pH 6.5。
[0054][31] [I]的方法，其中抗体制备物的pH为pH 6.0。
[0055][32] [I]的方法，其中所述超滤膜的分子量截止值为50 kDa或更少。
[0056][33] [I]的方法，其中所述超滤膜的分子量截止值为30 kDa或更少。
[0057][34] [I]的方法，其中所述组合物包含高度浓缩的抗人白介素-6受体单克隆抗体。
[0058][35] [34]的方法,其中所述组合物包含高度浓缩的托珠单抗(tocilizumab)。
[0059][36] 一种液体组合物，所述组合物包含通过[I]的方法制备的高度浓缩的抗体。
[0060][37] 一种药物液体组合物，所述组合物包含通过[I]的方法制备的高度浓缩的抗体和药学上可接受的载体。
[0061][38] 一种通过超滤制备包含高度浓缩的蛋白质的组合物的方法，其中所述方法包括以下步骤:
1)调节进料流速，使得施用于超滤膜的进料压力的值提高至超滤膜的指定最大进料压力的85-100% ;和
2)降低进料流速，以保持或降低在步骤(I)之后施用于超滤膜的进料压力的值。
[0062]还应理解的是，前述发明概述和以下详细说明是举例说明的实施方案，而不是限制本发明或本发明的其它备选实施方案。当结合附图和实施例阅读以下详细说明时，本发明的其它目的和特征将更充分显而易见。特别是，虽然本文参考多个具体实施方案描述了本发明，但应认识到，该描述为举例说明本发明，并且不应看作是限制本发明。在不偏离本发明的精神和范围下，本领域技术人员可以想到各种修改和应用，如在所附权利要求书中所描述的。同样，由本概述和以下描述的某些实施方案，本发明的其它目的、特征、益处和优点显而易见，并且对于本领域技术人员来说将容易显而易见。单独地或考虑本文引用的参考文献，结合所附实施例、数据、图和由其引伸的所有合理的推断，根据上文，这些目的、特征、益处和优点将显而易见。
[0063]附图简述
考虑以下附图简述和发明详述及其优选的实施方案，本发明的各方面和应用对于技术人员来说将变得显而易见，其中:
[图1]图1显示在本公开的实施方案中，用于UF/DF过程的装置。
[0064][图2]图2显示在实验室规模，进料流速、进料压力、截留物质压力、TMP随着时间测量的过程值。在整个过程期间，进料流速设定为250 LMH (L/m2/h)的恒定速率。
[0065][图3]图3显示在实验室规模，进料流速、进料压力、截留物质压力、TMP随着时间测量的过程值。当截留物质体积达到对应于100 g/L的蛋白质浓度值时，进料流速降低至 80 LMH。
[0066][图4]图4显示在实验室规模，进料流速、进料压力、截留物质压力、TMP随着时间测量的过程值。当截留物质体积达到对应于200 g/L的蛋白质浓度值时，进料流速降低至 80 LMH。
[0067][图5]图5显示在实验室规模，进料流速、进料压力、截留物质压力、TMP随着时间测量的过程值。当进料压力超过3.5巴(其对应于240 g/L的蛋白质浓度)时，进料流速降低至80 LMH。
[0068][图6]图6显示在实验室规模，进料流速、进料压力、截留物质压力、TMP随着时间测量的过程值。在250 LMH的恒定进料流速下，一旦进料压力超过3.5巴，则进料流速设定为采用一定的方式自动化流动控制，以保持进料压力为3.5巴。当进料流速降低至80 LMH时，终止操作。
[0069][图7]图7显示在实验室规模，进料流速、进料压力、截留物质压力、TMP随着时间测量的过程值。一旦进料压力超过3.5巴，流动路径转换为循环模式。在80 LMH的恒定进料流速下循环20分钟后，在相同的进料流速下重新开始超滤。
[0070][图8]图8显示在实验室规模，进料流速、进料压力、截留物质压力、TMP随着时间测量的过程值。在10 LMH的恒定进料流速下进行循环。
[0071][图9]图9汇总在本公开的实施方案中，在实验室规模的回收池(recoveredpool)的蛋白质浓度。
[0072][图10]图10显示在本公开的实施方案中，浓缩的人源化IL-6R单克隆抗体的粘度概况。
[0073][图11]图11显示在中试规模，在UF1/DF/UF2步骤中，进料流速、进料压力、截留物质压力、TMP和截留物质体积随着时间测量的过程值。
[0074][图12]图12显示在中试规模，在UF3/UF4步骤中，进料流速、进料压力、截留物质压力、TMP和截留物质体积随着时间测量的过程值。
[0075][图13]图13显示在中试规模，在UF1/DF/UF2步骤中，进料流速、进料压力、截留物质压力、TMP和截留物质体积随着时间测量的过程值。
[0076][图14]图14显示在中试规模，在UF3/UF4步骤中，进料流速、进料压力、截留物质压力、TMP和截留物质体积随着时间测量的过程值。
[0077][图15]图15显示在生产规模，在UF1/DF/UF2步骤中，进料流速、进料压力、截留物质压力、TMP和截留物质体积随着时间测量的过程值。
[0078][图16]图16显示在生产规模，在UF3/UF4步骤中，进料流速、进料压力、截留物质压力、TMP和截留物质体积随着时间测量的过程值。
[0079][图17]图17显示在生产规模，在UF1/DF/UF2步骤中，进料流速、进料压力、截留物质压力、TMP和截留物质体积随着时间测量的过程值。
[0080][图18]图18显示在生产规模，在UF3/UF4步骤中，进料流速、进料压力、截留物质压力、TMP和截留物质体积随着时间测量的过程值。
[0081][图19]图19显示进料流速、进料压力、截留物质压力、TMP随着时间测量的过程值。进料流速在250 LMH (L/m2/h)的恒定速率下操作，当截留物质体积达到对应于60 g/L的蛋白质浓度值时，随后降低至80 LMH。
[0082][图20]图20显示进料流速、进料压力、截留物质压力、TMP随着时间测量的过程值。当进料压力超过3.5巴时，进料流速降低至80 LMH。此时截留物质体积值对应于145g/L的蛋白质浓度。
[0083][图21]图21显示进料流速、进料压力、截留物质压力、TMP随着时间测量的过程值。在250 LMH的恒定进料流速下，一旦进料压力超过3.5巴，则进料流速设定为采用一定的方式自动化流动控制，以保持进料压力为3.5巴。当进料流速降低至80 LMH时，终止操作。
[0084]实施方案的描述
虽然与本文描述的方法和材料类似或等同的任何方法和材料可用于本发明实施方案的实践或测试，但现在描述优选的方法。然而，在描述本发明的方法之前，应理解的是本发明不局限于本文描述的具体的大小、形状、尺寸、材料、方法、方案等，由于这些可根据常规实验和优化而变。还应理解的是，用于本说明书的术语仅为了描述具体的形式或实施方案的目的，并且不旨在限制本发明的范围，本发明的范围仅由所附权利要求书限定。
[0085]在本说明书中提及的每一个出版物、专利或专利申请的公开内容通过引用而全文结合到本文中。然而，绝不应解释为承认，由于在先发明，本发明没有资格早于这些公开内容。
[0086]除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域普通技术人员通常理解的含义。在冲突的情况下，以本说明书(包括定义)为准。此外，材料、方法和实施例仅为说明性的并且不旨在限制性的。
[0087]本发明涉及一种通过超滤制备包含高度浓缩的抗体的组合物的方法。
[0088]本发明包含一种通过超滤制备包含高度浓缩的抗体的组合物的方法，其中进料流速和施用于超滤膜的进料压力可变并且在过滤过程期间变化。
[0089]以下阐述本发明的特别优选的实施方案。[0090]—种通过超滤制备包含高度浓缩的抗体的组合物的方法，其中所述方法包括以下步骤:
1)调节进料流速，使得施用于超滤膜的进料压力的值提高至超滤膜的指定最大进料压力的85-100% ;和
2)降低进料流速，以保持或降低在步骤(I)之后施用于超滤膜的进料压力的值。
[0091]在本发明内使用的术语"超滤"表示基于膜的分离过程，其基于尺寸分离溶液中的分子。术语"切向流过滤(TFF)"表示特定的过滤方法，其中流体相对于膜切向流动。在压力下，通过沿着超滤膜的表面(即，与之切向)流动，浓缩含有蛋白质分子的溶液。超滤膜的孔尺寸具有某一截止值。在一个实施方案中，截止值为50 kDa或更少，优选30kD或更少。
[0092]术语〃进料流动〃表示流体从进料泵到膜的流动。术语〃进料流速〃表示溶液到膜的流动的体积速率。进料流速通常按每单位时间的体积给出，如升/分钟，并且按每单位膜面积每单位时间的体积归一化，如l/m2/h (LMH)。术语〃通量〃表示按每单位膜面积每单位时间的体积归一化的通过膜的渗透物流，如l/m2/h (LMH)。
[0093]术语〃进料压力〃表示施用于超滤膜入口的压力。表述〃最大进料压力〃表示由销售商指定作为超滤膜的产品规格的进料压力的可接受的最大值。术语"截留物质压力"表示施用于超滤膜出口的压力。术语"渗透物压力"表示施用于超滤膜的渗透物侧的压力。术语〃跨膜压力(TMP)"表示驱动流体穿过超滤膜而滤出的压力。TMP的值可如下计算:
TMP= (P进料+P截麵质)/2-P渗透物
在TFF设备中的渗透物侧打开的情况下，TMP为进料压力和截留物质压力的平均值。压力值通常按〃巴〃或〃MPa〃或〃psi〃给出。
[0094]术语〃抗体〃指特异识别抗原的蛋白质。抗体可为单克隆或多克隆的。抗体可以多种形式存在，包括，例如，Fv、Fab和F(ab)2以及单链(scFv)或双抗体。此外，抗体的任何片段或修饰(例如，嵌合抗体、人源化抗体等)可用于本发明的方法。制备这些种类的抗体的方法为本领域公知的，并且任何方法可用于本发明，以制备所述抗体及其片段。
[0095]用于本发明的单克隆抗体不仅包括衍生自动物(例如人、小鼠、大鼠、仓鼠、兔子、绵羊、骆驼和猴子)的那些，而且包括人工修饰的基因重组抗体，例如嵌合抗体、人源化抗体和双特异性抗体。本发明的抗体还包括由人工修饰抗体恒定区得到的基因重组抗体，以改变抗体分子的物理性质(特别是，改变等电点(PD、改进对Fe受体的亲和力等)，用于改进血液持续性和体内药代动力学的目的。
[0096]用于本发明的免疫球蛋白类抗体没有特别的限制；并且该类别可为任何类别，包括 IgG，例如 IgGl、IgG2、IgG3 和 IgG4、IgA、IgD、IgE 和 IgM0 然而，优选 IgG 和 IgM0
[0097]用于本发明的抗体包括但不限于抗组织因子抗体、抗IL-6受体抗体、抗IL-6抗体、抗HMl.24抗原单克隆抗体、抗甲状旁腺激素-相关的肽抗体(抗PTHrP抗体)、抗磷脂酰肌醇聚糖-3抗体、抗神经节苷脂GM3抗体、抗TPO受体激动剂抗体、作为凝血因子VIII的功能取代物的抗体、抗IL31受体抗体、抗HLA抗体、抗AXL抗体、抗CXCR4抗体、抗NRlO抗体和针对因子IX和因子X的双特异性抗体。
[0098]用于本发明的优选的人源化抗体包括抗人源化白介素6 (IL-6)受体抗体(托珠单抗、hPM-Ι和MRA)(参见WO 92/19759)、人源化抗HMl.24抗原单克隆抗体(参见WO98/14580)、人源化抗甲状旁腺激素-相关的肽抗体(抗PTHrP抗体)(参见WO 98/13388)、人源化抗组织因子抗体(参见WO 99/51743)、人源化抗磷脂酰肌醇聚糖-3 IgGl κ抗体(参见PCT/JP05/013103)和抗NRlO人源化抗体(参见W02009/072604)。用于本发明的特别优选的人源化抗体为人源化抗IL-6受体抗体。
[0099]优选的人IgM抗体包括重组人抗神经节苷脂GM3 IgM抗体(参见WO 05/05636)。
[0100]优选的微抗体(minibodies)包括抗TPO受体激动剂双抗体(参见WO 02/33072)和抗CD47激动剂双抗体(参见WO 01/66737)。
[0101]此外，具有改进的等电点的抗体包括例如Mabl，其为在WO 2011/090088中描述的抗IL-6受体抗体(其中的H链/SEQ ID NO:1;其中的L链/SEQ ID NO: 2)和完全人源化NS22抗体，其为抗NRlO人源化抗体，通过W02009/072604的实施例12中描述的方法生产。
[0102]本发明还涉及一种通过超滤制备包含非抗体的高度浓缩的蛋白质的组合物的方法。本发明包含一种通过超滤制备包含高度浓缩的蛋白质的组合物的方法，其中进料流速和施用于超滤膜的进料压力可变，并且在过滤过程期间变化。用于本发明的蛋白质包括但不限于酶、细胞因子和肽适体。
[0103]在本申请内使用的表述"包含高度浓缩的抗体的组合物"表示含有高度浓缩的抗体的含水的缓冲溶液。在本申请内使用的术语"缓冲液"表示溶液，其中由于添加或释放酸性或碱性物质，PH变化被缓冲物质抵消。可使用导致该效果的任何缓冲物质。在一个实施方案中，使用药学上可接受的缓冲物质，例如磷酸或其盐、乙酸或其盐、柠檬酸或其盐、吗啉或其盐、2-(N-吗啉代)乙磺酸或其盐或三(羟甲基)氨基甲烷(TRIS)或其盐。在一个优选的实施方案中，抗体制备物的缓冲组合物为10-30 mmol/L组氨酸。在更优选的实施方案中，抗体制备物的缓冲组合物为20 mmol/L组氨酸。
[0104]任选缓冲溶液可包含额外的盐，例如，氯化钠和/或硫酸钠和/或氯化钾和/或硫酸钾和/或柠檬酸钠和/或柠檬酸钾。
[0105]在本发明的一个实施方案中，抗体制备物的pH为pH 3.Ο-pH 10.0，优选pH
5.5-pH 6.5，更优选 pH 6.0。
[0106]在本发明的一个实施方案中，抗体制备物在环境温度下处理，优选在10_30°C温度下，更优选在15-30°C温度下。
[0107]在一个实施方案中，高度浓缩的抗体具有超过100 g/L的蛋白质浓度或超过2mPa.s的粘度。在一个优选的实施方案中，高度浓缩的抗体具有超过200 g/L的蛋白质浓度或超过10 mPa.s的粘度。在更优选实施方案中，高度浓缩的抗体具有超过250 g/L的蛋白质浓度或超过40 mPa.s的粘度。
[0108]在一个实施方案中，在步骤(I)中进料流速保持在200 LMH (L/m2/h)或更高。在一个优选的实施方案中，在步骤(I)中进料流速保持在250 LMH (L/m2/h)或更高。在这些实施方案中，在步骤(I)中进料流速优选保持在恒定速率。
[0109]在一个实施方案中，在步骤(I)中施用于超滤膜的进料压力的最大值在超滤膜的指定最大进料压力的85-100%内。在一个优选的实施方案中，进料压力的最大值为2.0巴-4.0巴。在一个更优选实施方案中，在步骤(I)中施用于超滤膜的进料压力的最大值为
3.5 巴。[0110]在一个实施方案中，当将截留物质溶液浓缩至大于200 g/L的蛋白质浓度时，步骤
(1)转变为步骤(2)。在一个优选的实施方案中，当将截留物质溶液浓缩至等于或大于220g/L的蛋白质浓度时，步骤(1)转变为步骤(2)。在一个更优选实施方案中，当将截留物质溶液浓缩至等于240 g/L的蛋白质浓度时，步骤(1)转变为步骤(2)。
[0111]在该实施方案中，在步骤(2)中在进料压力的值降低后，进料流速保持在恒定速率，优选120 LMH (L/m2/h)或更低，或更优选80 LMH (L/m2/h)或更低。
[0112]在一个实施方案中，在步骤(2)中施用于超滤膜的进料压力的值保持在恒定值。
[0113]在一个实施方案中，通过缓慢降低进料流速，在步骤(2)中施用于超滤膜的进料压力的值保持在超滤膜的指定最大进料压力的85-100%内。
[0114]在一个实施方案中，进料流速采用一定的方式自动化调节，以通过进料压力和进料流速之间的反馈控制，保持进料压力在超滤膜的指定最大进料压力的85-100%内。
[0115]在一个实施方案中，根据本发明的生产方法在步骤(1)和步骤(2)之间还包括以下步骤:
3)使抗体制备物再循环通过膜，其中渗透物阀关闭。
[0116]在该实施方案中，使抗体制备物再循环，其中截留物质压力控制阀完全打开。
[0117]在该实施方案中，在步骤(3)中进料流速优选保持在5-120 LMH (L/m2/h)的恒定流速，更优选 10-80 LMH (L/m2/h)。
[0118]本发明还涉及一种液体组合物，所述组合物包含通过本发明的方法制备的高度浓缩的抗体。
[0119]本发明还涉及药物液体组合物。本发明的药物液体组合物可包含药学上可接受的载体。
[0120]在本发明中，药物液体组合物通常指用于治疗、预防、测试或诊断疾病的试剂。
[0121]本发明的药物液体组合物可通过本领域技术人员已知的方法配制。例如，它们可肠胃外使用，以包括水或其它药学上可接受的液体的无菌溶液剂或混悬剂的注射剂的形式。例如，所述液体组合物可通过以在通常批准的药物生产实践中所需的单位剂量形式混合而配制:通过与药学上可接受的载体或介质适当合并，特别是与无菌水、生理盐水、植物油、乳化剂、悬浮剂、表面活性剂、稳定剂、矫味剂、赋形剂、媒介物、防腐剂、粘合剂等适当合并。在这样的制剂中，调节活性成分的量，以得到在预定范围的适当的量。
[0122]根据标准配制实践，使用媒介物(例如注射用蒸馏水)，可配制注射用无菌组合物。
[0123]注射用含水溶液包括例如，生理盐水和含有葡萄糖或其它辅剂(例如，D-山梨糖醇、D-甘露糖、D-甘露醇和氯化钠)的等渗溶液。还可与适当的增溶剂组合使用，例如，醇(乙醇等)、多元醇(丙二醇、聚乙二醇等)、非离子表面活性剂(聚山梨酯80(TM)、HC0-50等）。[0124]油包括芝麻油和大豆油。苯甲酸苄酯和/或苄醇可组合使用作为增溶剂。还可组合缓冲液(例如，磷酸盐缓冲液和乙酸钠缓冲液)、舒缓剂(例如，盐酸普鲁卡因)、稳定剂(例如，苄醇和苯酚)和/或抗氧化剂。适当的安瓿填充有制备的注射剂。
[0125]本发明的药物液体组合物优选肠胃外给予。例如，液体组合物可为用于注射、经鼻给予、经肺给予或透皮给予的剂型。例如，它们可通过静脉内注射、肌内注射、腹膜内注射、皮下注射等全身或局部给予。
[0126]考虑患者的年龄和症状，可适当选择给药方法。对于每次给药，含有抗原-结合分子的药物液体组合物的剂量可为例如0.0001-1000 mg/kg。或者，剂量可为例如
0.001-100，000 mg/患者。然而，本发明不局限于上述数值。剂量和给药方法根据患者的体重、年龄、症状等而变。考虑上述因素，本领域技术人员可设定适当的剂量和给药方法。
实施例
[0127]以下实施例用于更充分地描述使用上述公开的方式，以及阐述考虑用于实施本公开的各方面的最佳方式。应理解的是，这些实施例绝不用于限制本公开的真实范围，而是用于举例说明的目的而呈现。
[0128]比较实施例1
图1说明用于进行超滤过程的装置的主要部件。再循环槽含有初始材料和截留物质。混合装置确保在经由转运线加入的初始池和由超滤膜返回至再循环槽的截留物质之间的均匀混合。进料泵在膜之上产生切向流。在膜的入口测量进料压力。在膜下游的截留物质侧上使用截留物质压力控制阀，以调节截留物质压力，例如在跨膜压力(TMP)控制下。在膜和截留物质压力控制阀之间，压力传感器测量截留物质压力。在膜的渗透物侧上，通过膜过滤的液体的压力通过渗透物压力传感器监测。
[0129]对于实验室规模超滤处理，使用自动化TFF系统AKTA错流(GE Healthcare，US)。使用具有再生纤维素的Hydrosart膜的0.02 m2 Sartocon slice盒进行超滤过程,标称分子量截止值为30 kDa，并且最大进料压力规格为4.0巴(Sartorius，德国)。
[0130]在使用前，膜盒用I mol/L氢氧化钠清洁，并用净化水漂洗。测定归一化通量，以确保可比的膜性质。在过程前，膜盒用30 mmol/L组氨酸缓冲液(pH 5.8)平衡。超滤在环境温度下操作。
[0131]原料由人源化抗人白介素-6受体(IL-6R)单克隆抗体(托珠单抗(注册商标:ACTEMRA, RoACTEMRA)，参见PCT公布号W092/19759，美国专利号5795965)的纯化的池制备。将纯化的的池浓缩至高达60 mg/mL,并且缓冲液更换至30 mmol/L组氨酸缓冲液(pH 5.8)中。
[0132]将缓冲液更换的池(DF池)装载到TFF系统，具有625 g抗体/m2。在整个过程期间进料流速设定为250 LMH (L/m2/h)的恒定速率。TMP控制在1.0巴，直至截留物质压力控制阀完全打开。操作超滤过程，其中渗透物侧末端开口。当进料压力超过3.5巴时，终止操作。在超滤处理后，将浓缩的溶液循环，其中在10 mL/分钟的恒定截留物质流速下将渗透物侧关闭15分钟，随后回收到量筒中。将回收池搅拌，直至在视觉上均质。
[0133]对于蛋白质浓度测量，使用通过密度计DMA 4500 (Anton Paar，奥地利)测量的密度值，通过重量分析稀释回收池。使用UV/Vis分光光度计DU800 (Beckman Coulter, US)测量在280 nm下的UV吸光度。
[0134]图2显示进料流速、进料压力、截留物质压力、TMP随着时间测量的过程值。表I显示蛋白质浓度测量的结果。
[0135][表 I]
【权利要求】
1.一种通过超滤制备包含高度浓缩的抗体的组合物的方法，其中所述方法包括以下步骤: 1)调节进料流速，使得施用于超滤膜的进料压力的值提高至超滤膜的指定最大进料压力的85-100% ;和 2)降低进料流速，以保持或降低在步骤(1)之后施用于超滤膜的进料压力的值。
2.权利要求1的方法，其中抗体制备物在环境温度下处理。
3.权利要求1的方法，其中抗体制备物在10-30°C温度下处理。
4.权利要求1的方法，其中抗体制备物在15-30°C温度下处理。
5.权利要求1的方法，其中所述高度浓缩的抗体具有超过100g/L的高浓度或超过2mPa.s的粘度。
6.权利要求1的方法，其中所述高度浓缩的抗体具有超过200g/L的高浓度或超过10mPa.s的粘度。
7.权利要求1的方法，其中所述高度浓缩的抗体具有超过250g/L的高浓度或超过40mPa.s的粘度。
8.权利要求1的方法，其中在步骤(1)中所述进料流速保持在200LMH (L/m2/h)或更闻。
9.权利要求1的方法，其中在步骤(1)中所述进料流速保持在250LMH (L/m2/h)或更闻。
10.权利要求1、8和9的方法，其中在步骤(1)中所述进料流速保持在恒定速率。
11.权利要求1的方法，其中在步骤(1)中施用于超滤膜的进料压力的最大值为2.0巴-4.0巴。
12.权利要求1的方法，其中在步骤(1)中施用于超滤膜的进料压力的最大值为3.5巴。
13.权利要求1的方法，其中在步骤(1)中施用于超滤膜的进料压力的最大值为超滤膜的指定最大进料压力的85-100%。
14.权利要求1的方法，其中当将截留物质溶液浓缩至大于200g/L的蛋白质浓度时，步骤⑴转变为步骤⑵。
15.权利要求1的方法，其中当将截留物质溶液浓缩至等于或大于220g/L的蛋白质浓度时，步骤⑴转变为步骤(2)。
16.权利要求1的方法，其中当将截留物质溶液浓缩至等于240g/L的蛋白质浓度时，步骤⑴转变为步骤⑵。
17.权利要求13的方法，其中在步骤(2)中在进料压力的值降低后，所述进料流速保持在恒定速率。
18.权利要求13或17的方法，其中在步骤(2)中在进料压力的值降低后，所述进料流速保持在120 LMH (L/m2/h)或更低。
19.权利要求13或17的方法，其中在步骤(2)中在进料压力的值降低后，所述进料流速保持在80 LMH (L/m2/h)或 更低。
20.权利要求1的方法，其中在步骤(2)中施用于超滤膜的进料压力的值保持在恒定值。
21.权利要求1的方法，其中通过降低进料流速，在步骤(2)中施用于超滤膜的进料压力的值保持在超滤膜的指定最大进料压力的85-100%内。
22.权利要求20或21的方法，其中所述进料流速采用一定的方式自动化调节，以通过进料压力和进料流速之间的反馈控制，保持进料压力在超滤膜的指定最大进料压力的85-100% 内。
23.权利要求1的方法，所述方法在步骤(1)和步骤(2)之间还包括以下步骤: 3)使抗体制备物再循环通过膜，其中渗透物阀关闭。
24.权利要求23的方法，其中使抗体制备物再循环，其中截留物质压力控制阀完全打开。
25.权利要求23的方法，其中在步骤(3)中进料流速保持在5-120LMH (L/m2/h)的恒定流速。
26.权利要求23的方法，其中在步骤(3)中进料流速保持在10-80LMH (L/m2/h)的恒定流速。
27.权利要求1的方法，其中抗体制备物的缓冲组合物为10-30mmol/L组氨酸。
28.权利要求1的方法，其中抗体制备物的缓冲组合物为20mmol/L组氨酸。
29.权利要求1的方法，其中抗体制备物的pH为pH3.Ο-pH 10.0。
30.权利要求1的方法，其中抗体制备物的pH为pH5.5-pH 6.5。
31.权利要求1的方法，其中抗体制备物的pH为pH6.0。
32.权利要求1的方法，其中所述超滤膜的分子量截止值为50kDa或更少。
33.权利要求1的方法，其中所述超滤膜的分子量截止值为30kDa或更少。
34.权利要求1的方法，其中所述组合物包含高度浓缩的抗人白介素-6受体单克隆抗体。
35.权利要求34的方法，其中所述组合物包含高度浓缩的托珠单抗。
36.一种液体组合物，所述组合物包含通过权利要求1的方法制备的高度浓缩的抗体。
37.一种药物液体组合物，所述组合物包含通过权利要求1的方法制备的高度浓缩的抗体和药学上可接受的载体。
38.一种通过超滤制备包含高度浓缩的蛋白质的组合物的方法，其中所述方法包括以下步骤: 1)调节进料流速，使得施用于超滤膜的进料压力的值提高至超滤膜的指定最大进料压力的85-100% ;和 2)降低进料流速，以保持或降低在步骤(1)之后施用于超滤膜的进料压力的值。
【文档编号】C07K1/34GK103889555SQ201280053636
【公开日】2014年6月25日 申请日期:2012年8月31日 优先权日:2011年9月1日
【发明者】K.劳, J.本德, 田中佐伊子, 若山瑠美子, 山田秀成, 矶田知纪, 大枝匡义 申请人:中外制药株式会社, 吉宁特有限公司