专利名称：中药白术聚合酶链反应鉴定引物及鉴定方法
技术领域：
本发明涉及中药鉴定的技术领域，尤其涉及一种用于鉴定中药白术的引物 及其鉴定方法。 技术背景白术"z^acz^ZoflfesfflacrocepAa^aKoidz)是著名中药材"浙八味"之一， 有补脾益气，燥湿利水，固表止汗等功效，是目前中草药市场上使用较多的一种(8-川)随着中药现代化步伐的加快，中药的标准化已成为中药产业发展和打入国 际市场的瓶颈。药用植物的发展离不开标准化生产，即目前大力推行的GAP(Good agriculturing Practice,中药材生产质量管理规范)工作的核心。而物种的 鉴定方法是质量标准控制和管理的前提。随着分子生物学、分子遗传学和现代 化学分析技术的快速发展，使药材的科学鉴定成为可能7)。然而，利用形态及理化方法对药材进行鉴定需要丰富的经验，且结果不够 可靠，尤其是破碎或粉末状态的药材则更难鉴别，而基于植物DNA序列的分子 遗传标记技术适合于物种的鉴别，因此可以建立一种分子遗传标记技术对白术 进行鉴定。目前，分子遗传标记在动植物品种鉴定方面已得到广泛应用。在药材鉴定 方面，已建立了鉴别性聚合酶链反应(PCR)技术，并已成功地用于龟甲、鹿类 等中药的鉴别。但这种方法不是对所有的中药都有统一的方法和引物，对不同 的中药材，其鉴定方法、引物都有不同。 参考文献1) Cao H. ， Liu Y.P. ， 1998. Applications of molecular markers in the detection of herbal medicine. Chin. Pharm. J. 33(5): 269-273.2) Fu， R. Z. et al. ， 2000. RAPD differentiation of five medicinal Dysosma species. Chin. Pharm. J. 9(2), 57-60.3) Braurmer et al 1992 rDNA and RAPD variation in the rare plant family Lactoridaceae. Amer丄Bot. 79:1436-1439.4) Elizabeth et al., 2003 2003. Development of species-specific SCAR markers in Bentgrass. Crop Sci. 43:345 - 349.5) Bandana, D. ， Mahipal.， S. ， 2003. Molecular detection of cashew husk (Anacardium occidentale) adulteration in market samples of dry tea (Camellia sinensis). Planta Med. 69:882-884.6) Elizabeth, A. S. ， Michael, D. C. ， Geunhwa， J". ， 2003. Development of species—specific SCAR markers in Bentgrass. Crop Sci. 43:345 - 349.7) Hosokawa， Keizo et al.， 2004. The Sequences of the Spacer Region between the atpF and atpA Genes in the Plastid Genome Allows Discrimination among Three Varieties of Medicinal Angelica, Planta Med S)刘国声.1980，白术根茎挥发油的化学成分.植物学报，22 (4): 2959) 陈仲良.1989，中药白术的化学成分II.白术三醇的a-甲基丁酰衍生物.化 学学报，47: 102210) 李金兰等.1996,白术本草研究.药学实践杂志，14(4) :220.11) 林强等.1997，白术挥发油成分的分析.华西药学杂志，12 (2): 119 发明内容本发明的目的是提供--种对白术药材能准确鉴别其真伪的中药白术鉴别性 聚合酶链反应鉴定引物及其鉴定方法。用于鉴定中药白术的引物鉴定引物DNA序列为引物ccl: 5'-accaaattccattctccc -3，；弓|物cc2: 5， - tatgtccataatacacaa -3，， 用全 自动DNA合成仪按上述鉴定引物的DNA序列进行合成，即得到鉴定引物的白色 粉末结晶。中药白术的鉴定方法包括如下步骤-1) 药材DNA提取采用改良CTAB法提取药材DNA;2) 鉴别性PCR:将鉴定引物的白色粉末结晶用无离子水溶解并稀释至 5umol/L，得到引物ccl和引物cc2溶液，按照下面表格将各反应物品加入PCR反应管中，得到反应混合液；组 分 终浓度10 X Buffer (Mg2+free) 2.5ulMgCl2 2.0 2.5uldNTPs 0.5ul引物ccl、引物cc2各 l.OulTaq酶(5U / nl ) 0.25ul共试品DNA模板(20 ng / pi) 2.0 2.5ul双蒸水 加至25ul3) PCR循环将反应混合液放入PCR仪中，按下述程序进行PCR反应 步骤一在94。C下反应4到5分钟，步骤二在94。C下反应30至45秒，步骤三在61.5。C下反应30至45秒，步骤四在72。C下反应1至1.5分钟， 重复步骤二至步骤四三十至四十次，步骤五在72。C下反应7至IO分钟。4) 电泳观察取出PCR反应液5ul，加入加样缓冲液lul，用含有0.5%溴化乙锭的1.5%琼脂凝胶电泳，检测扩增结果，若有阳性扩增，则供试品为白术；若为阴性，即无扩增条带，则供试品不为白术。所述的改良CTAB法提取药材DNA的步骤为1) 取约0.05 0. l克的硅胶干燥叶片，置入磨样管中，用磨样机研磨，磨 样速度为4.0 5.0 rpm，磨样时间为20 40s，然后在磨样管中迅速加入65°C 预热的含2%3 -巯基乙醇的2XCTAB提取缓冲液800 1000ul，摇均匀后转入 5ml离心管中，再用800 1000ul 2XCTAB清洗磨样管，转入同一个5ml管中， 65。C水浴30 35分钟；2) 冷却至室温，加入等体积的氯仿/异戊醇混合液，氯仿和异戊醇的体积 比为24: 1，缓慢颠倒15 30分钟，混合均匀，离心10 15分钟，离心速度为 8000 10000rpm;3) 离心后，吸取上层水相，加入1A0体积的IOXCTAB，轻轻混匀，再加 入等体积的氯仿/异戊醇混合液，氯仿和异戊醇的体积比为24: 1，缓慢颠倒15 30分钟，混合均匀，离心10 15分钟，离心速度为8000 10000rpm;4) 离心后吸取上层水相，加入0.5体积的5MNaCl混匀，再加入等体积-20 "C预冷的异丙醇，轻轻摇匀，于-2(TC放置2 12小时；5) 离心10 15min，离心速度为10000 12000rpm，弃水相；6) 加75%乙醇浸洗2 3次，用无水乙醇清洗1 2次，去乙醇，风干，用 100 200 ul 0. 1XTE溶解DNA沉淀，-20 。C保存备用。本发明解决了中药白术的鉴定问题。我们在对白术的鉴别中，设计了鉴别 白术的一对高特异性引物，该鉴定引物在给定的PCR条件下，能将白术鉴定出 来。当供试样品用本鉴定引物进行PCR扩增后，经琼脂糖凝胶电泳观察有无扩 增条带的出现，即可鉴定白术。用此对引物可以制造用于白术鉴别的反应试剂 盒。本发明对于中药生产、销售部门快速、准确地鉴定白术，搞好药材的质量 控制，是十分必要的，对各地市药检部门打击假冒伪劣，净化药材市场具有十 分重要的价值。
附图是采用引物ccl和引物cc2进行PCR扩增检测的电泳图(如图所示， 白术在分子量为700bp位置有清晰条带出现，而苍术在分子量为700bp位置没 有条带出现)；图中K:空白对照，M:分子量。
具体实施方式
首先从白术及其近缘种、混淆种的原植物中提取总DNA，用PCR方法扩增多 个基因片段并分别纯化，对各纯化片段进行DNA序列分析，建立白术及其近缘 种、混淆种的DNA序列数据库，在比较数据库的基础上，选择合适的D皿片段， 针对白术特有的片段，设计一对用于鉴定中药白术的引物鉴定引物DNA序列 为弓i物 ccl : 5， - accaaattccattctccc -3，； 弓|物 cc2 : 5，-tatgtccataatacacaa -3，，用全自动DNA合成仪按上述鉴定引物的DNA序列进 行合成，即得到鉴定引物的白色粉末结晶。采用上述引物对中药白术进行鉴别，鉴定方法包括如下步骤1) 药材DNA提取采用改良CTAB法提取药材DNA;2) 鉴别性PCR:将鉴定引物的白色粉末结晶用无离子水溶解并稀释至 5umol/L，得到引物ccl和引物cc2溶液，按照下面表格将各反应物品加入PCR得到反应混合液；组分终浓度10XBuffer (Mg2+free)2.5ulMgCl22.0 2. 5uldNTPs0.5ul引物ccl、引物cc2各l.OulTaq酶(5U/nl)0.25ul供试品DNA模板(20 ng / nl)2.0 2.5ul双蒸水加至25ul3) PCR循环将反应混合液放入PCR仪中，按下述程序进行PCR反应 步骤一在94。C下反应4到5分钟，步骤二在94。C下反应30至45秒，步骤三在61.5。C下反应30至45秒，步骤四在72。C下反应1至1.5分钟， 重复步骤二至步骤四三十至四十次，步骤五在72。C下反应7至10分钟。4) 电泳观察取出PCR反应液5ul，加入加样缓冲液lul，用含有0.5%溴化 乙锭的1.5%琼脂凝胶电泳，检测扩增结果，若有阳性扩增，则供试品为白术； 若为阴性，即无扩增条带，则供试品不为白术。所述的改良CTAB法提取药材DNA的步骤为1)取约0.05 0. 1克的硅胶干燥叶片，置入磨样管中，用型号为BI0101 的磨样机研磨，磨样速度为4. 0 5. 0 rpm,磨样时间为20 40s，然后在磨样管中迅速加入65。C预热的含2% P -巯基乙醇的2XCTAB提取缓冲液800 1000ul， 摇均匀后转入5ml离心管中，再用800 1000ul 2XCTAB清洗磨样管，转入同 一个5ml管中，65。C水浴30 35分钟；2) 冷却至室温，加入等体积的氯仿/异戊醇混合液，氯仿和异戊醇的体积 比为24: 1，缓慢颠倒15 30分钟，混合均匀，离心10 15分钟，离心速度为 8000 10000rpm;3) 离心后，吸取上层水相，加入1/10体积的IOXCTAB，轻轻混匀，再加 入加入等体积的氯仿/异戊醇混合液，氯仿和异戊醇的体积比为24: 1，缓慢颠 倒15 30分钟，混合均匀，离心10 15分钟，离心速度为8000 10000rpm;4) 离心后吸取上层水相，加入0.5体积的5MNaCl混匀，再加入等体积-20 。C预冷的异丙醇，轻轻摇匀，于-2(TC放置2 12小时；5) 离心10 15min，离心速度为10000 12000rpm，弃水相；6) 力B 75%乙醇浸洗2 3次，用无水乙醇清洗1 2次，去乙醇，风干，用 100 200 ul 0. 1XTE溶解DNA沉淀，-20 。C保存备用。实施例11) 药材DNA提取采用改良CTAB法提取药材DNA。(1) 取约0.05克的硅胶干燥叶片，置入磨样管中，用型号为BI0101的磨 样机研磨，磨样速度为4.0rpm，磨样时间为20s，然后在磨样管中迅速加入65 "C预热的含2%P -巯基乙醇的2XCTAB提取缓冲液800ul，摇均匀后转入5ml离 心管中，再用800ul 2XCTAB清洗磨样管，转入同一个5ml管中，65。C水浴30 分钟；(2) 冷却至室温，加入等体积的氯仿/异戊醇混合液，氯仿和异戊醇的体 积比为24: 1，缓慢颠倒15分钟，混合均匀，离心10分钟，离心速度为8000rpm;(3) 离心后，吸取上层水相，加入1/10体积的IOXCTAB，轻轻混匀，再 加入等体积的氯仿/异戊醇混合液，氯仿和异戊醇的体积比为24: 1，缓慢颠倒 15分钟，混合均匀，离心10分钟，离心速度为8000rpm;(4) 离心后吸取上层水相，加入0.5体积的5MNaCl混匀，再加入等体积 -2(TC预冷的异丙醇，轻轻摇匀，于-2(TC放置2小时；(5) 离心10min，离心速度为10000rpm，弃水相；(6) 加75%乙醇浸洗2次，用无水乙醇清洗1次，去乙醇，风干，用100 ul 0. 1XTE溶解DNA沉淀，-20 。C保存备用。2) 鉴别性PCR:将鉴定引物的白色粉末结晶用无离子水溶解并稀释至5umol/L，得到引物ccl和引物cc2溶液，然后在PCR反应管中依次加入双蒸水 15.25ul、 10XBuffer (Mg2+ free) 2. 5ul、 MgC12 2. 0ul、 dNTPs 0. 5ul、引物 ccl和引物cc2各1. 0ul、供试品DNA模板(20 ng / W ) 2. 5ul和Taq酶(5U / i4 ) 0. 25ul (所用的10XBuffer (Mg2+free)、 MgC12、 dNTPs0. 5ul、和Taq 酶(5U / W )均购买自匕海申能博彩生物科技有限公司)，得到反应混合液。3) PCR循环将反应混合液放入PCR仪中，94。C预变性4min，然后按下 列参数进入30个循环94。C变性30sec， 61. 5°C复性30sec， 72。C延伸lmin。 循环结束后在72°C保持7min。4) 电泳观察取出PCR反应液5ul，加入加样缓冲液lul，用含有0.5%溴化 乙锭的1.5%琼脂凝胶电泳，检测扩增结果，若有阳性扩增，则供试品为白术； 若为阴性，即无扩增条带，则供试品不为白术。实施例21) 药材DNA提取采用改良CTAB法提取药材DNA。(1) 取约0. 1克的硅胶干燥叶片，置入BIO101磨样管中，用型号为BI0101 的磨样机研磨，磨样速度为5.0 rpm，磨样时间为40s，然后在磨样管中迅速加 入65。C预热的含2%0 -巯基乙醇的2XCTAB提取缓冲液1000ul，摇均匀后转入 5ml离心管中，再用1000ul 2XCTAB清洗磨样管，转入同一个5ml管中，65°C 水浴35分钟；(2) 冷却至室温，加入等体积的氯仿/异戊醇混合液，氯仿和异戊醇的体 积比为24: 1，缓慢颠倒30分钟，混合均匀，离心15分钟，离心速度为10000rpm;(3) 离心后，吸取上层水相，加入1/10体积的IOXCTAB，轻轻混匀，再 加入等体积的氯仿/异戊醇混合液，氯仿和异戊醇的体积比为24: 1，缓慢颠倒 15 30分钟，混合均匀，离心15分钟，离心速度为10000rpm;(4) 离心后吸取上层水相，加入0.5体积的5MNaCl混匀，再加入等体积 -2(TC预冷的异丙醇，轻轻摇匀，于-2(TC放置12小时；(5) 离心15min，离心速度为12000rpm，弃水相；(6) 加75%乙醇浸洗3次，用无水乙醇清洗2次，去乙醇，风干，用200ul 0. 1X TE溶解DNA沉淀，-20 °C保存备用。2) 鉴别性PCR:将鉴定引物的白色粉末结晶用无离子水溶解并稀释至 5umol/L，得到引物ccl和引物cc2溶液，然后在PCR反应管中依次加入双蒸水 15.25ul、 10XBuffer (Mg2+ free) 2. 5ul、 MgC12 2. 5ul、 dNTPs 0. 5ul、引物 ccl和引物cc2各1. Oul、供试品DNA模板(20 ng / W ) 2. Oul和Taq酶(5U/ 14 ) 0. 25ul (所用的lOXBuffer (Mg2+ free)、 MgC12、 dNTPsO. 5ul、和Taq 酶(5U / W )均购买自上海申能博彩生物科技有限公司)，得到反应混合液。3) PCR循环将反应混合液放入PCR仪中，94。C预变性5min，然后按下 列参数进入40个循环94。C变性45sec， 61. 5。C复性45sec， 72。C延伸1. 5min。 循环结束后在72°C保持10min。4) 电泳观察取出PCR反应液5ul，加入加样缓冲液lul，用含有0. 5%溴化 乙锭的1.5%琼脂凝胶电泳，检测扩增结果，若有阳性扩增，则供试品为白术； 若为阴性，即无扩增条带，则供试品不为白术。
权利要求
1一种中药白术聚合酶链反应鉴定引物，其特征在于鉴定引物DNA序列为引物cc15’-accaaattccattctccc-3’；引物cc25’-tatgtccataatacacaa-3’，用全自动DNA合成仪按上述鉴定引物的DNA序列进行合成，即得到鉴定引物的白色粉末结晶。
2 —种使用如权利要求1所述引物的中药白术的鉴定方法，其特征在于包括 如下步骤-1) 药材DNA提取采用改良CTAB法提取药材DNA;2) 鉴别性PCR:将鉴定引物的白色粉末结晶用无离子水溶解并稀释至 5umol/L，得到引物ccl和引物cc2溶液，按照下面表格将各反应物品加入PCR反应管中，得到反应混合液；组 分 终浓度10XBuffer (Mg2+free) 2.5ulMgCl2 2.0 2. 5uldNTPs 0.5ul引物ccl、引物cc2各 l.OulTaq酶(5U / pi) 0.25ul供试品DNA模板(20 ng / nl) 2.0 2.5ul双蒸水 加至25ul3) PCR循环将反应混合液放入PCR仪中，按下述程序进行PCR反应 步骤一在94。C下反应4到5分钟，步骤二在94。C下反应30至45秒，步骤三在61.5。C下反应30至45秒，步骤四在72。C下反应1至1.5分钟， 重复步骤二至步骤四三十至四十次，步骤五在72。C下反应7至10分钟；4) 电泳观察取出PCR反应液5ul，加入加样缓冲液lul，用含有0. 5%溴化乙锭的1.5%琼脂凝胶电泳，检测扩增结果，若有阳性扩增，则供试品为白术；若为阴性，即无扩增条带，则供试品不为白术。
3.根据权利要求l所述的一种中药白术的鉴定方法，其特征在于所述的改 良CTAB法提取药材DNA的步骤为1)取约0.05 0. l克的硅胶干燥叶片，置入磨样管中，用磨样机研磨，磨 样速度为4.0 5.0 rpm,磨样时间为20 40s,然后在磨样管中迅速加入65°C预热的含2%P -巯基乙醇的2XCTAB提取缓冲液800 1000ul，摇均匀后转入 5ml离心管中，再用800 1000ul 2XCTAB清洗磨样管，转入同一个5ml管中， 65。C水浴30 35分钟； 2) 冷却至室温，加入等体积的氯仿/异戊醇混合液，氯仿和异戊醇的体积 比为24: 1，缓慢颠倒15 30分钟，混合均匀，离心10 15分钟，离心速度为 8000 10000rpm; 3) 离心后吸取上层水相，加入1/10体积的IOXCTAB，轻轻混匀，再加入 等体积的氯仿/异戊醇混合液，氯仿和异戊醇的体积比为24: 1，缓慢颠倒15 30分 钟，混合均匀，离心10 15分钟，离心速度为8000 10000rpm; 4) 离心后吸取上层水相，加入0.5体积的5MNaCl混匀，再加入等体积-20 "C预冷的异丙醇，轻轻摇匀，于-2(TC放置2 12小时； 5) 离心10 15min，离心速度为10000 12000rpm，弃水相； 6) 加75%乙醇浸洗2 3次，用无水乙醇清洗1 2次，去乙醇，风干，用 100 200 ul 0. 1XTE溶解DNA沉淀，-20 "保存备用。
全文摘要
本发明属于中药鉴定技术领域，是一种用于鉴定中药白术的引物及其鉴定方法。本发明设计的白术聚合酶链反应的鉴定引物DNA序列为引物cc15’-accaaattccattctccc-3’；引物cc25’-tatgtccataatacacaa-3’。鉴定方法为提取药材的总DNA；用本发明的一对鉴定引物进行PCR扩增，电泳检查扩增结果，若用鉴定引物得到阳性扩增，则供试品为白术，若无阳性扩增则供试品不为白术。本发明能够实现白术的快速、准确地鉴别。
文档编号C12Q1/68GK101230389SQ20071016447
公开日2008年7月30日 申请日期2007年12月5日 优先权日2007年12月5日
发明者傅承新, 刘逸慧, 周晓龙, 攀 李, 川 陈, 陈斌龙 申请人:浙江大学