细胞dna损伤检测方法
【专利摘要】细胞DNA损伤检测方法，涉及细胞损伤检测。将待测细胞样品与用无钙、镁PBS配制的低熔点琼脂糖凝胶预热，取混合液铺在24孔细胞培养板板盖样品孔中，使胶平展铺开冷却固化，再将板盖浸入细胞裂解液中裂解；用碱性解旋液冲洗裂解后的胶板，然后将胶板浸入装有预冷碱性解旋液的容器中；将碱解旋后的胶板置于装有预冷电泳液的电泳槽中电泳；将电泳后的胶板在Milli-Q水中浸泡；将胶板用预冷无水乙醇静置浸泡后，取出胶板，将胶板冷藏保存；在脱水干燥后的胶板上每孔滴加一滴Milli-Q水，静置，润湿胶板后每孔滴加10～15μL的溴化乙啶，避光染色，用滤纸吸干胶板表面残余的染液，即可在515nm激发波长下进行图像采集。
【专利说明】细胞DNA损伤检测方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及细胞损伤检测，特别是涉及一种细胞DNA损伤检测方法。
【背景技术】
[0002]在癌症病人中，DNA遗传信息的稳定性受到不同程度的破坏，这表明癌症的发生与DNA损伤具有十分密切的关系。目前环境中存在着多种多样有害物理、化学因子(如紫外辐射、农药残留以及其他有机污染物等)能直接或者间接引起细胞DNA损伤，而且每年还有大量的新增因子进入环境中，那么快速有效地对现有以及新进入环境因子进行致DNA损伤毒性检测，有利于及时采取措施对有害因子进行控制和治理，减少相关癌症以及遗传性疾病的发生，对于环境监测和保护具有重要意义。
[0003]单细胞凝胶电泳技术(Single cell gel electrophoresis, SCGE)作为检测细胞DNA损伤的方法之一，由Ostling等人首次提出，经Singh等人进一步改善后建立了碱性单细胞凝胶电泳技术。其制胶板过程:将正常熔点琼脂糖(NMA)滴到载玻片的磨砂面，迅速盖上干净的盖玻片，冷凝；将含样品细胞的低熔点琼脂糖(LMA)滴到第一层胶板上，使其凝固；最后在再滴加LMA。第一层的主要目的是使第二层平整和附着紧密，第三层胶的目的是对第二层细胞起保护作用。随后进行裂解、解旋、电泳、染色、结果观察。其制胶板过程工艺复杂，每次样品检测数量有限，而且在后期操作中容易脱胶，导致实验失败。
[0004]近几年，研究者对常规单细胞凝胶技术不断进行改进。
[0005]Peggy等人(Peggy L O, Judit P B.The commet assay:a method to measure DNAdamage in individual cells.Nature Protocols.2006，1:23-29)将载玻片用 1%正常溶点琼脂糖凝胶浸泡，取出擦净一面后烘干得一面附有底膜的玻片，保存备用。随后可将与待测细胞样品混匀的琼脂糖凝胶铺于预先镀膜的胶板上。
[0006]McNamee 等人(McNamee J P, McLean J R, Ferrarotto C L, Bellier P V.Cometassay:rapid processing of multiple samples.Mutation Research.2000，466:63-69)在常规SCGE的基础上提出了 Gelbond法，使用一种能够粘附低熔点琼脂糖凝胶的膜代替常规SCGE中的底膜，其它步骤不变，该方法相对常规SCGE能够有效减少掉胶率，但是具有粘附低熔点琼脂糖凝胶功能的Gelbond膜价格昂贵，而且不能重复利用，大量使用时成本较高。
[0007]David等人(David K W，David M W，Sangeeta N B.Single cell trapping and DNAdamage analysis using microwell arrays.PNAS.2010，107:10008-10013)在使用Gelbond膜的基础上，引入微室阵列法。该方法为先采用SU-8型感光树脂、平板印刷版、硅晶圆等材料经过UV射线照射，丙二醇甲醚醋酸酯显影等步骤制得微室模具，再在铺有溶解的正常熔点的琼脂糖凝胶的Gelbond膜上用模具制微室，待胶凝固后，移去模具，制得微室，微室制好后，即可在微室中加入待测细胞样品，并铺上一层低熔点琼脂糖凝胶，凝固后按常规SCGE进行后面的步骤。微室阵列法较常规SCGE改进了胶板的制备过程，并且微室中的每一个细胞位置明确，采用全自动分析，确保分析到每一个细胞，但是微室阵列法中微室模具制作过程精密复杂，模具需随着细胞大小的变化而变化，改变受试细胞时，需重新优化模具，过程 复杂，全自动阅片需要有专门的配套设备，硬件和技术要求高，影响其推广和应用。
【发明内容】
[0008]本发明的目的在于针对现有技术中存在的上述问题，提供一种快速、灵敏度高、工艺简单的细胞DNA损伤检测方法。
[0009]本发明包括以下步骤:
[0010]I)凝胶板的制备:将待测细胞样品与用无钙、镁PBS配制的低熔点琼脂糖凝胶预热，取混合液铺在24孔细胞培养板板盖样品孔中，使胶平展铺开，冷却固化；
[0011]2)细胞裂解:将铺有单层胶的24孔细胞培养板板盖浸入细胞裂解液中裂解；
[0012]3) DNA碱解旋:用碱性解旋液冲洗裂解后的胶板,然后将胶板浸入装有预冷碱性解旋液的容器中，静置；
[0013]4)电泳:将碱解旋后的胶板先用电泳液冲洗，然后置于装有预冷电泳液(TAE)的电泳槽中进行电泳；
[0014]5)中和:将电泳后的胶板在Mill1-Q水中浸泡；
[0015]6)脱水与晾干:用滤纸吸去中和后胶板表面的残留水，将胶板用预冷无水乙醇静置浸泡后，取出胶板，重复脱水一次，将自然晾干之后的胶板冷藏保存；
[0016]7)染色以及图像采集:在脱水干燥后的胶板上每孔用胶头滴管滴加一滴Mill1-Q水，静置，润湿胶板后每孔滴加10?15 μ L的溴化乙啶，避光染色，用滤纸吸干胶板表面残余的染液，即可在515nm激发波长下进行图像采集。
[0017]在步骤I)中，所述将待测细胞样品与用无钙、镁PBS配制的低熔点琼脂糖凝胶预热的方法可为:将24孔细胞培养板板盖绞掉一组对应的横或者竖的外围，另一组保留，再将待测细胞样品与用无钙、镁PBS配制的低熔点琼脂糖凝胶(LMA)预热；所述预热的温度可为37°C;所述取混合液铺在24孔细胞培养板板盖样品孔中可取50?80 μ L混合液铺在24孔细胞培养板板盖样品孔中；所述使胶平展铺开可采用枪头辅助推胶使胶平展铺开；所述冷却的条件可为4°C下冷却3?5min ;所述LMA的质量分数为0.4%?0.6%，所述待测样品细胞密度为8?IOX IO5个/mL，细胞悬液与LMA的体积比为1: 3?5。
[0018]在步骤2)中，所述将铺有单层胶的24孔细胞培养板板盖浸入细胞裂解液中裂解可将铺有单层胶的24孔细胞培养板板盖浸入4°C的细胞裂解液中避光裂解1.5?2h ;
[0019]所述细胞裂解液的组成可为100mmol/L Na2EDTA,2.5mol/L NaCl、10mmol/LTris-HCl缓冲液，pH= IO ;临用前加Triton X-100至体积分数1%，同时加DMSO至体积分数10%。
[0020]在步骤3)中，所述静置可在4°C避光静置15?25min ;所述解旋液的组成可为lmmol/L Na2EDTA,300mmol/L NaOH,pH>13。
[0021]在步骤4)中，所述电泳液为TAE，50XTAE配制方法为242g Tris_base、37.2gNa2EDTA.2Η20，加入57.1mL的冰乙酸充分溶解，用NaOH溶液调节pH值为8.3,Mill1-Q水定容至1L，室温保存，使用前将其稀释50倍并置于4°C冷藏2h以上；所述电泳的条件可为:电泳的电压为15?25V (恒压)，电泳的时间为10?30min。
[0022]在步骤5)中，所述浸泡可浸泡5?lOmin，重复2?3次。
[0023]在步骤6)中，所述静置浸泡的时间可为10?15min。[0024]在步骤7)中，所述静置的时间可为2?3min ;所述溴化乙啶的浓度可为I μ g/mL,所述避光染色的时间可为10?15min。
[0025]本发明提供了一种细胞DNA损伤的快速检测方法。包括凝胶板制备、细胞裂解、DNA碱解旋、电泳、中和、脱水与晾干、染色及图像采集步骤。以24孔细胞培养板板盖代替传统的载玻片为胶承载体，将样品细胞悬液与低熔点琼脂糖凝胶混匀，用移液枪将定量的混合液置于胶承载体样品孔中，枪头轻轻带动，使其平坦地铺满整个样品孔，待胶板冷却后即可进行后续步骤；与传统载玻片点样工艺相比，本发明仅铺单层胶，简化了胶板制备工艺，并且24孔细胞培养板板盖样品孔大小合适，不仅保证了单个样品足够的胶面积，而且胶层薄，不易出现细胞重叠现象，有利于保证电泳条件的一致和图像的采集。常规方法中要求“制板后必须尽快观察，以免失真”。为解决上述问题，本方法增加了点样板的脱水和自然晾干过程，不仅使胶板能够长期保存，随看随染色，提高了实验的灵活性，而且脱水晾干后，胶层像膜一样镀在胶承载体上，核DNA在同一个平面上，图像观察时无需反复调焦，效率大为提闻。
[0026]本发明与现有技术相比，具有如下优点和效果:
[0027](I)本发明以24孔细胞培养板盖孔作为胶承载体，采用移液枪头辅助推胶方法，形成极其薄的单层胶，克服了常规点样工艺中由于胶量多，胶易冷却而导致胶流动性差无法铺开的问题，而且本发明采用单层胶，简化了传统工艺的2?3层制胶法。
[0028](2)本发明在传统单细胞凝胶电泳过程中加入了乙醇脱水步骤，经过脱水晾干之后的胶板可以长期保存，在需要观察结果时再染色，与传统工艺相比，大大提高了实验的灵活性和方便性。并且经脱水晾干后的胶板像“膜”一样镀在24孔板孔内，染色斑几乎在同一平面上，观察时无需反复调焦，效率大为提高。
[0029](3)由于本发明所制的胶板极薄，EB染料浓度仅需I μ g/mL，仅为常规使用浓度的1/10?1/100，每孔10 μ L即可达到很好的图片效果，大大降低了剧毒药品EB在实验中的用量。
[0030](4)本发明中电泳和解旋过程采用了不同的缓冲液，解旋用常规的碱解旋液，而电泳用的是ΤΑΕ，传统单细胞凝胶电泳裂解和解旋都用碱解旋液,而碱解旋液离子浓度非常高，经常造成电流或电压(恒压或恒流)过载，无法达到预设值，导致实验难以进行。而采用TAE作为电泳液，很好地解决了上述问题。
【专利附图】
【附图说明】
[0031]图1为小鼠原代脾细胞的单细胞凝胶电泳的荧光显微镜图。Control (a)为空白对照，所用受试化合物为H2O2,浓度分别为I μ mol/L(b) >20 μ mol/L(c) >40 μ mol/L(d),作用时间1.5h,受试细胞为小鼠原代脾细胞。
[0032]图2为人急性单核细胞(THP-1)的单细胞凝胶电泳的荧光显微镜图。Control (a)为空白对照，所用受试化合物为HgCl2,浓度分别为I μ mol/L (b) >10 μ mol/L (c) >100 μ mol/L(d)，作用时间1.5h，受试细胞为人急性单核细胞。
[0033]图3为小鼠原代脾细胞的单细胞凝胶电泳的荧光显微镜图。Control (a)为空白对照，所用受试化合物为CuCl2,浓度分别为10nmol/L(b)、100nmol/L (c)、1 μ mol/L (d),作用时间1.5h,受试细胞为小鼠原代脾细胞。【具体实施方式】
[0034]实施例1:
[0035](I)小鼠(Cavia porcellus)脾细胞样品的制备:颈椎脱臼处死小鼠，75%乙醇简单处理之后于超净台中迅速取出脾，置于玻璃平皿内，用预冷的PBS缓冲液冲洗掉表面的血液后，将其浸在PBS缓冲液中，用眼科手术剪刀将其剪碎为I?2mm3的小块。将悬有脾小块的PBS缓冲液吸入一次性无菌注射器(拔去针头)中反复压滤，过300目细胞筛，收集细胞悬液。常温下，1500rpm离心IOmin得细胞沉淀，再将其重悬于RMP1-1640中，并调节细胞密度约为8 X IO5个/mL。
[0036](2)细胞暴污:将细胞接种于24孔细胞培养板中，然后加入H2O2溶液，H2O2浓度分别为I μ mol/L、20 μ mol/L、40 μ mol/L,同时设一个空白对照组，4°C暴污1.5h。暴污结束后，用PBS洗涤2次，IOOOrpm离心收集细胞，再用PBS重悬，调节细胞密度约为8 X IO5个/mL待用。
[0037](3)凝胶板的制备:将已准备好的细胞样品与用无钙、镁的PBS配制的0.5%的低熔点的琼脂糖凝胶在37°C下预热并混匀，取70 μ L铺于24孔细胞培养板板盖样品孔中，每个样品重复3个或以上，4°C冷却3?5min使胶层固化。
[0038](4)细胞裂解:将铺有单层胶的24孔细胞培养板板盖浸入细胞裂解液，于4°C避光裂解1.5h。
[0039](5) DNA碱解旋:用碱解旋液小心冲洗裂解后的胶板，然后将胶板置于装有预冷碱解旋液容器中，4°C避光解旋20min。
[0040](6)电泳:将碱解旋后的胶板先用电泳液冲洗，然后置于装有预冷电泳液(TAE)的电泳槽中进行电泳，电泳电压为20V (恒压)，电泳时间为15min。
[0041](7)中和:将电泳后的胶板置于装有Mill1-Q水中常温下浸泡5min,重复2次。
[0042](8)脱水与晾干:用滤纸尽量吸去中和后胶板表面的残留水，将胶板用预冷无水乙醇静置浸泡lOmin，取出胶板，重复脱水一次，将自然晾干之后的胶板冷藏保存。
[0043](9)染色以及图像观察:在脱水干燥后的胶板上每孔用胶头滴管滴加一滴Mill1-Q 7jC,常温下静置3min。润湿胶板后每孔滴加10 μ L的溴化乙啶(I μ g/mL)，避光染色IOmin ;用滤纸吸干胶板表面残余的染液，即可在515nm激发波长下进行图像采集。
[0044]实验结果(见图1)显示损伤的小鼠脾细胞的DNA碎片形成典型的彗星图像，而且拖尾长度与H2O2浓度呈现剂量效应关系。
[0045]实施例2:
[0046](I)人急性单核细胞(THP-1)样品的制备:THP-1细胞培养在10%胎牛血清、100U/mL青霉素、100U/mL链霉素的RMPI1640培养基中，37°C、5%C02细胞培养箱培养。传代时用移液枪轻轻吹打使细胞均匀即可直接传代，根据实验需要将细胞接种于24孔细胞培养板中培养24h待用。
[0047](2)细胞暴污:将细胞接种于24孔细胞培养板中，然后加入HgCl2溶液，HgCl2浓度分别为I μ mol/L、10 μ mol/L、100 μ mol/L,同时设一个空白对照组，4°C暴污1.5h。暴污结束后，用PBS洗涤2次，1200rpm离心收集细胞，再用PBS重悬，调节细胞密度约为8 X IO5个/mL待用。[0048](3)后续操作参照实施例1步骤3?9。实验结果见图2。
[0049]实施例3:
[0050](I)小鼠(Cavia porcellus)脾细胞样品的制备参照实施例1步骤I。
[0051](2)细胞暴污:将细胞接种于24孔细胞培养板中，然后加入CuCl2溶液，CuCl2浓度分别为10nmol/L、100nmol/L、l μ mol/L,同时设一个空白对照组，4°C暴污1.5h。暴污结束后，用PBS洗涤2次，IOOOrpm离心收集细胞，再用PBS重悬，调节细胞密度约为8 X IO5个/mL待用。
[0052](3)后续操作参照实施例1步骤3?9。实验结果见图3。
【权利要求】
1.细胞DNA损伤检测方法，其特征在于包括以下步骤: 1)凝胶板的制备:将待测细胞样品与用无钙、镁PBS配制的低熔点琼脂糖凝胶预热，取混合液铺在24孔细胞培养板板盖样品孔中，使胶平展铺开，冷却固化； 2)细胞裂解:将铺有单层胶的24孔细胞培养板板盖浸入细胞裂解液中裂解； 3)DNA碱解旋:用碱性解旋液冲洗裂解后的胶板，然后将胶板浸入装有预冷碱性解旋液的容器中，静置； 4)电泳:将碱解旋后的胶板先用电泳液冲洗，然后置于装有预冷电泳液的电泳槽中进行电泳； 5)中和:将电泳后的胶板在Mill1-Q水中浸泡； 6)脱水与晾干:用滤纸吸去中和后胶板表面的残留水，将胶板用预冷无水乙醇静置浸泡后，取出胶板，重复脱水一次，将自然晾干之后的胶板冷藏保存； 7)染色以及图像采集:在脱水干燥后的胶板上每孔用胶头滴管滴加一滴Mill1-Q水，静置，润湿胶板后每孔滴加10~15 μ L的溴化乙啶，避光染色，用滤纸吸干胶板表面残余的染液，即可在515nm激发波长下进行图像采集。
2.如权利要求1所述细胞DNA损伤检测方法，其特征在于在步骤I)中，所述将待测细胞样品与用无钙、镁PBS配制的低熔点琼脂糖凝胶预热的方法为:将24孔细胞培养板板盖绞掉一组对应的横或者竖的外围，另一组保留，再将待测细胞样品与用无钙、镁PBS配制的低熔点琼脂糖凝胶预热；所述预热的温度可为37°C。
3.如权利要求1所述细胞DNA损伤检测方法，其特征在于在步骤I)中，所述取混合液铺在24孔细胞培养板板盖样品孔中是取50~80 μ L混合液铺在24孔细胞培养板板盖样品孔中；所述使胶平展铺开可采用枪头辅助推胶使胶平展铺开；所述冷却的条件可为4°C下冷却3~5min ;所述低熔点琼脂糖凝胶的质量分数为0.4%~0.6%,所述待测样品细胞密度为8~IOX IO5个/mL，细胞悬液与低熔点琼脂糖凝胶的体积比为1: 3~5。
4.如权利要求1所述细胞DNA损伤检测方法，其特征在于在步骤2)中，所述将铺有单层胶的24孔细胞培养板板盖浸入细胞裂解液中裂解是将铺有单层胶的24孔细胞培养板板盖浸入4°C的细胞裂解液中避光裂解1.5~2h。
5.如权利要求1所述细胞DNA损伤检测方法，其特征在于在步骤2)中，所述细胞裂解液的组成为 100mmol/L Na2EDTA, 2.5mol/L NaCl、10mmol/L Tris-HCl 缓冲液，pH= IO ;临用前加Triton X-100至体积分数1%，同时加DMSO至体积分数10%。
6.如权利要求1所述细胞DNA损伤检测方法，其特征在于在步骤3)中，所述静置是在4°C避光静置15~25min ;所述解旋液的组成可为lmmol/L Na2EDTA, 300mmol/L NaOH,pH>13。
7.如权利要求1所述细胞DNA损伤检测方法，其特征在于在步骤4)中，所述电泳液为TAE, 50 X TAE 配制方法为 242g Tris_base、37.2g Na2EDTA.2H20，加入 57.1mL 的冰乙酸充分溶解，用NaOH溶液调节pH值为8.3，Milli_Q水定容至1L，室温保存，使用前将其稀释50倍并置于4°C冷藏2h以上；所述电泳的条件可为:电泳的电压为15~25V，恒压，电泳的时间为10~30min。
8.如权利要求1所述细胞DNA损伤检测方法，其特征在于在步骤5)中，所述浸泡是浸泡5~IOmin,重复2~3次。
9.如权利要求1所述细胞DNA损伤检测方法，其特征在于在步骤6)中，所述静置浸泡的时间为10~15min。
10.如权利要求1所述细胞DNA损伤检测方法，其特征在于在步骤7)中，所述静置的时间为2~3min ;所述溴化乙啶的浓度可为1μ g/mL，所述避光染色的时间可为10~15min。
【文档编号】G01N27/447GK103760137SQ201410011218
【公开日】2014年4月30日 申请日期:2014年1月10日 优先权日:2014年1月10日
【发明者】韩大雄, 肖丹, 王海燕 申请人:厦门大学