一种鸡mda5基因启动子及其应用
【专利说明】-种鸡MDA5基因启动子及其应用
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技术领域
[0002] 本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种鸡天然免疫相关基因 MDA5启动子 区域的分离鉴定及其应用。
【背景技术】
[0003] 天然免疫又称非特异性免疫或者固有免疫，主要通过天然免疫分子和细胞来具体 实现对病原体的清除和杀灭。宿主细胞通过对病原体的识别，激活一系列的下游级联反应， 最终导致I型干扰素、促炎症细胞因子、趋化因子等的产生从而抑制病原体的复制、抵抗感 染并清除病原体。天然免疫对于病原的识别依赖的是病原分子模式识别受体（PRR)。
[0004] 黑素瘤差异化相关基因 5 (Melanoma Differentiation-Associated protein 5， MDA5,又称Helicard、IFIH1)是胞质内病原分子模式识别受体，维甲酸诱导基因 I样受体 家族（RLRs)，包括维甲酸诱导基因蛋白 I (retinoic acid-inducible gene I，RIG-I);遗 传学和生理学实验室蛋白2(laboratory of genetics and physiology 2，LGP2)的重要成 员之一，其激活的信号转导途径对机体启动抗病毒天然免疫发挥着重作用。MDA5是DexD/H RNA解旋酶。N端包括2个串联重复的半胱天冬酶募集结构域即CARD(Caspase activation and recruitment domain)域，中间为DExD/H 解旋酶区（DExD/H helicases)，C端是无活 性的抑制域（repressor domain，RD)。其解旋酶结构域介导双链RNA的识别，而CARD结构 域能够招募下游信号分子从而活化干扰素调节因子3 (Interferon regulatory Factor 3， IRF3)和核转录因子 NF-κ B (nuclear transcription factor-κ B，NF-κ B，NF_kB)〇
[0005] 在哺乳动物中，MDA5和RIG-I是RIG-I样解旋酶家族中进化保守的成员，在机体 对抗外源RNA病毒感染的过程中起重要的作用。然而，鸡中缺少RIG-I，因此关于MDA5对 病毒的识别，自身的激活以及受到的调控的研宄就显得尤为重要，例如解释为何鸡对某些 特定的流感病毒有抵抗力，却对另一些毒株具有高易感性，进而找到增强鸡抗病毒能力的 方法。
[0006] 启动子是目的基因的开关，控制基因的表达，因此研宄一个基因启动子的影响和 调控因素，是明白这个基因作用机制及调节因素的一个重要环节，因此对于一个基因研宄 其启动子的区间及特性就显得尤为重要。
[0007] 研宄显示，在正常情况下，机体MDA5只有基础水平少量表达，当病毒入侵后，MDA5 的表达会大量上调。目前对RIG-I的调控机制研宄较多，对MDA5的调控机制尚不清楚，对 鸡MDA5基因的启动子的研宄未见报道。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的是研宄鸡抗病毒能力，增强鸡的免疫力。提供一种鸡MDA5基因启动 子，所述的MDA5基因启动子序列如序列表SEQ ID NO :3所示。利用NCBI数据库查找鸡黑 色素瘤差异化相关基因 MDA5的上游调控序列，预测MDA5启动子的大概区域。设计如序列表 SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2所示的引物片段，以白羽鸡基因组DNA为模板，PCR扩增其天然 免疫的启动子区域，扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定并用天根回收试剂盒纯化回收，将 片段连接在PMD19-T载体上并将扩增到的启动子序列SEQ ID N0:3片段命名为MDA5-pro， 其片段长度为2487b。
[0009] 将连接在PMD19-T载体上的MDA5启动子作为模板，设计引物进行PCR扩增，引进 Pci I和BamH I两个切酶位点，扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定并用天根回收试剂盒纯 化回收后，用全式金的pEASY-Tl Cloning Kit试剂盒，将其连接在pEASY-Tl载体上，获得 MDA5基因启动子转染载体。Pci I和BamH I两个切酶位点的酶切体系是： 试剂 体积（（Volume/ μ 1)) Buffer 5 目的片段DNA/载体DNA 12/4 Pci I 1 BamH I 1 CldH2O 31/39 总量 50 ; 所述的酶切条件是37°C，时间为5-6小时。
[0010] 一种鸡MDA5基因启动子的应用，所述的MDA5基因启动子用于启动鸡表达目的基 因。
[0011] 以上所述的MDA5基因启动子还可应用于在受到病毒、干扰素 、Poly I:C和IBDV刺 激后能驱动目的基因表达。
[0012] 从白羽鸡的基因组中分离并鉴定出MDA5基因的启动子序列。克隆鸡MDA5基因5' 侧翼2483bp序列，利用TESS和TFSEARCH等在线软件分析，发现该片段含有启动子的特征 元件TATA box和多个转录结合因子结合位点，如C/EBP、GATA、NF-El、c-Rel、AP-l和c-Jun 等。构建含有MDA5基因启动子的PB-MDA5-DsRed的报告质粒，转染鸡胚胎成纤维细胞（DF-1 细胞），通过流式细胞仪和RT-QPCR的方法分析转染后的细胞在受到刺激时红色荧光蛋白 的相对表达量，来确定启动子的活性，进而确定鸡细胞或机体对刺激物的敏感性。
[0013] 本发明优点是：本发明验证了鸡MDA5基因启动子在细胞中启动基因表达的能力， 验证了不同的刺激物对启动子表达的调控，为MDA5基因的表达调控带来了更深层次的认 知。
[0014] 本发明中构建的启动子表达载体，能够持续表达绿色荧光蛋白，受调控表达红色 荧光蛋白，便于筛选，且利于观察鉴定启动子活性，以方便验证和预测病毒等外源抗原对鸡 细胞和机体的危害性。
【附图说明】
[0015] 图1重组质粒构建流程图。
[0016] 图2重组质粒载体的双酶切鉴定图3号泳道为DNA Marker，2号泳道为重组质粒 PB-MDA5-DsRed双酶切结果，1号泳道为重组质粒PB-MDA5-DsRed单酶切结果。
[0017] 图3稳定转染重组质粒DF-I细胞图。
[0018] 图4携带重组质粒的稳定转染细胞株DF-I-PMD经药物处理24 h后，荧光显微镜 观察IFN 24h结果(其中A、B、C为对照组，C、D、E为处理组)。
[0019] 图5携带重组质粒的稳定转染细胞株DF-I-PMD经药物处理24 h后，荧光显微镜 观察P〇ly(I:C) 24 h结果(其中A、B、C为对照组，C、D、E为处理组)。
[0020] 图6携带重组质粒的稳定转染细胞株DF-I-PMD经药物处理24 h后，荧光显微镜 观察NDV 24 h结果(其中A、B、C为对照组，C、D、E为处理组)。
[0021] 图7携带重组质粒的稳定转染细胞株DF-I-PMD经药物处理72 h后，荧光显微镜 观察IBDV 72 h结果(其中A、B、C为对照组，C、D、E为处理组)。
[0022]
【具体实施方式】
[0023] 在下述描述中，具体描述了本发明鸡MDA5基因启动子的克隆方法、鉴定方法和表 达方法。
[0024] 实施例1 :鸡黑素瘤差异化相关基因5 (MDA5)启动子片段及相应获得 NCBI数据库（http://www. ncbi. nlm. nih. gov)查找鸡黑色素瘤差异化相关基因 MDA5 的上游调控序列，预测MDA5启动子的大概区域，以此序列作为研宄对象。设计引物(该引物 序列见表1所示)，以白羽鸡基因组DNA为模板，PCR扩增MDA5的启动子区域，扩增产物经 1%琼脂糖凝胶电泳鉴定并用天根回收试剂盒纯化回收，将片段连接在PMD19-T (Takara)载 体上，送英俊公司测序。得到的启动子序列如SEQ ID NO :3所示。
[0025] 表1 MDA5的启动子片段的扩增引物
实施例2 :鸡黑素瘤差异化相关基因5 (MDA5)启动子转染载体的构建 将连接在PMD19-T载体上的MDA5启动子作为模板，设计引物进行PCR扩增，引进Pci I 和BamH I两个切酶位点，引物序列如表2所示。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定并 用天根回收试剂盒纯化回收后，用全式金的pEASY-Tl Cloning Kit试剂盒，将其连接在 pEASY-Tl载体