胡椒碱在制备抗细胞焦亡和多脏器损伤药物中的应用
【专利摘要】本发明公开了胡椒碱在制备抗细胞焦亡和多脏器损伤药物中的应用。本发明是基于本发明发明人首先发现胡椒碱具有抗细胞焦亡和多脏器损伤作用所提出的发明创造。本发明发明人发现：胡椒碱可显著抑制细菌感染诱导的细胞焦亡，显著抑制LPS+ATP诱导的促炎症因子IL?1β和危险信号分子HMGB1的释放，并可有效防止细菌感染引起的多脏器损伤。目前临床上尚无可有效防止细菌和真菌感染诱导的细胞焦亡和多脏器损伤的特异性药物。胡椒碱用于制备用于防止因感染而引起细胞焦亡和多脏器损伤药物的应用，对临床治疗败血症等具有重要意义，可用于相关药物开发。
【专利说明】
胡椒碱在制备抗细胞焦亡和多脏器损伤药物中的应用
技术领域
[0001] 本发明属于药物领域，特别涉及胡椒碱在制备抗细胞焦亡和多脏器损伤药物中的 应用。
【背景技术】
[0002] 细胞焦亡是一种炎症激活细胞的程序性死亡方式。具体来说，细菌和真菌等感染， 可造成肝脏等多脏器损伤，导致败血症性休克。多脏器损伤的原因是多方面的。最新的研究 表明，微生物感染以后，人体细胞(包括免疫细胞)借助其模式识别受体，识别病原相关分子 模式(如细菌的LPS)，细胞因此而激活，启动NF-κΒ和炎症小体信号通路，促进pro-IL-Ιβ等 炎症因子(前体）的表达。在ATP等第二信号刺激下，前述被激活的细胞可快速焦亡，这被认 为是多脏器损伤的直接原因之一。焦亡是快速的细胞死亡过程，是造成多脏器损伤和严重 败血症的重要原因。临床上，严重败血症尚无特异性药物可供治疗，死亡率很高。而那些从 败血症中生存下来的患者，由于多脏器受到损伤，其主要脏器功能下降，免疫力差，日后仍 将面临慢性疾病的困扰，包括体弱多病、认知缺陷、预期寿命缩短等。因此，如何防止细胞焦 亡，防止严重败血症过程中的多脏器损伤，具有非常重要的医学意义。
[0003] 胡椒碱(Piperine，本文简称PIP)是从黑胡椒(Piper nigrum)等胡椒科植物中提 取的生物碱，化学名为：（E，E)-1-[5-(l，3-苯并二氧戊环-5-基)-1-氧代-2,4-戊二烯基]-哌啶（分子式为C 17H19N03，分子量为285.34)，可溶于二甲亚砜(DMS0)、乙醇、氯仿等有机溶 剂。其化学结构如下：
[0004]
[0005] 胡椒也是一味重要的中药，入胃大肠经，温中散寒，下气，消痰。主要用于治疗胃肠 不适和癫痫等症，包括胃寒呕吐，腹痛泄泻，食欲不振，癫痫痰多。胡椒碱在治疗结肠炎方面 的用途（见CN103690537A)。
[0006] 胡椒碱对细胞焦亡的影响，目前尚未见诸报道。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供胡椒碱在制备抗细胞焦亡和 多脏器损伤药物中的应用。
[0008] 本发明的目的通过下述技术方案实现:胡椒碱在制备抗细胞焦亡和多脏器损伤药 物中的应用。
[0009] 所述的胡椒碱通过抑制促炎症因子IL-Ιβ和危险信号分子HMGB1的释放进而抑制 细胞焦亡。
[0010] 所述的抗细胞焦亡和多脏器损伤的药物包含可接受的辅料。
[0011] 所述的辅料优选为缓释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、 吸附载体、表面活性剂或润滑剂。
[0012] 所述的抗细胞焦亡和多脏器损伤的药物还包含其他起配伍协同作用的有效成分。
[0013] 所述的抗细胞焦亡和多脏器损伤的药物可以为各种剂型，如片剂、颗粒剂、胶囊、 滴丸、缓释剂、口服液、注射剂等。
[0014] 本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果:本发明是基于本发明发明人首先 发现胡椒碱具有抗细胞焦亡和多脏器损伤作用所提出的发明创造。本发明发明人发现:胡 椒碱可显著抑制细菌感染诱导的细胞焦亡，显著抑制LPS+ATP诱导的促炎症因子IL-Ιβ和危 险信号分子HMGB1的释放，并可有效防止细菌感染引起的多脏器损伤。胡椒碱的上述新的活 性与用途，尚未见公开文献报道。目前临床上尚无可有效防止细菌和真菌感染诱导的细胞 焦亡和多脏器损伤的特异性药物。胡椒碱用于制备用于防止因感染而引起细胞焦亡和多脏 器损伤药物的应用，对临床治疗败血症等具有重要意义，可用于相关药物开发。
【附图说明】
[0015 ]图1是胡椒碱作用于LPS+ATP诱导的小鼠巨噬细胞J774A. 1后的细胞形态显微镜照 片图；其中，BF表示明场状态下的细胞形态;Hoechst显示所有细胞的细胞核;PI是一种细胞 核染料，可进入死亡的细胞，PI染色表示细胞焦亡;Merge表示将Hoechst图和PI图合并。
[0016] 图2是胡椒碱对LPS+ATP诱导的小鼠巨噬细胞J774A. 1细胞焦亡影响的统计结果 图；**，Ρ〈0·01 ;***，Ρ〈0·001。
[0017] 图3是胡椒碱对LPS+ATP诱导的小鼠骨髓来源巨噬细胞(BMDM)细胞焦亡影响的统 计结果图；*#，Ρ〈〇·〇〇1。
[0018] 图4是胡椒碱作用于LPS+ATP诱导的小鼠巨噬细胞J774A. 1后的免疫印迹分析结果 图；A表示上清中HMGB1和pro-caspase-Ι的分泌情况，B表示细胞裂解物中HMGB1、pr〇-caspase-1 和 pro-IL-Ιβ 的表达情况。
[0019]图5是胡椒碱作用于LPS+ATP诱导的小鼠巨噬细胞J774A. 1后上清液中IL-Ιβ的分 泌情况的检测结果图；**，P〈〇. 01。
[0020] 图6是胡椒碱作用于LPS+ATP诱导的小鼠骨髓来源巨噬细胞的免疫印迹分析结果 图;A表示上清中IL-Ιβ和caspase-Ι的分泌情况，B细胞裂解物中pro-IL-Ιβ和pro-caspase-1的表达情况。
[0021] 图7是小鼠经胡椒碱灌胃及细菌感染后肝脏组织切片的显微照片图。
【具体实施方式】
[0022]下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限 于此。
[0023]实施例中所用到的材料：
[0024]胡椒碱（纯度>98%)购自广东省药品检验所；胡椒碱溶于溶剂(体内实验溶于含 2%Tween-80的PBS溶液，体外细胞实验溶于DMS0中）。LPS、ATP、DMS0、Tween-80购自Sigma-Aldrich公司。细胞培养基、胎牛血清等为Gibco公司产品。微量样本多指标流式蛋白定量技 术（cytometric bead array，CBA)检测试剂盒为BD Biosciences公司产品。
[0025] 实施例1
[0026] (1)细胞培养及处理
[0027]小鼠单核巨噬细胞J774A. 1细胞，购自中国科学院上海细胞库，培养于含10 %胎牛 血清和含 l〇〇U/ml 青霉素 (penicillin )、100μg/ml链霉素（streptomycin)的DMEM(完全培养 基）中。待细胞长至对数生长期，种于24孔板中，细胞密度为3 X104/孔(500μ1培养基），培养 24h。然后（换液)加入不同浓度的胡椒碱（1、5、10、20、40、80μπι 〇 1/L)各500μ1，预处理24h。再 加入50μg/ml LPS5yl，使其终浓度为500ng/ml，处理4h激活细胞。最后，细胞培养基换成含 0.1%FCS和5mmol/L ATP的完全培养基，培养基体积为500μ1，ΑΤΡ处理时间为lh。
[0028] (2)焦亡细胞检测及观察
[0029] 经上述处理，细胞发生焦亡。细胞经500μ1终浓度为lμg/ml的碘化丙锭(PI)工作液 染色10min后，细胞核用Hoechst 33342(终浓度lμg/ml)染色显示，在Zeiss荧光显微镜观察 计数，该显微镜配有Zeiss Axio Cam MR R3cooled CCD相机，控制和分析软件为ZEN software(Carl Zeiss MicroImaging GmbH,Gduingen,Germany)〇
[0030] (3)实验结果
[0031] 红色荧光(PI染色）表示该细胞已焦亡。结果如图1、图2所示，胡椒碱(PIP)剂量依 赖性地抑制LPS+ATP诱导的小鼠巨噬细胞J774A.1细胞焦亡；**表示？〈0.01;***表示卩〈 0.001。
[0032] 实施例2
[0033] (1)细胞培养
[0034] L929细胞购自中国科学院昆明动物研究所细胞库。细胞培养方法参照Monack Lab protocol (Stanford)，将1 X 108个细胞培养于底面积为500cm2的三角瓶中，培养基为DMEM完 全培养基，200ml。
[0035] 小鼠骨髓来源的巨噬细胞(BMDM)的培养方法:C57BL/6小鼠，6-8周，雌性，购自南 方医科大学实验动物中心。经颈椎脱白处死后，取其大腿骨，用注射器将骨髓细胞用DMEM培 养基冲出。得到的细胞用BM Mac培养基(80 % DMEM完全培养基+20 % L929细胞培养上清），培 养于细菌培养皿(密度为5 X106/皿，培养基体积为8-10ml)。培养3天，添加10ml新的培养 基;培养第5天，替换为上述新鲜培养基。培养第7天，收集细胞，按常规方法冻存备用。
[0036] (2)细胞焦亡的诱导方法
[0037]上述BMDM细胞，培养于DMEM完全培养基。按实施例1的方法种于24孔板，每孔培养 基体积为500μ1;培养24h后，培养基替换为含不同浓度的胡椒碱(80、160ym〇l/L)的完全培 养基各500μ1，预处理4h，然后加入5μ1的LPS溶液(工作浓度50μg/ml)，使其终浓度为500ng/ ml，处理4h激活细胞。接着将培养基替换为含0.1%FCS和2mmol/L ATP的DMEM培养基(每孔 500μ1)，处理 0.5h。
[0038] (3)细胞焦亡的检测方法：
[0039] 同实施例1。
[0040] (4)实验结果
[0041] 结果如图3所示，胡椒碱(PIP)剂量依赖性地抑制小鼠骨髓来源的巨噬细胞细胞焦 亡;**表示P〈0 · 01; ***表示P〈0 · 001。
[0042] 实施例3
[0043] 小鼠巨噬细胞J774A. 1细胞，用DMEM完全培养基种于直径为6cm的培养皿中，待细 胞进入对数生长期，经含不同浓度胡椒碱(20、40、80μπι 〇 1/L)的DMEM完全培养基(4ml/孔)预 处理24h;再加入40μ1 LPS溶液(工作液浓度50μg/ml，使其终浓度达到500ng/ml)处理4h;最 后将培养基替换为含〇. 1%FCS和4mmol/L ATP的DMEM培养基(4ml)处理lh。细胞经上述处理 后，免疫印迹方法检测其焦亡相关蛋白或信号分子的表达。从图4可知，细胞经LPS+ATP(图 中的第三泳道)处理后，激活caspase-Ι (图A，上清，pro-caspase-Ι加工为caspase-Ι活性形 式），并上调pro-IL-Ιβ的表达;经PIP预处理的细胞，可抑制LPS+ATP上调的caspase-Ι激活 和HMGB1 (细胞死亡时释放到胞外的一种危险信号分子)的释放。
[0044] 实施例4
[0045]细胞处理方法同"实施例3"。由于J774A. 1细胞上清中IL-Ιβ的蛋白水平较低，难以 用免疫印迹方法检测，因此本实验用BD公司的CBA检测试剂盒检测上清中IL-Ιβ的表达水 平。CBA方法检测IL-Ιβ的方法完全按BD公司提供的方法进行。从图5可知，LPS+ATP诱导细胞 焦亡，释放E-Ιβ;而经PIP(80ymol/L)预处理的细胞，其E-Ιβ释放水平受到抑制(有文献表 明，IL-W的释放总是伴随着细胞死亡，但释放机制尚不清楚）。
[0046] 实施例5
[0047] 小鼠 BMDM细胞，细胞培养方法同实施例2。细胞用DMEM完全培养基种于6孔板，待细 胞进入对数生长期，经含不同浓度胡椒碱(40、80、160ym 〇l/L)的DMEM完全培养基(2ml/孔） 预处理4h;再加入20μ1 LPS溶液（工作液浓度50μg/ml，使其终浓度达到500ng/ml)处理4h; 最后将培养基替换为含〇. 1 %FCS和3mmol/L ATP的DMEM培养基（1.2ml)处理0.5h。细胞经上 述处理后，Western blotting方法检测其焦亡相关蛋白或信号分子的表达。从图6可知，细 胞经LPS+ATP(图中的第三泳道)处理后，激活caspase-Ι(左图，上清），上调pro-IL-Ιβ的表 达(右图，细胞裂解液）；经PIP预处理的细胞，可抑制LPS+ATP上调的caspase-Ι激活（左、右 图），以及上清中成熟IL-1邱勺释放(左图）。
[0048] 实施例6
[0049] (1)细菌培养
[0050] E.coli DH5a在Luria Broth(LB)培养基中摇菌过夜(37°C)，次日按10%菌液在新 鲜培养基中继续摇菌扩增3h(37°C)。扩增后的菌液在1824Xg离心力下离心10分钟，PBS洗 涤后，重悬于PBS溶液备用。细菌密度用微量紫外分光光度计（Nanodrop 2000; Thermo Scientific)测定;对应的菌落形成单位(colony forming units，CFU)由传统LB琼脂糖平 板涂布培养确定。
[0051 ] (2)动物实验
[0052] C57BL/6小鼠（购自南方医科大学实验动物中心），在本实验室适应性养殖一周后， 按20mg/kg体重胡椒碱灌胃3天(每天一次）后，腹腔接种E. coli细菌（2 X 109CFU/只）。细菌 感染后8h，处死小鼠，解剖，用4%中性甲醛溶液固定肝脏、大肠等重要脏器，脱水后石蜡包 埋，组织化学方法(HE染色)检测器官损伤情况。
[0053] (3)实验结果：
[0054] 显微镜下观察组织切片，可观察到：细菌感染引起器官损伤(坏死区）和炎症细胞 浸润，而"胡椒碱+细菌"处理组则上述症状显著减轻。说明胡椒碱可有效缓解细菌感染引起 的多脏器损伤。图7显示各组动物肝脏组织切片(Η.E.染色，20X物镜）。
[0055]上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的 限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化， 均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 胡椒碱在制备抗细胞焦亡和多脏器损伤药物中的应用。2. 根据权利要求1所述的胡椒碱在制备抗细胞焦亡和多脏器损伤药物中的应用，其特 征在于:所述的胡椒碱通过抑制促炎症因子IL-Ιβ和危险信号分子HMGB1的释放进而抑制细 胞焦亡。3. 根据权利要求1所述的胡椒碱在制备抗细胞焦亡和多脏器损伤药物中的应用，其特 征在于:所述的抗细胞焦亡和多脏器损伤的药物包含可接受的辅料。4. 根据权利要求3所述的胡椒碱在制备抗细胞焦亡和多脏器损伤药物中的应用，其特 征在于:所述的辅料为缓释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、吸附 载体、表面活性剂或润滑剂。5. 根据权利要求3所述的胡椒碱在制备抗细胞焦亡和多脏器损伤药物中的应用，其特 征在于:所述的抗细胞焦亡和多脏器损伤的药物还包含其他起配伍协同作用的有效成分。6. 根据权利要求1~5任一项所述的胡椒碱在制备抗细胞焦亡和多脏器损伤药物中的 应用，其特征在于:所述的抗细胞焦亡和多脏器损伤的药物的剂型为片剂、颗粒剂、胶囊、滴 丸、缓释剂、口服液或注射剂。
【文档编号】A61P31/04GK106038563SQ201610427621
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年6月16日
【发明人】欧阳东云, 何贤辉, 梁译丹, 徐丽慧, 李陈广, 魏红霞, 潘浩
【申请人】暨南大学