专利名称：基于炎症因子的肝癌患者术后转移复发多分子预测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种基于炎症因子的肝癌患者术后转移复发多分子预测试剂盒，属于生物 技术领域。
背景技术：
肝癌是我国第二位癌症死因，手术是目前主要的治疗手段。然而术后高转移复发率(5 年复发率达70%，小肝癌也达50%)己成为进一步提高远期疗效的瓶颈，也是攻克肝癌的 重要关键。若能对肝癌根治术后的特定人群进行早期转移复发的预测，及时给予干预治疗， 做到早发现早治疗，会进一步提高根治性术后复发患者的生存率，也会有很大的社会效益 和经济效益。
近年来癌周微环境在肿瘤发生及进展中的作用成为肿瘤研究的热点。许多研究也显示 Thl/Th2免疫的失衡与多种肿瘤相关。我们前期的研究工作已证实癌周微环境的炎症免疫 反应状态与原发性肝癌患者术后转移复发密切相关，可较准确预测转移复发。而目前临床 尚无足够敏感和特异的预测指标来预测肝癌术后患者的转移复发以及生存情况，甲胎蛋 白、肿瘤大小，包膜有无等虽与转移复发有关但总体来说其预测准确率还很低，尤其对早 期肝癌的术后复发更无法预测。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于炎症因子的肝癌患者术后转移复发多分子预测试剂盒。
为了达到上述目的，本发明的技术方案是提供基于炎症因子的肝癌患者术后转移复发 多分子预测试剂盒，其特征在于，由包被试剂、洗液、辣根过氧化物酶标记的抗体、底物 液、终止液和预测参考值组成；
其中包被试剂由pH9. 6碳酸盐包被缓冲液以及白细胞介素2抗体、白细胞介素15抗 体或白细胞介素5抗体组成；
洗液是pH7.4磷酸盐缓冲液；
辣根过氧化物酶标记的抗体由辣根过氧化物酶标记的白细胞介素2抗体、辣根过氧化 物酶标记的白细胞介素15抗体和辣根过氧化物酶标记的白细胞介素5抗体组成； 底物液是四甲基联苯胺底物溶液或ABTS底物溶液； 终止液是1.8-2. 1M硫酸；
预测参考值以肝癌癌周组织抽提物蛋白浓度为4ug/ul为准白细胞介素2是20 —30pg/ml、白细胞介素15是32 — 43pg/ml，白细胞介素5是18_28pg/ml，不同加样浓度， 预测参考值成比例变化。
所述碳酸盐包被缓冲液是将碳酸钠1. 59g和碳酸氢钠2. 93g溶解于1000ml蒸馏水中 制成。
所述的磷酸盐缓冲液是将0. 2g 0. 15M的磷酸二氢钾溶液，2. 9g十二水合磷酸氢二钠， 8. 0g氯化钠，0. 2g氯化钾，0. 5ml吐温-20加到1000ml蒸馏水中制成。 本发明具有以下优点
1. 癌周肝组织中白细胞介素2、白细胞介素15和白细胞介素5能较准确地预测肝癌患 者术后的转移复发，在133例早期肝癌患者中准确率分别为69.2%、 61.7%、 61.7%,白细 胞介素2还可以预测肝癌患者术后的生存或死亡，准确率为72. 9%。
2. 白细胞介素2、白细胞介素15和白细胞介素5明显优于目前用于预测肝癌患者术 后复发和生存的临床指标，如甲胎蛋白、肿瘤大小，包膜有无等，尤其对早期肝癌术后转 移复发的预测有明显的价值和意义。而且测定这些白细胞介素简单易行且对患者无创伤性
(使用的是肝癌患者术中切除下来的肝组织)。
图l为聚苯乙烯板示意图2为白细胞介素2、白细胞介素15和白细胞介素5对肝癌患者术后的转移复发的预 测情况图3为白细胞介素2的无瘤生存曲线；
图4为白细胞介素2的总生存曲线；
图5为白细胞介素15的无瘤生存曲线；
图6为白细胞介素5的无瘤生存曲线。
具体实施例方式
下面结合具体实施例来说明本发明。
实施例l
一种可预测原发性肝癌病人手术后肝癌转移复发的试剂盒，由包被试剂、洗液、辣 根过氧化物酶标记的抗体、底物液、终止液和预测参考值组成；
其中包被试剂由pH9. 6碳酸盐包被缓冲液以及白细胞介素2抗体、白细胞介素15抗 体或白细胞介素5抗体组成；
洗液是pH7. 4磷酸盐缓冲液；辣根过氧化物酶标记的抗体由辣根过氧化物酶标记的白细胞介素2抗体、辣根过氧化 物酶标记的白细胞介素15抗体和辣根过氧化物酶标记的白细胞介素5抗体组成； 底物液是四甲基联苯胺底物溶液； 终止液是1.8M硫酸;
预测参考值以肝癌癌周组织抽提物蛋白浓度为4ug/ul为准白细胞介素2是20— 30pg/ml、白细胞介素15是32 — 43pg/ml，白细胞介素5是18—28pg/ml，不同加样浓度， 预测参考值成比例变化。
所述碳酸盐包被缓冲液是将碳酸钠1. 59g和碳酸氢钠2. 93g溶解于1000ml蒸馏水中 制成。
所述的磷酸盐缓冲液是将0. 2g 0. 15M的磷酸二氢钾溶液，2. 9g十二水合磷酸氢二钠， 8. 0g氯化钠，0. 2g氯化钾，0. 5ml吐温_20加到1000ml蒸馏水中制成。
使用本试剂盒来预测原发性肝癌病人手术后肝癌转移复发的具体步骤为
第一步包被用碳酸盐包被缓冲液分别将白细胞介素2、白细胞介素15和白细胞介
素5抗体稀释至蛋白质含量为5ug/ml，如图l所示在聚苯乙烯板中的第l、 2、 3列反应 孔中分别加入白细胞介素2、白细胞介素15抗体、白细胞介素5抗体稀释液，在第4、 5、 6列加入白细胞介素2抗体稀释液，在第7、 8、 9列加入白细胞介素15抗体稀释液，在第 10、 11、 12列加入白细胞介素5抗体稀释液，每个反应孔中加0. lml， 4'C过夜。次日， 弃去孔内溶液，用磷酸盐缓冲液洗3次，每次3分钟。
第二步加样加4ug/ul的待检癌周肝组织抽提物0.1ml于上述已包被之反应孔中， 置37"C孵育1小时。然后用磷酸盐缓冲液洗2次。同时将第l、 2、 3列反应孔分别做白细 胞介素2、白细胞介素15、白细胞介素5的系列稀释标准品孔。
第三步加辣根过氧化物酶标记的抗体于各反应孔中，加入对应的新鲜稀释的辣根
过氧化物酶标记抗体(经滴定后的稀释度)O. lml。 37E孵育l小时，同上法洗涤。
第四步加底物液显色于各反应孔中加入四甲基联苯胺(TMB)底物溶液O. lml， 37 °C20分钟。
第五步终止反应于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。
第六步测各孔吸光度值在ELISA检测仪上，于450nm (若以ABTS显色，则410nm) 处，以空白对照孔调零后测各孔吸光度值，根据标准品检测结果绘制标准曲线，计算出待 检样本白细胞介素2、白细胞介素15和白细胞介素5浓度。
第七步应用于预测试剂盒检测出的白细胞介素2、白细胞介素15和白细胞介素5的浓度，用于预测肝癌患者术后的转移复发和肝癌患者术后的生存或死亡，当白细胞介素 2浓度低于25. 76pg/ml (加样浓度为4ug/ul时)，白细胞介素15浓度低于37. 16pg/ml (加样浓度为4ug/ul时)，或白细胞介素5浓度低于23. 173 pg/ml (加样浓度为4ug/ul 时)，判断肝癌患者术后易转移复发，当白细胞介素2浓度低于25.76pg/ml (加样浓度为 4ug/ul时)，判断肝癌患者术后易死亡。
实施例2
一种可预测原发性肝癌病人手术后肝癌转移复发的试剂盒，由包被试剂、洗液、辣根 过氧化物酶标记的抗体、底物液、终止液和预测参考值组成；
其中包被试剂由pH9. 6碳酸盐包被缓冲液以及白细胞介素2抗体、白细胞介素15抗 体或白细胞介素5抗体组成；
洗液是pH7.4磷酸盐缓冲液；
辣根过氧化物酶标记的抗体由辣根过氧化物酶标记的白细胞介素2抗体、辣根过氧化 物酶标记的白细胞介素15抗体和辣根过氧化物酶标记的白细胞介素5抗体组成； 底物液是ABTS底物溶液； 终止液是2. 1M硫酸；
预测参考值以肝癌癌周组织抽提物蛋白浓度为4ug/ul为准白细胞介素2是20 — 30pg/ml、白细胞介素15是32 — 43pg/ml为分类标准，白细胞介素5是18 — 28pg/ml，不 同加样浓度，预测参考值成比例变化。
所述碳酸盐包被缓冲液是将碳酸钠1. 59g和碳酸氢钠2. 93g溶解于1000ml蒸馏水中 制成。
所述的磷酸盐缓冲液是将0. 2g 0. 15M的磷酸二氢钾溶液，2. 9g十二水合磷酸氢二钠， 8. 0g氯化钠，0.2g氯化钾，0. 5ml 吐温-20加到1000ml蒸馏水中制成。 使用本试剂盒来预测原发性肝癌病人手术后肝癌转移复发的具体步骤为-
第一步包被用碳酸盐包被缓冲液分别将白细胞介素2、白细胞介素15和白细胞介
素5抗体稀释至蛋白质含量为5yg/ml，如图l所示在聚苯乙烯板中的第l、 2、 3列反应 孔中分别加入白细胞介素2、白细胞介素15抗体、白细胞介素5抗体稀释液，在第4、 5、 6列加入白细胞介素2抗体稀释液，在第7、 8、 9列加入白细胞介素15抗体稀释液，在第 10、 11、 12列加入白细胞介素5抗体稀释液，每个反应孔中加0. lml， 4。C过夜。次日， 弃去孔内溶液，用磷酸盐缓冲液洗3次，每次3分钟。
第二步加样加4ug/ul的待检癌周肝组织抽提物0. lml于上述已包被之反应孔中，置37t:孵育l小时。然后用磷酸盐缓冲液洗2次。同时将第l、 2、 3列反应孔分别做白细 胞介素2、白细胞介素15、白细胞介素5的系列稀释标准品孔。第三步加辣根过氧化物
酶标记的抗体于各反应孔中，加入对应的新鲜稀释的辣根过氧化物酶标记抗体(经滴定
后的稀释度)O. lml。 37。C孵育l小时，同上法洗涤。
第四步加底物液显色于各反应孔中加入或ABTS底物溶液O. lml， 37。C20分钟。 第五步终止反应于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。
第六步测各孔吸光度值在ELISA检测仪上，于450nm (若以ABTS显色，则410nm) 处，以空白对照孔调零后测各孔吸光度值，根据标准品检测结果绘制标准曲线，计算出待 检样本白细胞介素2、白细胞介素15和白细胞介素5浓度。
第七步应用于预测试剂盒检测出的白细胞介素2、白细胞介素15和白细胞介素5 的浓度，用于预测肝癌患者术后的转移复发和肝癌患者术后的生存或死亡，当白细胞介素 2浓度低于25. 76pg/ml (加样浓度为4ug/ul时)，白细胞介素15浓度低于37. 16pg/ml (加样浓度为4ug/ul时)，或白细胞介素5浓度低于23. 173 pg/ml (加样浓度为4ug/ul 时)，判断肝癌患者术后易转移复发，当白细胞介素2浓度低于25.76pg/ml (加样浓度为 4ug/ul时)，判断肝癌患者术后易死亡。
用实施例1-2中试剂盒在133例早期原发性肝癌患者中的检测结果显示
1. 如图2所示，其中a代表白细胞介素2， b代表白细胞介素15， c代表白细胞介素 5，受试者工作特征曲线显示白细胞介素2、白细胞介素15和白细胞介素5可以预测肝癌 患者术后的转移复发。它们曲线下的面积分别是0.627、 0.633、 0.602， P值分别为0.013、 0.009、 0.046。
2. Kaplan-Meier生存和复发分析显示当加样浓度(即肝癌癌周组织抽提物蛋白浓 度)为4ug/ul时，IL-2以25.76pg/ml为分类标准，IL-15以37. 16pg/ml为分类标准，IL-5 以23. 173 pg/ml为分类标准，如图3所示，其中，a代表白细胞介素2低组，b代表白细胞介 素2高组，低水平IL-2比高水平IL-2病人复发率明显升高(/7 = 3.48E-8)、如图4所示，其 中，a代表白细胞介素2低组，b代表白细胞介素2高组，生存期明显更短(p = 0.02);如图 5所示，其中，a代表白细胞介素15低组，b代表白细胞介素15高组，低水平IL-15比高水平 IL-15病人明显复发率升高(^0.004);如图6所示，其中，a代表白细胞介素5低组，b代 表白细胞介素5高组，低水平IL-5比高水平IL-5病人明显复发率升高(；H).02)。
3. 当加样浓度(即肝癌癌周组织抽提物蛋白浓度)为4ug/ul时，IL-2以25.76pg/ml 为参考值,低于25. 76pg/ml预测为转移复发，高于25. 76pg/ml预测为不转移复发，IL-2预测转移复发准确率69. 2%.以同样参考值IL-2预测生存准确率72. 9%. IL-15以37. 16pg/ml为参 考值，低于37. 16pg/ml预测为转移复发，高于37. 16pg/ml预测为不转移复发，IL-15预测转 移复发准确率61. 7%. IL-5以23. 173 pg/ml为为参考值,低于23. 173 pg/ml预测为转移复发， 高于23. 173 pg/ml预测为不转移复发，比-5预测转移复发准确率也为61.7%。
权利要求
1. 一种基于炎症因子的肝癌患者术后转移复发多分子预测试剂盒，其特征在于，由包被试剂、洗液、第一抗体、辣根过氧化物酶标记的抗体、底物液、终止液和预测参考值组成；其中包被试剂由pH9.6碳酸盐包被缓冲液以及白细胞介素2抗体、白细胞介素15抗体或白细胞介素5抗体组成；洗液是pH7. 4磷酸盐缓冲液；辣根过氧化物酶标记的抗体由辣根过氧化物酶标记的白细胞介素2抗体、辣根过氧化物酶标记的白细胞介素15抗体和辣根过氧化物酶标记的白细胞介素5抗体组成；底物液是四甲基联苯胺底物溶液或ABTS底物溶液；终止液是1. 8-2.1M硫酸；预测参考值以肝癌癌周组织抽提物蛋白浓度为4ug/ul为准白细胞介素2是20—30pg/ml、白细胞介素15是32—43pg/ml，白细胞介素5是18—28pg/ml，不同加样浓度，预测参考值成比例变化。
2. 如权利要求1所述的一种基于炎症因子的肝癌患者术后转移复发多分子预测试剂盒， 其特征在于，所述的碳酸盐包被缓冲液是将碳酸钠1. 59g和碳酸氢钠2. 93g溶解于1000ml 蒸馏水中制成。
3. 如权利要求1所述的一种基于炎症因子的肝癌患者术后转移复发多分子预测试剂 盒，其特征在于，所述的磷酸盐缓冲液是将0. 2g 0. 15M的磷酸二氢钾溶液，2. 9g十二水 合磷酸氢二钠，8.0g氯化钠，0.2g氯化钾，0.5ml吐温-20加到1000ml蒸馏水中制成。
全文摘要
本发明提供了基于炎症因子的肝癌患者术后转移复发多分子预测试剂盒，其特征在于，由包被试剂、洗液、辣根过氧化物酶标记的抗体、底物液、终止液和预测参考值组成；其中包被试剂由pH9.6碳酸盐包被缓冲液以及白细胞介素2抗体、白细胞介素15抗体或白细胞介素5抗体组成；预测参考值以肝癌癌周组织抽提物蛋白浓度为4ug/ul为准白细胞介素2是20-30pg/ml、白细胞介素15是32-43pg/ml，白细胞介素5是18-28pg/ml，不同加样浓度，预测参考值成比例变化。本发明采用的癌周肝组织中白细胞介素2、白细胞介素15和白细胞介素5能较准确地预测肝癌患者术后的转移复发。
文档编号G01N33/543GK101441213SQ200810208150
公开日2009年5月27日 申请日期2008年12月29日 优先权日2008年12月29日
发明者周海军, 钦伦秀, 华 黄 申请人:复旦大学附属中山医院