一种检测血浆炎性细胞因子自身抗体的组合物、试剂盒与方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于免疫学技术领域，设及四种肤类抗原，可应用于制备酶联免疫吸附法 (enzyme-linkedimmunosorbentassay,E1LISA)抗体检测试剂盒，用W检测血浆中炎性细 胞因子自身抗体（inflammatoiTcytokineautoantibodies,ICA)的浓度。
【背景技术】
[0002] 炎症是人类及动物体内产生的一种防御性反应。其目的主要是清除侵入体内的各 种病原微生物、非生物分子颗粒W及受到损伤和发生坏死的组织细胞。在临床上，炎症反应 具有五大特点：红、肿、热、痛和机能障碍。然而，长期持续的慢性炎症反应会造成机体内组 织和细胞损伤导致多种常见疾病的发生。例如，牙周炎、脉管炎、类风湿性关节炎、前列腺 炎、动脉粥样硬化、炎性肠道疾病、自身免疫性疾病、肿瘤、肥胖症、糖尿病、老年性痴呆及多 种神经精神性疾病等。从免疫学角度来看，机体对炎症细胞因子的反应可能与相对应抗体 的血浆水平相关。但现有技术中尚无可定量检测人血浆炎症细胞因子自然抗体的手段，因 而开发一种测定特定炎症细胞因子相对应的多克隆自然抗体血浆浓度的检测手段意义重 大。该既可利用流行病学统计方法确定人群中相应血浆抗体浓度的阳性或阴性阔值，也可 W针对特定个体进行抗体血浆浓度水平变化的跟踪监测，进而对研究不同个体的抗体水平 自然分布态势，或评估特定个体炎症相关疾病发生与发展都具有重要价值。相关检测结果 有可能成为进一步研究如何有效地控制炎症反应相关疾病的一个基础参数，该将有利于预 防各种炎症相关疾病的发生与发展。
[0003] 刺激炎症反应的因素有多种，包括生物因素、物理因素和化学因素等。炎症反应 的发生过程又设及多种免疫细胞、细胞因子及微血管的参与。尽管炎症反应病理生理机 制极为复杂，如能控制其中某些重要环节，就可有效地防止慢性炎症反应对机体造成的损 伤。目前研究较多的领域是炎性细胞因子，主要包括白细胞介素1(interleukinla和P， IL1-a和IL1-0),白细胞介素6(interleukin6,IL6)和肿瘤坏死因子（tumornecrosis 化ctora，TNF-a)。该些炎性细胞因子几乎参与所有炎症反应过程，且与多种疾病的发生 密切相关。大量研究报道表明，炎性细胞因子可随年龄而持续性增高，参与某些老年性疾病 的发生与发展，如老年性痴呆、骨质酥松及缺血性屯、脑血管疾病等，但导致炎性细胞因子随 年龄增高的原因尚未完全阐明。
[0004] 目前，临床已广泛应用抗炎性细胞因子的单克隆抗体药物治疗类风湿性关节炎。 其中包括抗肿瘤坏死因子的单克隆抗体-阿达木单抗（Adalimumab或Humira)和英利昔单 抗（Infliximab或Remicade)，抗白细胞介素-10单克隆抗体-卡那单抗（Canakinumab或 Ilaris)W及抗白细胞介素-6受体的单克隆抗体-托珠单抗（Actemra或Tocilizumab)。
【发明内容】
[0005] 本发明人发现，炎性细胞因子水平与其自身抗体水平成负相关，该一发现说明，炎 性细胞因子的自身抗体可能是机体内控制炎性细胞因子生理水平的重要因素。由于循环中 抗体水平相对稳定，检测血浆中炎性细胞因子自身抗体水平可预测炎症相关疾病的发病风 险。而且，血浆中炎性细胞因子自身抗体水平严重偏低或阴性者通过定期输入人丙种球蛋 白或炎性细胞因子自身抗体富集血浆可能具有预防炎症相关疾病的作用。
[0006] 根据上述发现，本发明的主要目的是提供一组用于检测人血浆中炎性细胞因子自 身抗体（inflammatoiTcytokineautoantibodies,ICA)浓度的线性抗原多肤和由此制备 的试剂盒，W及使用该组抗原多肤或该试剂盒检测人血浆中ICA的方法。所述抗原多肤为 ILl-a、IL1-0、IL6及TNF-a四种炎性细胞因子的抗原表位。该些抗原表位能够与人血 浆中针对IL1-a、IL1-0、IL6及TNF-a的自身抗体发生特异性结合。
[0007] 如本发明所定义的"炎性细胞因子自身抗体"或"ICA"是自然存在于人体内的，能 识别一种或多种炎性细胞因子抗原表位的多克隆抗体混合物，在本发明中，"炎性细胞因子 自身抗体"或"ICA"优选是能识别IL1-a、IL1-0、IL6及TNF-a四种炎性细胞因子抗原表 位的多种抗体（单克隆抗体和/或多克隆抗体）的混合物。在本发明的特定实施方案中， 所述"炎性细胞因子自身抗体"或"ICA"是指能识别选自SEQIDN0:l-4的一个或多个多 肤序列的抗体（单克隆抗体和/或多克隆抗体）的混合物。
[000引本发明人利用免疫信息学方法和计算机软件，在ILl-a、ILl-e、IL6及TNF-a蛋 白序列上进行人类白细胞二类抗原（HumanleukocyteantigenII,HLA-II)表位制图，甄 别具有高度亲和力的序列，进而设计能被绝大多数人类抗原提呈细胞识别的HLA-II限制 性表位及线性抗原多肤。
[0009] 已经公认，抗原抗体的结合主要发生在抗原决定簇（即抗原表位）与抗体结合位 点之间。因此，两者在空间结构和构型上越接近完全互补，抗原抗体的结合就越稳定，特异 性就越强，结合效率就越高，因此，目标抗体（待检测抗体）及其结合位点结构是先决因素， 抗原决定簇影响整个蛋白抗原与抗体结合状态和亲和特性。
[0010] 本发明根据ILl-a、ILl-e、IL6及TNF-a四种蛋白的生物学特性，针对该四种蛋 白的多个抗原表位进行免疫信息学预测和模拟，经分析与抗原性相关的各种参数，分别设 计了四种在空间结构和构型上与目标抗体完全互补的线性抗原表位多肤，其氨基酸序列见 表1。
[0011] 表1.检测人血浆中ICA的线性抗原表位多肤序列
[0012]
[0013] ILl-a分子的全长氨基酸序列（271氨基酸）及线性抗原多肤区域
[0014]
[002U 经固相化学法合成上述4种抗原多肤，等比（重量体积浓度比）混合后制备化ISA 抗体检测试剂盒，按设定的流程规范检测人血浆中ICA浓度。上述4种抗原多肤在实际 应用中可制备成简单易用的便捷试剂盒，W玻璃、医用塑料等非金属材料真空密封包装，4 度（4°C)环境下可保存6个月W上。简言之，用4种抗原多肤的混合液包被马来酷亚胺 (Maleimide)活化的96孔微量检测板，在45度（45°C)烤箱中干燥后，用非金属包装材料 真空密封包装，制成试剂盒。优选地，4种合成抗原多肤均为纯度>95%的制品。
[002引因此，根据本发明之一，提供了一种用于检测ICA的组合物，其中包含如下4种抗 原多肤：
[OOU] H-LLFFWET服TKNYFTSVAHPNLFIATK孤YWV化AGGP-0H
[0024] H-LNCTL畑SQQKSLVMSGPYELKALHLQGQDMEQQVVF-OH [00巧]H-TCLVKIITG化邸EVYLE化QNR阳SS邸QARAVQM-OH
[0026]H-LIYSQVLFKGQGCPSTHV化THTISRIAVSYQTKVNLLS-OH。
[0027] 在一些实施方案中，所述4种抗原多肤为高纯度制品，优选为纯度>95%的化学合 成制品。
[002引在一些实施方案中，所述组合物中4种抗原多肤的比例为1:1:1:1 (重量体积浓度 比）。根据本发明的另一个方面，提供一种包含上述组合物的试剂盒。
[0029] 在一些实施方案中，所述试剂盒是用上述4种抗原多肤的混合液包被马来酷亚胺 (Maleimide)活化的96孔微量检测板，干燥后用非金属医用包装材料真空密封包装而制 得。
[0030] 在另一些优选的实施方案中，所述非金属医用包装材料为玻璃或医用塑料。
[0031] 在另一些实施方案中，所述试剂盒还包括阳性对照和/或阴性对照。
[0032] 根据本发明的另一个方面，提供一种使用上述组合物或上述试剂盒检测待测样品 中ICA浓度的方法，包括使所述组合物与待测样品中的ICA之间发生抗原抗体反应，并确定 待测样品中的ICA水平。优选所述方法是在体外进行的，并且是非诊断目的的。
[0033] 在一些实施方案中，所述方法包括将上述组合物中的4种抗原多肤等比混合，然 后通过抗原抗体结合反应检测待测样品中的ICA水平。
[0034] 利用抗原多肤通过抗原抗体结合反应检测或确定待测样品中的抗体水平的技术 在本领域是众所周知的，例如酶联免疫吸附测定巧LISA)方法。在优选的实施方案中，在上 述方法中通过酶联免疫吸附测定巧LISA)方法检测或确定待测样品中的ICA水平。
[0035] 在更优选的实施方案中，所述酶联免疫吸附测定为夹屯、法化ISA。
[0036] 在更优选的实施方案中，将上述组合物中的4种抗原多肤等浓度比混合后，包被 马来酷亚胺（Maleimide)活化的96孔微量检测板，放置4度过夜解育，洗板，再对待测样品 进行检测分析。
[0037] 在更优选的实施方案中，所述对待测样品进行检测包括分步加样分析，所述分步 加样分析包括将待测样品设双复孔，同时设4个阴性对照孔和4个阳性对照孔，用分析 液将待测血浆稀释，并稀释辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG抗体，洗板，每孔加100y1 3, 3'，5, 5'-四甲基联苯胺（TMB)及过氧化物酶混合液，室温避光20~30分钟，每孔添加 50y1终止液12%硫酸溶液（12%H2SO4)，然后用酶标仪检测光密度（0D)值，检测波长为 450nm，参考波长为630nm。
[003引在更优选的实施方案中，所述待测样品为个体血浆。
[0039] 在更优选的实施方案中，所述方法的具体操作步骤为：
[0040]1、操作前，每种抗原用67 %己酸溶解为5毫克/ml储存液，然后等体积混合并放 置-20°C(误差在±2°C范围内）冰箱中保存。
[0041] 2、操作开始时，首先将表1中所列4种抗原多肤的混合液用包被液稀释为10~50 微克/ml的工作液，该包被液为含0. 15M氯化钢和lOmM邸TA的0. 1M磯酸盐缓冲液，抑值 为7.0~7. 4之间。
[0042]3、用工作液包被马来酷亚胺（Maieimide)活化的96孔微量检测板（Thermo Scientific,美国），4°C过夜解育后，用洗液洗板3遍，所述洗液为含0. 15M氯化钢和0. 1% TWEEN-20的0. 1M磯酸盐缓冲液，抑值为7. 0~7. 4之间。
[0043] 4、然后按一下步骤分步加样和分析：
[0044]a、待测血浆样品设双复孔，另设4个阴性对照（NC)孔（参照物为不含抗IL1-a 抗体、抗IL1- 0抗体、抗IL6抗体和抗TNF-a抗体的阴性对照液，如牛血清白蛋白 (Sigma-Al化ich公司提供），藉此可反映表1所述的4种多肤抗原在ICA阴性反应体系中 的实验指标值）和4个阳性对照（PC)孔（参照物为人抗ILl-a抗体、人抗IL1-0抗体、 人抗IL