专利名称：利用A3启动子缺陷piggyBac转座子创制转基因家蚕方法
技术领域：
本发明涉及一种利用A3启动子缺陷p&gyBac转座子创制转基因家蚕方法。
背景技术：
家蚕是重要的模式昆虫，其基因组测序的完成为在基因水平开展研究提供 了基础。转座子介导的转基因家蚕研究技术的日渐成熟更是为家蚕的 基因研究开辟了更为广阔的研究空间。Tamum等构建的带有A3启动子并以 EGFP为标记基因的p/^yBac转座子已能成功的在家蚕转入和表达。Zhong等的 研究表明对于不同品种的家蚕其转入效率也有不同，Nistari品系具有较高的转 导率。启动子缺陷转基因系统对于筛选组织特异性启动子和研究基因的表达调 控具有重要的意义，但在家蚕研究中还没有启动子缺陷的转座子，也没有利用 启动子缺陷转基因系统筛选组织特异性启动子及研究基因功能的报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用A3启动子缺陷/7/ggvBac转座子创制转基因 家蚕方法，是先切除带有荧光标志基因的p/ggyBac转座子中A3启动子，利用 转基因技术将这种启动子缺陷转座子插入家蚕功能基因的启动子后面，借助功 能基因启动子的作用表达荧光标志基因，创制成一种转基因家蚕，这种转基因 家蚕能够用于组织特异性表达启动子的筛选和基因功能研究，达到育成具有特 异性功能家蚕新品种。
为了达到上述目的，本发明采用的技术方案的步骤如下
(1) 采用BglII和BamHI双酶切，切去带有荧光标志基因的p'ggyBac质粒 中长度为853 bp的A3启动子，回收大片段7124bp，自连接得到A3启动子缺 陷的jw'ggyBac质粒；
(2) 采用蚕卵显微注射转基因方法，导入A3启动子缺陷的戸'ggyBac质粒 及其能够提供转座酶的辅助质粒，在G0代或G0以后代蚁蚕时期，通过选择荧 光标志基因获得转基因家蚕，词养至成虫交配续代；
(3) 育成能够用于组织特异性表达启动子的筛选和基因功能研究的转基因家蚕。
所述的荧光标志基因是指含有GFP、 EGFP、 RFP、 CFP或YFP荧光标志基因。
所述的蚕卵显微注射的时间是产卵后8小时以内，^ggvBac质粒及其能够 提供转座酶的辅助质粒的比率在10:1 — 1:2之间，这2种质粒的总浓度在0.1ng/pl 一2iig"l，质粒溶解在0.1mM—2mM含有lmM—8mM氯化钠的磷酸缓冲液中。
本发明具有的有益效果是
可以借助荧光标志基因筛选转基因家蚕个体，这种转基因家蚕能够用于组 织特异性表达启动子的筛选和基因功能研究，达到育成具有特异性功能家蚕新 品种。
图1是A3启动子缺陷转座质粒构建示意图。 图2是能够提供转座酶的辅助质粒。 图3是A3启动子缺陷转座质粒的酶切鉴定电泳图。 图4是Gl代近尾足部组织特异性表达GFP的转基因家蚕。 图5是Gl代胸部组织特异性表达EGFP的转基因家蚕。 图6是Gl代尾部组织特异性表达EGFP的转基因家蚕。
具体实施例方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。 实施例l:
根据pPIGA3GFP (7977bp)质粒图谱，用BglII和BamHI双酶切，切去长 度为853 bp的A3启动子，回收大片段7124bp，自连接得到如图1所示的A3 启动子缺陷的带有GFP荧光标志基因的j9&gyBac质粒，图中，A表示的是携带 A3启动子的质粒；B表示的是去掉A3启动子的质粒；完成后分别用Pstl ， EcoR I +Hpa I和BglII+BamH I酶切鉴定重组质粒，A3启动子被完全切去，产 物与质粒结构相符合(如图3所示)，且经改造的质粒缺失了 BglII+BamH I酶 切位点(如图3所示，泳道3)。
图3中，泳道l-3表示的是pPIGGFP质粒其中，泳道l， Pstl酶切；泳 道2， EcoRl+Hpal酶切；泳道3， Bgl II十BamH I酶切。泳道4-6表示的是 pPIGA3GFP质粒其中，泳道4， Pstl酶切；泳道5， EcoR I+Hpa I酶切；泳 道6， BglII+BamHl酶切。Marker为分子标记，单位为bp，从上而下的条带为: 10000, 7500， 5000, 2500, 1000, 250。
采用蚕卵显微注射方法，将携带GFP标志基因的A3启动子缺陷的p&gvBac 质粒及其能够提供转座酶的辅助质粒(图2)按1:1比率混合，2种质粒的总浓 度在0.4(ig/pl，质粒溶解在0.5mM含有5mM氯化钠的磷酸缓冲液中，导入产卵
2小时内的蚕卵。在转基因实验的第2代(Gl)家蚕的蚁蚕时期，通过荧光显 微镜(Olympus， SZX12，日本)筛选表达GFP标志基因的转基因家蚕，激发波 长为460nm-490nm，发射波长为510 nm -550 nm。转基因家蚕饲养至成虫交配 产卵。
转基因实验一共注射了 2264粒卵，Gl代中有14蛾蚕为转基因家蚕。在检 出的G1代转基因家蚕个体中，GFP有在近尾足部表达、呈斑块状不均匀性的个 体(如图4所示)，而且经比较表明，表达的亮度比A3启动子控制的荧光亮度弱。
采用PCR技术证实了 GFP标记基因的成功转入。实验结果证明利用A3启 动子缺陷^ggvBac转座子己获得能够表达GFP荧光标志基因的转基因家蚕。
实施例2:
A3启动子缺陷的p&gyBac质粒的构建方法与实施例1类似，用EGFP荧光 标志基因替换GFP标志基因。
采用蚕卵显微注射方法，将携带EGFP标志基因的A3启动子缺陷的 p/ggvBac质粒及其能够提供转座酶的辅助质粒按2:l比率混合，2种质粒的总浓 度在0.5Mg/jLd，质粒溶解在0.3mM含有3mM氯化钠的磷酸缓冲液中，导入产卵 6小时内的蚕卵。在转基因实验的第2代(Gl)家蚕的蚁蚕时期，通过荧光显 微镜(Olympus， SZX12，日本)筛选表达EGFP标志基因的转基因家蚕，激发 波长为460nm-490nm，发射波长为510 nm-550 nm。转基因家蚕伺养至成虫交 配产卵。
在检出的G1代转基因家蚕个体中，EGFP有在胸部表达，呈斑块状不均匀 性的个体(如图5所示)，而且经比较表明，表达的亮度比A3启动子控制的荧 光亮度弱。采用PCR技术证实了 EGFP标记基因的成功转入。实验结果证明利 用A3启动子缺陷p&gyBac转座子已获得能够表达EGFP荧光标志基因的转基 因家蚕。
实施例3:
A3启动子缺陷的/7&gyBac质粒的构建方法与实施例1类似，用EGFP荧光 标志基因替换GFP标志基因。
采用蚕卵显微注射方法，将携带EGFP标志基因的A3启动子缺陷的 p^gyBac质粒及其能够提供转座酶的辅助质粒按3d比率混合，2种质粒的总浓 度在0.3jag"l，质粒溶解在0.8mM含有5mM氯化钠的磷酸缓冲液中，导入产卵 8小时内的蚕卵。在转基因实验的第2代(Gl)家蚕的蚁蚕时期，通过荧光显
微镜(Olympus, SZX9，日本)筛选表达EGFP标志基因的转基因家蚕， 激发波长为460nm-490nm，发射波长为510 nm-550 nm。转基因家蚕饲养至成 虫交配产卵。
在检出的G1代转基因家蚕个体中，EGFP有在尾部表达的个体(如图6所 示)，而且经比较表明，表达的亮度比A3启动子控制的荧光亮度弱。采用PCR 技术证实了 GFP标记基因的成功转入。实验结果证明利用A3启动子缺陷 /7&gyBac转座子已获得能够表达EGFP荧光标志基因的转基因家蚕。
权利要求
1.一种利用A3启动子缺陷piggyBac转座子创制转基因家蚕方法，其特征在于该方法的步骤如下(1)采用BglII和BamHI双酶切，切去带有荧光标志基因的piggyBac质粒中长度为853bp的A3启动子，回收大片段7124bp，自连接得到A3启动子缺陷的piggyBac质粒；(2)采用蚕卵显微注射转基因方法，导入A3启动子缺陷的piggyBac质粒及其能够提供转座酶的辅助质粒，在G0代或G0以后代蚁蚕时期，通过选择荧光标志基因获得转基因家蚕，饲养至成虫交配续代；(3)育成能够用于组织特异性表达启动子的筛选和基因功能研究的转基因家蚕。
2. 根据权利要求1所述的一种利用A3启动子缺陷/ /ggyBac转座子创制转基 因家蚕方法，其特征在于所述的荧光标志基因是指含有GFP、 EGFP、 RFP、 CFP或YFP荧光标志基因。
3. 根据权利要求1所述的一种利用A3启动子缺陷p/ggyBac转座子创制转基 因家蚕方法，其特征在于所述的蚕卵显微注射的时间是产卵后8小时以内， p/ggyBac质粒及其能够提供转座酶的辅助质粒的比率在10:1 — 1:2之间，这2种 质粒的总浓度在0.1叫/|^1一2吗/^11，质粒溶解在0.1mM—2mM含有lmM—8mM 氯化钠的磷酸缓冲液中。
全文摘要
本发明公开了一种利用A3启动子缺陷piggyBac转座子创制转基因家蚕方法。是先切除带有荧光标志基因的piggyBac转座子中A3启动子，利用转基因技术将这种启动子缺陷转座子插入家蚕功能基因的启动子后面，借助功能基因启动子的作用表达荧光标志基因，创制成一种转基因家蚕，这种转基因家蚕能够用于组织特异性表达启动子的筛选和基因功能研究，达到育成具有特异性功能家蚕新品种。
文档编号C12N15/87GK101177692SQ20071016447
公开日2008年5月14日 申请日期2007年12月5日 优先权日2007年12月5日
发明者农 丁, 兰天云, 庄兰芳, 杨惠娟, 伟 范, 钟伯雄, 陆长德 申请人:浙江大学