用于植入前因子的新型检测方法以及植入前因子肽的制作方法
【专利摘要】本发明涉及用于检测PIF存在与否的分析方法，以及通过此方法鉴定出来的PIF肽。具体地说，本发明涉及用于检测PIF的流式细胞术检测方法。它至少部分地基于如下观察结果：利用了荧光标记的抗淋巴细胞和抗血小板的抗体的流式细胞术表明，在PIF存在下，玫瑰花结的形成增加。它还基于如下观察结果：流式细胞术表明，在PIF存在下，与CD2结合的单克隆抗体减少了。本发明还涉及PIF肽，当PIF肽被加入到Jurkat细胞培养物中时，能够观察到它可以：或者(i)减少抗CD2抗体与Jurkat细胞的结合；或者(ii)增加Jurkat细胞中CD2的表达；或者(iii)减小Jurkat细胞的可存活性。在另外的实施方案中，本发明提供了ELISA检测方法，可以通过确定待测样品对抗CD2抗体与CD2底物相结合的效果而检测PIF。
【专利说明】用于植入前因子的新型检测方法以及植入前因子肽
[0001]本申请是针对2002年6月28日递交的申请号为201210307132.X、发明名称为“用于植入前因子的新型检测方法以及植入前因子肽”的分案申请。
[0002]上述分案申请是针对2002年6月28日递交的申请号为201110025233.3、发明名称为“用于植入前因子的新型检测方法以及植入前因子肽”的分案申请。
[0003]上述分案申请是针对2002年6月28日递交的申请号为200710086405.1、发明名称为“用于植入前因子的新型检测方法以及植入前因子肽”的分案申请。
[0004]上述分案申请是针对2002年6月28日递交的申请号为02813319.6、发明名称为“用于植入前因子的新型检测方法以及植入前因子肽”的分案申请。
1.【技术领域】
[0005]本发明涉及植入前因子(preimplantation factor,以下简称为PIF),它是受孕和胚胎可存活性(embryo viability)的早期标志物。本发明还涉及检测PIF活性的新方法，以及PIF肽。
2.【背景技术】 [0006]不育是困扰世界上数百万对夫妇的重要健康问题。人类孕体的早期死亡是一个常见现象，而这也是造成不育的一方面因素。在自然的单个胎儿(single conceptions)中，约有73%都在妊娠的第6周之前死亡(Boklage CE.，从受孕至足月生产之间人类胎儿的存活概率.国际生育学杂志(Int J Fertil) 1990 ；35:75)。这主要是由于在植入之前或植入后的很短时间内所发生的早期胚胎死亡。大龄妇女的生育率较低，而由年轻妇女捐献卵母细胞后生育率提高，与上述现象相关的数据表明:对于获得成功的妊娠而言，卵母细胞的质量很重要(Navot D, Bergh PA, Williams MA等,较差的卵母细胞质量而不是植入失败引起了与年龄相关的雌性生育力的下降，柳叶刀(Lancet) 1991 ；337:1375)。
[0007]体外受精(in vitro fertilization,以下简称为“ IVF”)技术已经被发展起来，用于解决不育的问题。但是，在体外培养用于植入的胚胎时的人工条件下，维持胚胎的可存活性甚至更困难一些。在体外，胚胎的生长速度要比在体内时慢，通常只有25-65%的胚胎能够发育到囊胚阶段(在Gomel V，Leung PCK，编的“体外受精和辅助生殖”(In vitrofertilization and assisted reproduction)第 10 届世界大会(Procc 10th WorldCongress), 1997:1 中的 Gardner DK, Lane M, KOuridakis K, Schoolvcraft WB.，基于生理学复合体的无血清培养基增强哺乳动物胚胎发育(Complex physiologically basedserum-free culture media increase mammalian embryo development))现有技术尚不倉泛鉴别出那些可能植入和存活的胚胎。人绒毛膜促性腺激素(hCG)是目前正在使用的用于体内受精和早期胚胎植入的标志物，但是，它只有在植入后的几天才能被检测到。由于缺乏胚胎可存活性的适当标志物，因此，目前很多不能植入的胚胎都被转移了，从而降低了获得成功妊娠的机会。
[0008]为了解决胚胎可能无法存活的问题，更多数量的胚胎被同时转移到了未来母亲的体内。大量胚胎的转移可能导致多次怀孕(multiple pregnancies),这是固有的危险,但如果只转移少量胚胎，又可能有没有一个胚胎能植入的风险，从而失去一整个IVF周期。很明显，需要改进对胚胎的选择，并定义准确的标志物以确定胚胎的可存活性。此外，使用非侵入性方法，通过在培养基中检测对可存活的、能植入的胚胎特异的产物，将使得人们可以选择出那些最有可能产生成功妊娠的胚胎，而不会对胚胎产生伤害。
[0009]决定妊娠成功与否的另一个因素是孕体与母体免疫系统之间的相互作用。在受精后的很短时间内，应该发生妊娠的系统母体识别(a systemic maternal recognition ofpregnancy)。由特异性早期胚胎信号所激发的母体免疫系统调节，可能是该过程中的关键。一旦卵母细胞被受精，合子直到孵化中的囊胚(hatching blastocyst)都被透明带(thezone pellucida)所包围，透明带是坚硬的半透明的膜。因此，当胚胎还在输卵管和子宫腔内发育时，胚胎-母体之间的交流(communication)就已经通过胚胎所分泌的化合物而同时发生了。
[0010]已经表明，以孕妇的血清和可存活胚胎为条件的培养基，可以提高血小板和T淋巴细胞在⑶2抗体存在下形成玫瑰花结的量。正如在1997年7月8日授权的Barnea等人的美国专利5，646，003以及1999年11月9日授权的Barnea等人的美国专利5，981，198中已经公开的那样，植入前因子(PIF)的存在可以通过将淋巴细胞、血小板、来自怀孕受试者的热失活的血清、豚鼠补体以及Tll (抗CD2)单克隆抗体(Dakko，丹麦)混合在一起而检测出来，其中，怀孕受试者的PIF提高了血小板和淋巴细胞之间形成的玫瑰花结的量。已经发现，PIF(i)由二细胞期前的可存活的早期人和小鼠胚胎所分泌；在IVF之后，在胚胎转移后的3-4天，可以在外周循环中检测到；(iii)与73%的带回家的婴儿有关，而在早期PIF阴性结果中则为3%; (iv)在子宫内受孕后5-6天可以检测出来；(V)在未怀孕的血清或不可存活的胚胎中不存在；以及(vi)除了人之外，还存在于多种怀孕的哺乳动物中，包括小鼠、马、奶牛和猪。此外，如果发`生自然流产，在hCG分泌减少前的两周，就已经观察到了 PIF从循环系统中的消失。
[0011]在上述PIF检测中所使用的单克隆抗体，其靶标是被称为CD2的淋巴细胞相关抗原。⑶2存在于约80-90%的人外周血淋巴细胞上，以及超过95%的胸腺细胞、所有形成红细胞玫瑰花结的T淋巴细胞以及NK细胞的一个亚型上。⑶2在T细胞活化中的各种作用已经被提出，包括作为粘附分子以减小T细胞活化所需抗原的量，以及作为T细胞活化的共同刺激分子(costimulatory molecule)分子或直接促进剂。而且，已经暗示，⑶2在诱导免疫无能、细胞因子生产的调节以及T细胞正选择的调控中起作用。
[0012]⑶2的天然配基是结构相关的IgSF CAMs⑶58 (LFA-3)，一种组织分布较广的细胞表面粘附配基。此外，⑶2可以与⑶48、⑶59以及⑶15 (Lewis x)相关的糖结构发生相互作用。CD2以很低的亲和力与CD58结合，而解离常数却非常大。CD2及其配基CD58的侧向再分布也影响了细胞粘附的强度。CD2粘附性的调控影响了 CD2增强抗原敏感度的能力。不能进行亲和力调控的CD2细胞系在抗原特异性应答上表现出了明显的不足。CD2亲和力提高所产生的粘附力，直接为T细胞敏感度做出了贡献，而后者与CD2介导的信号转导无关。
3.
【发明内容】
[0013]本发明涉及用于检测PIF存在与否的分析方法，以及通过此方法鉴定出来的PIF肽。具体地说，本发明涉及用于检测PIF的流式细胞术检测方法。它至少部分地基于如下观察结果:利用了荧光标记的抗淋巴细胞和抗血小板的抗体的流式细胞术表明，在PIF存在下，玫瑰花结的形成增加。它还基于如下观察结果:流式细胞术表明，在PIF存在下，与CD2结合的单克隆抗体减少了。
[0014]本发明还涉及PIF肽，当PIF肽被加入到Jurkat细胞培养物中时，能够观察到它可以:或者Q)减少抗CD2抗体与Jurkat细胞的结合；(ii)增加Jurkat细胞中CD2的表达；或者(iii)降低Jurkat细胞的可存活性。在另外的实施方案中，本发明提供了 ELISA检测方法，可以通过确定待测样品对抗CD2抗体与CD2底物相结合的效果而检测PIF。
4.【专利附图】
【附图说明】 [0015]图1A-B.由小鼠胚胎培养物条件培养基(MECCM)的PIF纯化；(A)示出了MECCM-3kDA超滤液的高效液相色谱(HPLC)的谱图，所述超滤液先前已通过MabCD2亲和层析进行了纯化；(B)示出了在对(A)中得到的PIF活性级分进行进一步HPLC纯化后的谱图。
[0016]图2A-C.从MECCM纯化得到的不同PIF肽的Western印迹分析；Mab⑶2被用作一抗，反意(ant1-sense)小鼠马辣根过氧化物酶(HRP)-生物素链霉亲和素复合体被用作二抗。通过ECL检测试剂(Amersham Pharmacia Biotech)鉴定特异性PIF带。
[0017]图3A-B.(A)示出了在新鲜的培养基(CM)、小鼠胚胎培养物条件培养基(MECCM)和MabCD2的存在下，淋巴细胞-血小板玫瑰花结形成(L-P)的流式细胞仪测定。L(MaW:D45-PE)和P(Mab⑶42a_FITC)的荧光标记的特异抗体被用于检测L-P复合物。与培养基(CM)相比，MECCM的L-P形成要高30-40%。(B)示出了 MECCM对MabCD2与Jurkat细胞(JC)相结合的作用的FC。JC与样品一起进行温育，并进一步与Mab⑶2 Cy5 一起进行温育。与⑶2结合的抗体被存在于MECCM中的PIF所降低。箭头指出了 PIF活性。
[0018]图4A-C.从MECCM纯化得到的PIF肽的质谱谱图。通过超滤、渗滤、HPLC, Mab⑶2亲和层析以及进一步的HPLC而从MECCM纯化得到的PIF活性级分的分子量(MW)通过质谱测定。PIF 肽的 MW 为 A)610-9%Da ;B) 963_1848Da ;以及 C) 1807_1846Da。
[0019]图5A-F.PIF对在Jurkat细胞中的MabCD2结合(A)、荧光(B)和可存活性(C)的阴性作用以及PIF对MabCD2结合⑶、突光(E)和可存活性(F)的阳性作用的流式细胞术分析。在阳性样品中，PIF与CD2竞争(箭头指出了 PIF活性)。
[0020]图6.合成的PIF肽对Jurkat细胞CD2表达的影响。
5.【具体实施方式】
[0021]在第一组实施方案中，本发明提供了一种用于确定样品中是否存在植入前因子的方法，该方法包括检测样品中是否含有抑制抗CD2抗体与CD2抗原相结合的成分的步骤；其中，抑制抗CD2抗体与CD2相结合的能力与植入前因子的存在之间具有正相关性。
[0022]例如，此类方法可以用于流式细胞术或者酶联免疫吸附测定方法之中，使用本领域公知的其他技术。在下面的第7部分中，介绍了用于检测抗CD2抗体与CD2相结合的流式细胞术方法的一个非限制性实例。
[0023]此处所使用的术语抗CD2抗体，可以是与CD2特异性结合的单克隆或多克隆抗体。Pharmigen就出售一种此类的单克隆抗体(见下文)。[0024]⑶2抗原可以是纯化⑶2抗原的形式，也可以由细胞所携带。在本发明的一个非限制性实施方案中，所述细胞为Jurkat细胞。表达CD2的其他细胞系在本领域中是公知的。
[0025]样品可以是血清样品(例如，来自有待检测受精/植入/胚胎存留的受试者的血清)，可以是培养液样品(例如，为在IVF转移前确定胚胎的可存活性)，也可以是有待检测PIF肽是否存在的溶液(例如，在PIF作用剂的纯化中；参见下面的第6部分)。
[0026]受试者可以是人类受试者(例如疑为已受孕的人)或非人类受试者(例如农业动物或动物园的动物)。
[0027]在第二组实施方案中，本发明提供了一种用于确定样品中是否存在植入前因子的方法，包括通过流式细胞术检测样品中是否含有能增加淋巴细胞、血小板和抗⑶2抗体之间形成的玫瑰花结的成分的步骤，其中，玫瑰花结形成量的增加与植入前因子的存在之间具有正相关性。例如，此类检测可以通过使用荧光标记的以淋巴细胞和血小板为靶标的抗体而进行，其中，最好对抗血小板和抗淋巴细胞的抗体使用不同的标记。
[0028]所述的增加是相对于已知的阴性对照而言的。
[0029]本发明也提供了下列分离的肽:
[0030](I) 一种分离的肽，具有选自由如下成员所构成的组的序列=Met-Val-Arg-1le-Lys-Pro-Gly-Ser-Ala ；Met-Val-Arg-1Ie-Lys-Pro-Gly-Ser-Ala-Asn-Lys-Phe-Ser ;Met_Va1-Arg-1 Ie-Lys-Pro-Gly-Ser-Ala-Asn-Lys-Phe-Ser-Asp ； Lii1^Met-Val-Arg-1le-Lys-Pro-Gly-Ser-Ala-Asn-Lys-Phe-Ser-Asp-Asp,或者一种包含所述肽的分离的肽,能够与抗⑶2抗体相结合并且不是环子孢子蛋白(circumsporooite protein)；
[0031](2) 一种具有序列` Ser-Gly-1le-Val-1le-Tyr-Gln-Tyr-Met-Asp-Asp-Arg-Tyr-Val-Gly-Ser-Asp-Leu的分离的肽，或者一种包含所述肽的分离的肽，能够与抗⑶2抗体相结合并且不是HIV蛋白；
[0032](3) 一种具有序列 Val-1le-1le-1le-Ala-Gln-Tyr-Met-Asp 的分离的妝，或者一种包含所述肽的分离的肽，能够与抗CD2抗体相结合；以及
[0033](4) 一种分离的肽，具有选自由如下成员所构成的组的序列:Ser-Gln-Ala-Val-GIn-Glu-His-Ala-Ser-Thr 以及 Ser-Gln-Ala-Val-Gln-Glu-His-Ala-Ser-Thr-Asn-Xaa-Gly，其中Xaa可以是任何氨基酸，或者一种包含所述肽的分离的肽，能够与抗CD2抗体相结合并且不是人类类维生素A (retinoid)和甲状腺激素的沉默介质(silencing mediator)。
[0034](5) 一种具有序列 Ser-Gln-Ala-Val-Gln-Glu-His-Ala-Ser-Thr-Asn-Met-Gly 的分离的肽。
[0035]6.实施例:PIF肽的鉴定
[0036]通过超滤、冻干、高效液相色谱(HPLC)、亲和层析和western印迹,将PIF从大体积的MECCM中分离出来。二细胞(two-cell-to)囊胚期的小鼠胚胎在含有下列成分的Ham’sF-1O培养基中培养数天:青霉素、链霉素、MgS04、NaHC03、KHC03和乳酸钙，此外还添加0.1%的BSA。使用前，MECCM 一直储存在_80°C。
[0037]将一升MECCM利用Amicon 膜(3kDa截止；YM_3kDa, Amicon.Millipore C0.,美国)通过超滤进行纯化。利用300ml纯水对浓缩的MECCM进行进一步的渗滤。此外，也以同样的方式对新鲜的培养基(CM，不含胚胎)进行处理。只有MECCM-3kDa超滤液和渗滤液表现出了 PIF活性，然后它们被收集起来并通过冻干法浓缩。[0038]已经观察到，PIF能够结合抗⑶2单克隆抗体(Mab⑶2)。因此，首先通过亲和层析将PIF活性部分进行纯化，其中使用了琼脂糖-酰肼_MabCD2活化胶。按下述方法制备抗体亲和基质。通过 Econo-Pac IODG 脱盐柱，将 1.5mg MabCD2 (clone RPA-2.10, Pharmigen,Becton Dickinson)与pH 5.5的偶联缓冲液进行缓冲液交换，并进一步用高碘酸钠氧化，并偶联至2ml的琼脂糖-酰肼活化胶上，可以按照制造商提供的说明进行(Aff1-gelHidrazide免疫亲和试剂盒，BioRad实验室，加州，美国)。然后，利用Mab⑶2亲和层析柱(10x20mm)对MabCD2_3kDa超滤液-渗滤液冻干粉进行进一步纯化。将2g MECCM_3kDa粉末溶于IOml纯水中，将pH调至中性,通过0.22m注射器无菌滤器(Corning Inc.,NY,美国)进行过滤，并在重力流动的情况下通过亲和层析柱5次。所述柱子用5柱床体积的pH 7.2的IOOmM磷酸盐缓冲液冲洗，然后用5柱床体积的0.5M NaCl冲洗。
[0039]结合上的PIF用3ml 0.1M的乙酸洗脱下来。将洗下PIF的级分收集起来，进行PIF活性检测，并通过冻干法浓缩。
[0040]总量为300mg的经亲和层析进一步纯化的MECCM_3kDa超滤液被分为三批，在Clipeus C18 制备性柱(Higgins Analytical, Inc.,美国)上进行 HPLC。制备性 HPLC 的运行参数为:流速，15ml/min。缓冲液:A = 0.1 %三氟乙酸(TFA) ；B = 0.1 % TFA，溶于99.9%乙腈中(CH3CN)。梯度:0% B，5分钟，加上0-60% B30分钟，以及0-100% B3分钟。
[0041]通过蒸发进一步浓缩HPLC的级分。将HPLC浓缩的级分的pH值调至中性，并再次检测PIF活性。几个级分表现出较高的PIF活性(参见图1A)。这些级分通过附加的HPLC，在Vydac C8分析柱(4.6x250mm ;Hesperia，加州，美国)上加以纯化。附加HPLC的运行参数为:流速，lml/min。缓冲液:A = 0.1 %三氟乙酸(TFA) ;B = 0.1 % TFA，溶于99.9%乙腈中(CH3CN)。梯度:0% B，5分钟，加上0-60% B30分钟，以及0-100% B3分钟。几个洗脱级分表现出PIF活性(参见图1B)，并被进一步测序以确定其氨基酸组成，通过质谱确定它们的分子量(MW)。
[0042]由MECCM纯化得到的PIF活性级分在Western印迹(“WB”)中给出了正信号。在WB中，使用CM超滤冻干部分的溶液作为阴性对照。WB的条件如下。对于胶，使用了 SDS-PAGE预装胶(pre-casting gels) (BioRad),具有16.5%琼脂糖分离胶和4%琼脂糖浓缩胶。跑胶的溶液中含有 IOOmM Tris, IOOmM Tricine, 0.1% SDS, pH 8.3 (Tris-Tricine 跑胶缓冲液)。由30微升PIF-MECCM纯化级分和10微升Tricine上样缓冲液[200mMTris (三羟甲基)氨基甲烷(Tris-HCl)pH 6.8，2%十二烷基磺酸钠(SDS)，40%甘油，0.04%考马斯亮蓝(CBB-G250) ] (BioRad)组成的样品，在95°C下温育5分钟。冷却后，将样品加入到SDS聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)的上样孔中。为了确定低分子量(MW)多肽的分子量，将10微升用水按
I: 20稀释的SDS-PAGE标准物(BioRad)加入到每块胶的一个孔中。电泳时，样品和标准物在175v下跑5分钟，然后在60v下跑I小时。
[0043]然后，将获得的胶进行电印迹(electro-blot),使用IOOmM pH为11的CAPS [3-(环己氨基)-1-丙磺酸]缓冲液作为转移缓冲液。电印迹在80mA下进行I小时，转移到0.22 μ m硝酸纤维素膜(BioRad)上。
[0044]然后，利用5%的封闭溶液(Amersham, Pharmacia, Biotech, NJ,美国)在室温下封闭硝酸纤维素膜18小时，然后利用PBS-T[磷酸盐缓冲液-0.05%聚氧乙烯山梨醇酐单月桂酸酯(Tween 20)]冲洗4次，持续20分钟。进行一抗温育时，已封闭的膜于室温下在2μ g/ml的Mab⑶2 (Pharmigen) -PBS-T溶液中温育2小时，然后按上述方法冲洗。进行二抗温育时，膜于室温下在马抗小鼠IgG-辣根过氧化物酶偶联物(I: 1000，溶于PBS-T)溶液中温育I小时。然后，通过ECL-化学荧光系统(Amersham)使PIF带可见。图2示出了从MECCM纯化得到的PIF肽的典型WB。
[0045]用于测定PIF的流式细胞术(FC)被发展起来，提高了美国专利5，646，003和5，981，198中所介绍的方法的效率和重现性。尤其是，采用怀孕和未怀孕的人和猪血清，MECCM，CM以及分离的PIF级分，通过FC对玫瑰花结的形成进行了评估，利用了Mab⑶2或Mab⑶2-Cv5 (Cy-铬偶联的抗体)，Mab⑶45-PE (藻红蛋白偶联的抗体)以及Mab⑶41a-FITC(异硫氰酸荧光素偶联的抗体)，所有的抗体都来自Pharmigen。MECCM与CM相比，其标记的P-L复合体比例要高30-40% (图3A)。而且，已经发现，在检测分析中MECCM或怀孕的血清与固定化Mab⑶2的预温育，阻止了 P-L的形成。在检测分析中，向L-P中加入Mab⑶58 (淋巴细胞功能相关的抗原-3或LFA-3)抗体并不能通过PIF活性样品的作用而完全阻止玫瑰花结的形成。
[0046]发展了一种利用Jurkat细胞(JC)和MabCD2_Cy5的FC-PIF定量检测法(图3B)。使用无限增殖的淋巴细胞系后，就不再需要新鲜的供体血液以通过生物测定法评估PIF活性。已经确认JC-FC检测对于人血清样品(参加表1)而言是有效的，并且在PIF纯化期间被用于评估级分的PIF活性。
[0047]纯化的PIF活性级分的丽通过质谱分析测定，利用产自PerspectiveBiosystems (Cambridge, MA,美国)的 Voyager-RP Biospectrometry MALD1-T0F 工作站。将样品与基质相混合，其中，所述基质存在于乙臆:水为1: 2的混合物中，并含有I %的三氟乙酸。谱图为约200次扫描的平均值。来自MECCM的PIF肽的丽在610-1845Da之间(图 4)。
[0048]此外，已经评估出`了 PIF-活性级分与Mab⑶2的预温育消除了该PIF-活性。这些数据表明，PIF可能是⑶2或同源肽的一部分。然而，在对纯化的PIF肽进行测序之后，证明了这些肽并不是CD2的一部分，而且，它们的氨基酸序列是独特的。
[0049]通过JC-FC检测证明，MEECM-PIF肽对T细胞所表达的⑶2有三种不同的作用。这些作用涉及:减小Mab⑶2与JC的结合；通过JC对⑶2表达进行向上调节(up-regulating);或降低JC的可存活性。
[0050]从小鼠胚胎中得到的纯化PIF活性级分通过Edman降解进行测序，采用AppliedBiosystems脉冲液体测序仪(Pulsed Liquid Sequencer)(型号477A)。用异硫氰酸苯酯对释放出来的氨基酸进行衍生处理，以便得到PTH-氨基酸，PTH-氨基酸可以通过在与测序仪配合的HPLC系统上进行的反向HPLC检测出来。几种PIF级分得到了独一无二的序列。几种肽给出的序列，其N端的九个或十个残基是完全相同的，这表明这些肽是由相同的分子(参见表1I)截短后得到的不同形式。PIF肽被确定为至少三个独特的家族，为来源于胚胎的或妊娠相关的小肽。包括三种PIF肽的一个家族的氨基酸序列与环子孢子蛋白(Circumsporozoite protein) (_原虫:恶性痕原虫(Plasmodium falciparum))的一个区域100%匹配。PIF肽的这一家族通过JC向上调节⑶2的表达。一种与上述PIF肽家族只有前五个氨基酸残基相同的PIF肽(14个氨基酸)，以及另一种与HIV-1RNA指导的DNA聚合酶(逆转录酶，EC 2.7.7.49)序列有11个氨基酸匹配的PIF肽(18个氨基酸)，也可以通过JC向上调节CD2的表达。此外，另一个包括两个PIF肽(9个和13个氨基酸)的家族与人受体作用因子(receptor-1nteracting factor)的序列有10个氨基酸匹配,后者为类维生素A和甲状腺激素的沉默介质(a silencing mediator for retinoid and thyroidhormone receptor, SMRT) (Chen and Evans, 1995)。该 PIF 肽家族的更短的成员表现出了对MabCD2与JC结合的竞争作用，而且更长的PIF肽降低了 JC的可存活性。值得注意的是，由核受体介导的转录沉默在发育、分化和肿瘤形成中很重要。
[0051]PIF肽通过固相肽合成(SPPS)法进行合成,使用Applied Biosystems肽合成仪，采用Fmoc (9-芴甲氧羰基)化学法，其中每个氨基酸的氨基氮都被Fmoc所封闭。偶联时，利用 3mol/ml 的 2_(1H_苯并三唑-1-基)-1,1,3, 3-tetrametyluronium 四氟硼酸酯/1-轻基苯并三唑，在二异丙基乙胺存在下，将N端已被保护起来的氨基酸的羧基活化。然后，将活化的氨基酸顺序地加入到新生的肽上。在合成完成后，通过反向HPLC进行最后的纯化，并通过MALD1-T0F质谱和氨基酸分析对其加以确认。PIF合成肽在Jurkat细胞的⑶2现象中表现出相似的作用(图6)，也可以被Mab CD2免疫检测到。
[0052]7.用于PIF的流式细胞术
[0053]7.1 材料
[0054]材料包括Jurkat白血病细胞(JC);克隆培养基；用于流式细胞仪测量的Falcon管；Mab CD2_Cy5 (Cy-络偶联的抗体，clone RPA-2.10, Pharmigen, Becton Dickinson)；生物样品(可以是有待检测PIF活性的人血清，也可以是假定的或合成的PIF肽的溶液)；PBS-2% BSA(IOOmM磷酸盐缓冲液-2%牛血清清蛋白；阴性对照)；台盼蓝染液；CO2细胞培养箱；流式细胞仪。
[0055]7.2 方法
[0056]制备JC悬液:
[0057]利用台盼蓝排阻染色法检测JC培养物的可存活性。细胞的可存活性应该在80-90%之间。
[0058]用 IOml PBS-2% BSA 冲洗 JC 两次。
[0059]在克隆培养基或PBS-2% BSA中制备JC悬液，含有5，000, 000细胞/毫升。
[0060]将50mlJC悬液分散到falcon管中(250，000细胞/管)。
[0061]样品温育:
[0062]加入200μ I样品，来自早期妊娠对照的血清(3个阳性对照)或PBS_2%BSA(阴性对照)。轻轻混合。
[0063]室温下温育20-30分钟。
[0064]加入 200 μ I 在 PBS-2% BSA 中以 I: 200 稀释的 MabCD2_Cy5。轻轻混合。
[0065]室温下温育20-30分钟。
[0066]流式细胞仪测定:
[0067]测定每个管子的荧光(488nm激光激发波长)。
[0068]将活的和全部细胞与全部死细胞的荧光(参见图5)与对照进行比较。按下述方法计算PIF活性:
[0070]全部细胞的荧光/%死细胞X活细胞的荧光
[0071]结果的解释:[0072]PIF阴性的活性应该在130-340之间；
[0073]PIF阳性样品在阴性参考范围之外。
[0074]本文中引用了多篇参考文献，在此以引用的方式将其全部内容包括在本文中。
[0075]表1 37名患者血清中流式细胞术PIF检测的临床有效性的确认
【权利要求】
1.一种具有序列
Ser-Gly-1le-Val-1le-Tyr-Gln-Tyr-Met-Asp-Asp-Arg-Tyr-Val-Gly-Ser-Asp-Leu 的分离的 肽。
【文档编号】G01N33/68GK103755787SQ201310654136
【公开日】2014年4月30日 申请日期:2002年6月28日 优先权日:2001年7月2日
【发明者】艾坦·巴尼, 鲁宾·雷内·冈萨雷斯·佩雷斯, 保罗·C·利维斯 申请人:倍奥英赛普特有限责任公司